CN117959251B - 重组人干扰素α1b滴眼液及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医用、牙科用或梳妆用的配制品技术领域，具体公开了一种重组人干扰素α1b滴眼液及制备方法。该滴眼液包括重组人干扰素α1b、pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂以及水。本发明还提供了其制备方法。与现有技术相比，本发明制备的滴眼液具备安全性高、刺激性小、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医用、牙科用或梳妆用的配制品技术领域，尤其涉及一种重组人干扰素α1b滴眼液。
背景技术
重组人干扰素α-1b是一种广谱的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能的细胞因子，重组人干扰素α-1b滴眼液主要用于治疗病毒性引起的眼睑单纯疱疹、单疱性结膜炎、角膜炎、单疱性虹膜睫等，疗效显著。滴眼剂常常需要在辅料中添加抗菌剂以保证多次使用无染菌危险，常用的滴眼剂抗菌剂包括羟苯乙酯、苯扎氯胺、间甲酚等。越来越多的研究表明抑菌剂会对眼组织造成损伤。中国药典2015年版明确要求滴眼剂必须通过抑菌效力评价，确定合理的抗菌剂浓度。
CN202011267445.8公开了一种干扰素滴眼液及其制备方法，其组成包括干扰素活性成分，聚乙烯醇，非离子表面活性剂，金属离子螯合剂，离子强度调节剂，抑菌剂，pH缓冲盐体系。该发明滴眼液具有良好的生物学活性和稳定性，具有成本优势和安全优势，聚乙烯醇的加入可以提高病人的顺应性，用于治疗病毒性眼病。
CN200410069390.4涉及一种稳定的重组人干扰素α1b水溶液，在总体积为1000ml的水溶液中，包括：治疗有效量的干扰素α1b；2.5-27.0g氯化钠；0.15-0.60g枸椽酸；1.5-6.0g十二水磷酸氢二钠；5-20g人血白蛋白。
安全，稳定，有效是生物药物制剂中的关键问题，如何保证制剂的稳定性，同时又不能降低药物的安全性，抗菌剂的添加就成为关键，在生产，贮存，运输和使用的过程中都有防止微生物污染的必要。为了达到抑菌的目的，滴眼液制剂通常会添加抗菌剂，但抑菌剂现有的有机抗菌剂如羟苯乙酯、苯扎氯胺、间甲酚不仅会影响滴眼液的质量，还可能产生毒副作用，对眼组织造成损害。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人干扰素α1b滴眼液。
黄芩素是一种黄酮类化合物，来源于天然植物黄芩（Scutellaria baicalensis）的根。黄芩素具有很强的抗氧化、抗炎和抗癌活性。并且，黄芩素具有广谱抗菌作用。然而，它水溶性差，容易被氧化，导致其生物利用度低。因此，黄岑素的临床应用受到了极大限制。黄芩素抗菌谱广，尤其对金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用。黄芩素主要通过影响细菌膜通透性，抑制蛋白质合成和影响SDH、MDH和DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ活动发挥其抗菌功能。进一步研究后，发现黄芩素不仅能够抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成和破坏生物被膜，还能增加万古霉素的通透性，并且减少葡萄球菌肠毒素A和α-溶血素的产生，从而达到抑制群体感应系统的目的。本发明通过对黄岑素进行酰化、磺化改性，不仅提升了其抗菌活性，还提供了水溶性和抗氧化性，从而能够更好地溶解于滴眼液中，而且不易发生分解，更好地发挥出抑菌作用。将制备得到的抑菌剂加入到重组人干扰素α1b滴眼液中，不仅免除了使用有机抗菌剂的风险，而且能够极大地保证滴眼液的稳定性和生物活性不受影响，从而保证产品质量。
为实现上述目的，本发明提供了一种重组人干扰素α1b滴眼液，包括重组人干扰素α1b、pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂以及水。
进一步的，所述pH调节剂为磷酸盐缓冲体系，柠檬酸盐缓冲体系中的一种或两种；所述缓冲体系的pH为6~7.5。
