CN117946922A - 一株用于发酵鱼肉的乳酸片球菌 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一株用于发酵鱼肉的乳酸片球菌。所述乳酸片球菌的保藏号为CCTCC NO：M20231509，具有很强的抗氧化能力，可广泛应用于发酵鱼肉制品的生产，能够提高其营养成分和安全性，且能够有效保持发酵鱼肉产品的品质稳定性。经该菌株发酵后，鱼糜的风味得到明显改善，鲜味提高，腥味、氨味、腐臭味减少，口感紧实度提高；鱼糜中总酸、氨基酸态氮、多肽、游离氨基酸含量显著提高，组胺的含量降至2.75mg/kg；鱼糜在21天的保藏过程中pH和活菌量均可保持稳定，取得了意料不到的技术效果。
Description
技术领域
本发明属于微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一株用于发酵鱼肉的乳酸片球菌。
背景技术
鱼肉因其口感细嫩、味道鲜美，含有丰富的蛋白质和优质脂肪酸等营养成分而广受喜爱，鱼类也是我国最丰富的水产资源之一。然而鱼类等水产品往往具有收获期短，且难以保藏的特点。
发酵是一种古老的用于食品保藏的技术，最广泛应用发酵技术保藏食物的例子是酸奶和泡菜，将发酵技术用于保藏鱼类等水产也同样具有悠久的历史，可解决大量鲜鱼产出而未能及时食用或销售的问题,有效提高鱼的利用率。发酵鱼制品种类繁多，不同地区的人们根据其气候环境和人文特色不同制作出的发酵鱼制品也不尽相同。根据添加辅料的不同，发酵鱼制品可分为盐渍自然发酵的酶香鱼、添加酒类的糟制品、添加谷物的鱼鲊制品和添加米醋的醋渍品等。根据最终发酵鱼产品的形态不同又可分为尽可能保留形态的整鱼或鱼片、鱼被发酵成糊状产品的鱼膏、鱼被发酵成液体的鱼酱等。例如印度尼西亚地区的盐渍发酵鱼Jambalroti和budu，瑞典地区的即食酸鲱鱼产品柬埔寨地区的发酵鱼制品prohok，冰岛地区的腌制鲨鱼肉Hákarl等。在我国，发酵鱼制品也同样具有悠久的食用历史，例如贵州和湖南地区的酸鱼、安徽地区的臭鳜鱼、广东地区的糟鱼、潮汕地区的鱼露、海南地区的鱼茶等。
传统发酵鱼制品是利用鱼本身或环境中的微生物以及鱼体内各种酶的共同作用进行一系列生化反应的过程。在这个过程中,乳酸菌等优势菌迅速生长繁殖,代谢产生有机酸等使体系pH下降,抑制腐败菌或病原菌的生长。此外，微生物代谢使鱼肉中的蛋白质变性和降解生成短肽与氨基酸等，使营养成分更容易消化吸收，鱼肉脂质的降解产生的脂肪酸、酯类等，也促使发酵鱼产品拥有极具地方特色的风味。但由于原料的不同,环境中富集的微生物差异，受到不同年份、不同季节温度与湿度的影响,参与发酵的微生物种群不确定,使得每种发酵制品的风味差异大,产品品质难以控制,发酵周期也较长。
人工接种发酵是目前工业化生产发酵食品最常用的方式，人工接种发酵有助于控制接种量、发酵条件与安全生产，从而实现发酵终产品品质可控，为工业化生产稳定的产品提供了保障。
乳酸菌被认为是可以安全食用的食品级有机体，能够增强产品的营养成分和安全性。它的生长活性受到干燥、冷熏等加工工艺的影响较小，能很好的适应鱼肉的加工工艺。无论是在块状鱼肉上喷洒或涂抹，还是在肉糜中搅拌乳酸菌，都能达到良好的发酵效果。除了增加食品的营养价值外，它还能够通过分泌代谢产物、争夺有限的营养素等机制抑制某些食源性腐败菌与致病菌。乳酸菌发酵剂具有天然安全的优势，且在发酵过程中可通过自身功能活性改善发酵鱼类的感官品质。因此,从传统自然发酵水产制品中分离鉴定优势发酵乳酸菌种,选育合适的乳酸菌发酵剂,有利于缩短发酵周期、改善鱼制品的安全理化指标和风味品质,促进发酵鱼制品的商业化生产。随着消费者的需求多样化、消费水平的提高,发酵鱼制品的深加工开发,具有良好前景。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种乳酸片球菌及其在发酵鱼肉中的应用。所述乳酸片球菌能够提高发酵鱼肉产品的营养成分和安全性，且能够有效保持发酵鱼肉产品的品质稳定性。
本发明首先提供了一株乳酸片球菌，命名为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)VHProbi S85株，于2023年8月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M20231509。
所述乳酸片球菌VHProbi S85株，其蛋白质指纹图谱如图3所示，RAPD图谱如图4所示，rep-PCR图谱如图5所示。
所述乳酸片球菌VHProbi S85株的16srDNA序列为SEQ ID NO:1。
本发明一方面提供了所述乳酸片球菌VHProbi S85株在制备具有抗氧化功能的制品中的应用。