进一步的，所述渗透压调节剂为氯化钠。
所述抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
X1、将丁酸加入到无水四氢呋喃中，降温后加入1-羟基苯并三唑，混合均匀，得到溶液A；将二环己基碳二亚胺加入到无水四氢呋喃中，混合均匀得到溶液B；将溶液B滴加到溶液A中，继续搅拌，搅拌结束后过滤，留滤液备用；
X2、将黄芩素加入到无水四氢呋喃中，再加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺，混合均匀后加入步骤X1中的滤液，搅拌结束后，浓缩除去溶剂，残余物经柱层析纯化后用于下一步；
X3、将上一步的产物在冰浴下边搅拌边缓慢加入浓硫酸，继续低温搅拌0.5~1h后升至室温搅拌6~10h，然后倒入6~8倍体积的3mol/L氯化钠水溶液，有沉淀开始出现，继续搅拌2~4h后过滤，用3mol/L氯化钠水溶液洗涤至pH呈中性后，将残余物经水中重结晶后干燥得到所述抑菌剂。
进一步的，所述步骤X1中降温的温度范围为﹣5~0℃。
进一步的，所述步骤X1中搅拌的时间为10~16h。
进一步的，所述步骤X2中搅拌的时间为4~6h。
进一步的，所述步骤X3中低温搅拌的温度范围为0~5℃。
优选的，所述抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
X1、将丁酸0.1~0.5重量份加入到10~100重量份的无水四氢呋喃中，降温至﹣5~0℃后加入1-羟基苯并三唑0.3~1重量份，混合均匀，得到溶液A；将二环己基碳二亚胺0.5~2重量份加入到20~50重量份的无水四氢呋喃中，混合均匀得到溶液B；将溶液B滴加到溶液A中，继续﹣5~0℃搅拌10~16h，搅拌结束后过滤，留滤液备用；
X2、将黄芩素0.5~3重量份加入到50~200重量份的无水四氢呋喃中，再加入4-二甲氨基吡啶0.01~0.5重量份、三乙胺0.5~2重量份，混合均匀后加入步骤X1中的滤液，搅拌4~6h结束后，浓缩除去溶剂，残余物经柱层析纯化后用于下一步；
X3、将上一步的产物0.5~2重量份在0~5℃冰浴下边搅拌边缓慢加入浓硫酸5~15重量份，继续0~5℃搅拌0.5~1h后升至室温搅拌6~10h，然后倒入6~8倍体积的3mol/L氯化钠水溶液，有沉淀开始出现，继续搅拌2~4h后过滤，用3mol/L氯化钠水溶液洗涤至pH呈中性后，将残余物经水中重结晶后干燥得到所述抑菌剂。
一种重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，将重组人干扰素α1b 1~10mg加10~100mL水溶解，再加入抑菌剂0.3~1g、氯化钠2.5~25g和30~300mL水，继续搅拌溶解；
S2、再加入pH调节剂，调节pH至6~7，加水定容至100~1000mL，经除菌滤膜过滤后灌装、密封即得。
进一步的，所述除菌滤膜为0.22μm。
本发明的有益效果：
1、与现有技术相比，本发明通过对黄岑素进行酰化、磺化改性，不仅提升了其抗菌活性，还提供了水溶性和抗氧化性，从而能够更好地溶解于滴眼液中，而且不易发生分解，更好地发挥出抑菌作用。
2、本发明将制备得到的抑菌剂加入到重组人干扰素α1b滴眼液中，不仅免除了使用有机抗菌剂的风险，而且能够极大地保证滴眼液的稳定性和生物活性不受影响，从而保证产品质量。
具体实施方式
重组人干扰素α1b，每1mg生物活性＞1×108IU，长春生物制品研究所。
磷酸盐缓冲液，15mmol/L，pH=6.5。
黄芩素，98wt%，货号：jhhg03，西安晋恒化工。
浓硫酸，98wt%。
对照例1
一种重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，将重组人干扰素α1b 10mg加100mL水溶解，再加入苯扎氯铵0.5g、氯化钠2.5g和300mL水，继续搅拌溶解；
S2、再加入磷酸盐缓冲液，调节pH至6.4，加水定容至1000mL，经0.22μm除菌滤膜过滤后灌装、密封即得。
实施例1
一种重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，将重组人干扰素α1b 10mg加100mL水溶解，再加入抑菌剂0.5g、氯化钠2.5g和300mL水，继续搅拌溶解；
S2、再加入磷酸盐缓冲液，调节pH至6.4，加水定容至1000mL，经0.22μm除菌滤膜过滤后灌装、密封即得。
所述抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
X1、将丁酸0.4g加入到40mL无水四氢呋喃中，降温至﹣5℃后加入1-羟基苯并三唑0.7g，混合均匀，得到溶液A；将二环己基碳二亚胺1g加入到30mL无水四氢呋喃中，混合均匀得到溶液B；将溶液B滴加到溶液A中，继续﹣5℃搅拌12h，搅拌结束后过滤，留滤液备用；
X2、将黄芩素1.2g加入到100mL无水四氢呋喃中，再加入4-二甲氨基吡啶0.1g、三乙胺1.2g，混合均匀后加入步骤X1中的滤液，搅拌5h结束后，浓缩除去溶剂，残余物经柱层析纯化后用于下一步；
X3、将上一步的产物1g在0℃冰浴下边搅拌边缓慢加入浓硫酸11g，继续0℃搅拌0.5h后升至室温搅拌8h，然后倒入7倍体积的3mol/L氯化钠水溶液，有沉淀开始出现，继续搅拌3h后过滤，用3mol/L氯化钠水溶液洗涤至pH呈中性后，将残余物经水中重结晶后干燥得到所述抑菌剂。
实施例2
一种重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，将重组人干扰素α1b 10mg加100mL水溶解，再加入抑菌剂0.5g、氯化钠2.5g和300mL水，继续搅拌溶解；
S2、再加入磷酸盐缓冲液，调节pH至6.4，加水定容至1000mL，经0.22μm除菌滤膜过滤后灌装、密封即得。
所述抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
X1、将丁酸0.4g加入到40mL无水四氢呋喃中，降温至﹣5℃后加入1-羟基苯并三唑0.7g，混合均匀，得到溶液A；将二环己基碳二亚胺1g加入到30mL无水四氢呋喃中，混合均匀得到溶液B；将溶液B滴加到溶液A中，继续﹣5℃搅拌12h，搅拌结束后过滤，留滤液备用；
X2、将黄芩素1.2g加入到100mL无水四氢呋喃中，再加入4-二甲氨基吡啶0.1g、三乙胺1.2g，混合均匀后加入步骤X1中的滤液，搅拌5h结束后，浓缩除去溶剂，残余物经柱层析纯化后即得所述抑菌剂。
实施例3
一种重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，将重组人干扰素α1b 10mg加100mL水溶解，再加入抑菌剂0.5g、氯化钠2.5g和300mL水，继续搅拌溶解；
S2、再加入磷酸盐缓冲液，调节pH至6.4，加水定容至1000mL，经0.22μm除菌滤膜过滤后灌装、密封即得。
所述抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
将黄岑素0.8g在0℃冰浴下边搅拌边缓慢加入浓硫酸11g，继续0℃搅拌0.5h后升至室温搅拌8h，然后倒入7倍体积的3mol/L氯化钠水溶液，有沉淀开始出现，继续搅拌3h后过滤，用3mol/L氯化钠水溶液洗涤至pH呈中性后，将残余物经水中重结晶后干燥得到所述抑菌剂。
实施例4
一种重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，将重组人干扰素α1b 10mg加100mL水溶解，再加入黄芩素0.5g、氯化钠2.5g和300mL水，继续搅拌溶解；
S2、再加入磷酸盐缓冲液，调节pH至6.4，加水定容至1000mL，经0.22μm除菌滤膜过滤后灌装、密封即得。
实施例5
与实施例1相同，唯一区别是抑菌剂为0.3g。
实施例6
与实施例1相同，唯一区别是抑菌剂为0.7g。
测试例1
将对照例及实施例制备的滴眼液在4℃长期贮存，并分别在并0、3、6、9、12、18、24月时，用常规WISH细胞-VSV系统测定生物活性，并用中国药品生物制品检定所的测活标准品加以校正；