本发明还提供了乳酸片球菌VHProbi S85株在发酵鱼肉中的应用。
本发明还提供了乳酸片球菌VHProbi S85株在制备酱卤类水产制品或泡菜制品中的应用。
本发明还提供一种具有抗脂质过氧化功能的制品，所述的制品中包含有乳酸片球菌VHProbi S85活菌、其发酵上清液或胞内提取物。
本发明还提供了一种鱼糜制品，是使用乳酸片球菌VHProbi S85株发酵鱼肉制备的。
本发明筛选获得的乳酸片球菌可广泛用于发酵鱼肉。经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后的鱼糜鲜味评分提高40.90％，腥味减少29.51％，氨味减少60％，腐臭味减少65.38％，酸味增加50％，口感紧实度提高7.69％，整体喜好度增加24.49％，风味更为丰富；与发酵前相比，发酵鱼糜中总酸含量提高了1.59倍，氨基酸态氮含量提高了20％，多肽含量提高了92％，组胺含量降低了77％，仅为2.75mg/kg，远低于50mg/kg的限量标准；游离氨基酸含量提高31％，其中，谷氨酸含量提高70％，丙氨酸含量提高29％，酪氨酸含量提高173％。而且，本发明提供的发酵鱼糜在21天内可保持pH和活菌数稳定。
本发明提供的乳酸片球菌VHProbi S85株具有较强的体外抗脂质过氧化能力，其发酵上清液、菌体和胞内提取物抗脂质过氧化抑制率分别达到55.78％、38.69％、24.2％；抗氧化性能强，对DPPH自由基的清除率为14.24％，具有益生潜力。该菌株对盐耐受力较好，最大可耐受8％盐浓度，可在酱卤类水产制品或泡菜制品中保持活性。
附图说明
图1为乳酸片球菌VHProbi S85的MRS平板菌落图；
图2为乳酸片球菌VHProbi S85的碳源代谢结果图；
图3为乳酸片球菌VHProbi S85的蛋白指纹图谱；
图4为乳酸片球菌VHProbi S85的RAPD图谱；
图5为乳酸片球菌VHProbi S85的rep-PCR图谱；
图6为乳酸片球菌VHProbi S85发酵鱼糜发酵前后感官评价图；
图7为乳酸片球菌VHProbi S85发酵鱼糜发酵前后总酸与氨基酸态氮含量图；
图8为乳酸片球菌VHProbi S85发酵鱼糜的pH变化曲线图；
图9为乳酸片球菌VHProbi S85发酵鱼糜制品存储期间活菌数变化曲线图。
具体实施方式
本发明从北方沿海地区农家自制的虾酱中分离出12株乳酸菌，通过对深海鱼糜发酵性能和发酵风味的进一步筛选，发现乳酸片球菌VHProbi S85的发酵风味显著优于其他菌株。经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后的鱼糜中总酸和游离氨基酸含量显著增加，不良风味减弱，香气增加，且鱼肉口感更加紧实，更受消费者喜爱。
乳酸片球菌VHProbi S85已于2023年8月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M20231509。
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的阐述。
实施例1乳酸片球菌VHProbi S85的筛选鉴定
1、乳酸菌初筛
配制MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基：纯化水1000ml，蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母提取物5.0g，乙酸钠5.0g，葡萄糖5.0g，磷酸二氢钾2.0g，吐温-80 1.0ml，柠檬酸二胺2.0g，碳酸钙20.0g，七水硫酸镁0.58g，七水硫酸锰0.25g，琼脂15.0g，调节pH6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。
取25g虾酱于无菌均质袋中，加入225mL生理盐水，用均质机混合均匀后取100μL混匀液梯度稀释，涂布与MRS培养基后37℃培养48h，待平板长出单菌落后，使用全自动微生物质谱检测系统Autofms1000对菌株种属进行鉴定。根据鉴定结果，共筛选出12株潜在乳酸菌，分别命名为XJ-1、XJ-2、XJ-3、XJ-4、XJ-5、XJ-6、XJ-7、XJ-8、XJ-9、XJ-10、XJ-11、XJ-12。
2、乳酸菌复筛
将深海鱼剔除鱼骨、鱼皮后用料机理搅打成鱼糜，并添加0.7％葡萄糖作为发酵鱼糜底物，巴氏杀菌后放置于4℃备用。
将筛选到的12株菌按照106CFU/mL接种于上述鱼糜中，37℃静置发酵24h，发酵结束后蒸熟进行消费者喜好度评价。
结果显示，本发明筛选到的12株菌中，XJ-6菌株发酵后的鱼糜制品更受消费者的喜爱。
申请人对该菌株作进一步鉴定和性能分析。
实施例2XJ-6菌株的鉴定
2.1菌落形态鉴定
XJ-6菌株在MRS培养基上的菌落形态如图1所示，菌落呈乳白色，边缘整齐光滑，表面湿润，中等大小，直径在2-3mm左右。
2.2碳源代谢试验
利用API50 CHL试剂验证菌株的碳源代谢性能。API50 CHL试剂可用来鉴定菌株在属或种水平上的差异。实验方法及结果分析具体参见API50 CHL试剂盒说明书。
分析结果如图2所示，XJ-6菌株与乳酸片球菌的ID值为98.6％，碳水化合物代谢活性基本相同，初步鉴定其为乳酸片球菌。
2.3分子生物学鉴定
2.3.1MALDI-TOF-MS检测菌株核糖体蛋白表达
按照0.2％的接种量在MRS液体培养基中接种新鲜菌液，37℃静置培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μL裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μL基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20KV电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用Autof ms1000分析软件Autof Analyzerv1.0获取蛋白指纹图谱，结果如图3所示。
2.3.2 16srDNA基因序列
(1)基因组DNA提取
参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作。
(2)16srDNA基因扩增
引物序列：
27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；
1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
(3)扩增体系
表1：16srDNA PCR扩增体系表
(4)电泳验证
PCR产物核酸电泳，片段大小为1500bp。
(5)产物测序
测序结果显示，XJ-6菌株的16srDNA序列SEQ ID NO:1，具体如下：
TAGACGGCTAGCTCCTAAAGGTTACCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTAAACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAGTAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACACCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCTTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGATTACTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGTAATCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGCACTTCTTCGGTTGAGCCG
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GTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCG
GCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCC
CGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGG
TCGGCTACGCATCATCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCG
CCGCGGGTCCATCCAGAAGTGATAGCAGAGCCATCTTTTAAAAGAAAACCAGG
CGGTTTTCTCTGTTATACGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCTGCTT
CTGGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCACTTCGTGTTAAAATCTCATTCAGTGCAAGCACGTCATAATCAATTAACGGAAGTTCGTTCGACTG。