安全、稳定、有效是生物药物制剂中的关键问题，如何保证制剂的稳定性，同时又不能降低药物的安全性，抗菌剂的添加就成为关键，在生产、贮存、运输和使用的过程中都有防止微生物污染的必要。从稳定性测试可以看到，实施例1与对照例1相比，本发明所制备的抑菌剂具有不亚于苯扎氯铵的抑菌稳定效果，而实施例4中的黄芩素与实施例1中经改性的黄芩素相比，抑菌稳定的效果较差，由于黄芩素本身水溶性较差且易被氧化导致成分失效，因此其在稳定性测试中很难发挥稳定、持久的抗菌效果，而实施例2~3中，酰化提升抗菌活性但不能改善水溶性差的缺陷，而磺化则只能解决水溶性差的问题，只有实施例1即能提升抗菌活性，又提高了黄芩素的水溶性及抗氧化能力，导致其在滴眼液中能够较好地溶出，且不易被氧化分解，而且抗菌性好，因此所得到的滴眼液具有长期稳定性，实施例5~6与实施例1相比，当抑菌剂的浓度较低时会一定程度影响滴眼液的储存稳定性，而实施例6与实施例1的效果相差无几，因此出于安全性考虑，实施例1的用量最佳。
测试例2
将健康大白兔随机分成7组，每组10只，各组大白兔左眼分别滴入1滴对照例或实施例制备的重组人干扰素α1b滴眼液，同时大白兔右眼滴入1滴生理盐水作为对照，每日滴1次，连续滴10d。通过荧光素钠染色和裂隙灯法观察在第1次滴眼后1h和第10d滴眼后1h的各组滴眼液对眼睛刺激情况。眼刺激性评价项目及其评价分值：角膜：0分-无混浊；1分-散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见；2分-半透明区易分辨，虹膜模糊不清；3分-出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见；4分-角膜不透明，虹膜无法辨认。虹膜：0分-正常；1分-皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应；2分-出血/肉眼可见坏死/对光无反应(或其中过一种)。结膜充血(指睑结膜和球结膜)：0分-血管正常；1分-血管充血呈鲜红色；2分-血管充血呈深红色，血管不易分辨；3分-弥漫性充血呈紫红色。水肿：0分-无水肿；1分-轻微水肿(含眼睑)；2分-明显水肿伴部分眼睑外翻；3分-水肿至眼睑至半闭合；4分-水肿至眼睑超过半闭合；分泌物：0分-无分泌物；1分-少量分泌物；2分-分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着；3分-分泌物使整个眼区潮湿或粘着。通过评分评价滴眼液的刺激性，标准为0~3分无刺激性，3~8分低刺激性，8~12分中刺激性，12~16分重刺激性。在第一次给药1h和第10d滴眼后1h分别观察兔眼情况，并统计刺激性评分，取平均值；
从刺激性测试可以看出，本发明所制备的抑菌剂具有比现有有机抑菌剂苯扎氯铵更低的刺激性，因此在眼部使用不会对患者产生影响，安全性高，顺应性好，不会使患者眼部产生不适感。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，将重组人干扰素α1b 1~10mg加10~100mL水溶解，再加入抑菌剂0.3~1g、氯化钠2.5~25g和30~300mL水，继续搅拌溶解；
S2、再加入pH=6~7.5的磷酸盐缓冲体系，调节pH至6~7，加水定容至100~1000mL，经除菌滤膜过滤后灌装、密封即得；
所述抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
X1、将丁酸0.4g加入到40mL无水四氢呋喃中，降温至﹣5℃后加入1-羟基苯并三唑0.7g，混合均匀，得到溶液A；将二环己基碳二亚胺1g加入到30mL无水四氢呋喃中，搅拌均匀得到溶液B；将溶液B滴加到溶液A中，继续﹣5℃搅拌12h，搅拌结束后过滤，留滤液备用；
X2、将黄芩素1.2g加入到100mL无水四氢呋喃中，再加入4-二甲氨基吡啶0.1g、三乙胺1.2g，混合均匀后加入步骤X1中的滤液，搅拌5h结束后，浓缩除去溶剂，残余物经柱层析纯化后用于下一步；
X3、将上一步的产物1g在0℃冰浴下边搅拌边缓慢加入浓硫酸11g，继续0℃搅拌0.5h后升至室温搅拌8h，然后倒入7倍体积的3mol/L氯化钠水溶液，有沉淀开始出现，继续搅拌3h后过滤，用3mol/L氯化钠水溶液洗涤至pH呈中性后，将残余物经水中重结晶后干燥得到所述抑菌剂。
2.如权利要求1所述的重组人干扰素α1b滴眼液的制备方法，其特征在于，所述除菌滤膜为0.22μm。
3.一种重组人干扰素α1b滴眼液，其特征在于由权利要求1或2所述的方法制备而成。
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