将XJ-6菌株的16srDNA序列SEQ ID NO:1在NCBI数据库中进行Nucleotide BLAST比对。结果显示，XJ-6菌株与乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的相似性最高。因此，初步确定XJ-6菌株为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。
2.3.3RAPD指纹图谱鉴定
(1)引物序列M13(5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′)。
(2)RAPD反应体系如表2所示。
表2：RAPD反应体系表
(3)电泳
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图，XJ-6菌株的RAPD指纹图谱如图4所示。
2.3.4rep-PCR指纹图谱鉴定
1)rep-PCR引物：5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′。
2)rep-PCR的反应体系如表3所示。
表3：rep-PCR的反应体系表
3)电泳
DL2000 DNA Marker作为结果对照，电压100V，电泳时间80min，检测扩增结果，XJ-6的rep-PCR指纹图谱如图5所示。
综上，结合菌株的菌落形态、碳源代谢和分子生物学的鉴定结果，可以确定XJ-6菌株为一株新的乳酸片球菌，将其命名为乳酸片球菌VHProbi S85株。
实施例3乳酸片球菌VHProbi S85的生理生化特性
本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量乳酸片球菌VHProbi S85新鲜菌液，5000rmp/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬后稀释50倍，作为接种液。
3.1葡萄糖产酸产气实验
本实施例中所用的培养基配方如下：
蛋白胨0.5g，酵母提取物0.3g，吐温-80 0.1mL，盐溶液A0.5mL，盐溶液B0.5mL，乙酸钠0.5g，葡萄糖2.5g，2％溴甲酚绿(w/v)0.05mL，蒸馏水100mL，pH6.8～7.0。
盐溶液A成分：KH2PO410g、K2HPO41.0g，溶于蒸馏水，定容至100mL。
盐溶液B成分：MgSO4·7H2O11.5g、MnSO4·2H2O2.4g、FeSO4·7H2O0.68g，溶于蒸馏水，定容至100mL。
将配制好的培养基分装至含有杜氏小管的大试管中(10mL/管)，121℃，高压灭菌15min。
在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种至培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用2mL无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养。连续培养6d，每天观察培养基颜色有无变化。
结果显示，在37℃培养6d后，培养基由绿色变为黄色，杜氏小管内无气体，说明乳酸片球菌VHProbi S85株发酵葡萄糖产酸，不产气。
3.2温度耐受范围实验
在无菌条件下，将接种液按10％的接种量分别接种到10mLMRS液体培养基中，不接菌的10mLMRS液体培养基作为对照，分别置于10℃和15℃恒温培养箱培养7天，45℃、50℃和65℃恒温培养箱培养2天，观察培养液是否变浑浊。
结果显示，乳酸片球菌VHProbi S85在10℃恒温培养7天后，培养基仍澄清；15℃和45℃恒温培养2天后，培养基变浑浊，50℃和60℃恒温培养2天后，培养基仍澄清。从而说明乳酸片球菌VHProbi S85菌株在10℃、50℃和60℃条件下不能生长，在15℃和45℃条件下能正常生长。
3.3盐度耐受性实验
在无菌条件下，将接种液按4％的接种量分别接种到10mL盐浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的MRS液体培养基中，不接菌的10mLMRS液体培养基作为对照，然后用2mL无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养，观察培养液是否变浑浊。
结果显示，乳酸片球菌VHProbi S85可耐受高盐环境，最大耐盐浓度为8％。
实施例4乳酸片球菌VHProbi S85的抗氧化性能分析
4.1乳酸片球菌VHProbi S85对DPPH自由基的清除能力测定
将生长状态优良的乳酸片球菌VHProbi S85单菌落接种于3mLMRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养18-20h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养18h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mLPBS缓冲液洗涤菌体后，再加入2mLPBS溶液重悬菌体，得PBS菌悬液。
取1mL乳酸片球菌VHProbi S85的PBS菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后置于室温下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A样本，测三次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积乳酸片球菌VHProbi S85的PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：
清除率％＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％。
结果显示，本发明提供的乳酸片球菌VHProbi S85对DPPH自由基清除率为14.24±0.52％。
4.2乳酸片球菌VHProbi S85体外抗脂质过氧化能力测定
将乳酸片球菌VHProbi S85接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，传3代后，6000r/min，4℃离心10min，收集上清液即为发酵上清液。收集的菌体用PBS缓冲液(pH7.4)于6000r/min离心10min，洗涤3次。将菌体重悬于PBS缓冲液，调整菌体浓度为1.0×109cells/mL，所得菌悬液分为两组，一组作为菌体组，另一组用于胞内提取物的制备。将乳酸菌菌体悬液冰浴超声波破碎细胞10min后，在4℃、10000r/min离心15min，收集上清液，即为胞内提取物。
亚油酸乳化液的制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween20，19.7mL去离子水。
0.5mL PBS溶液(pH7.4)中加入1mL亚油酸的乳化液，1mLFeSO4(1％)，再加入0.5mL样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2mLTCA(4％)，2mLTBA(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000r/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为A；对照组以0.5mL蒸馏水代替样品即为A0，以PBS液加等体积的样品液离心过滤后调零。
抑制率/％＝(A0－A)/A0×100％。
注：A为样品组吸光度；A0为对照组吸光度。
实验结果见表4。
表4：体外抗脂质过氧化抑制率表
从表4的数据可知，本发明提供的乳酸片球菌VHProbi S85具有良好的抗氧化活性，其发酵上清液、菌体和胞内提取物体外抗脂质过氧化抑制率分别达到55.78％、38.69％、24.20％。
实施例5乳酸片球菌VHProbi S85在发酵鱼糜制品中的应用
将新鲜深海鳕鱼剔除鱼皮、鱼骨和内脏，将鱼肉部分用料理机搅打呈肉糜，按0.5-2％的质量百分比添加葡萄糖，优选为0.7％，均质后巴氏杀菌，备用。
将灭菌后的鱼糜冷却到37℃左右，接种活化后的乳酸片球菌VHProbi S85，使接种量为106CFU/mL，搅拌均匀，37感发酵24h，即制得发酵鱼糜。
实施例6乳酸片球菌VHProbiS85发酵鱼糜制品的性能评价
6.1感官评价
将实施例5制备得到的发酵鱼糜与未发酵的鱼糜分别蒸熟后放在一次性纸杯中，由感官评价小组的10名成员(5位男性，5位女性)进行评价，气味评价不同样品之间提供咖啡豆进行冲洗，品尝评价不同样品之间提供水和饼干进行冲洗，以10分制进行打分，取最终10位成员平均分作为最终分值。
结果如图6所示，经过乳酸片球菌VHProbi S85发酵后的鱼糜鲜味评分提高40.90％，腥味减少29.51％，氨味减少60％，腐臭味减少65.38％，酸味增加50％，口感紧实度提高7.69％，整体喜好度增加24.49％，风味较发酵前更为丰富。
6.2总酸和氨基酸态氮含量测定
将实施例5制备得到的发酵鱼糜与未发酵的鱼糜各取2.5g，用去离子水定容至50mL，取10mL稀释后的样品与烧杯中，加入30mL去离子水，在磁力搅拌下用0.05mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2，记录此时消耗NaOH溶液的体积。加入5mL甲醛溶液，继续滴定至pH9.2，记录此时消耗NaOH溶液的体积。根据所消耗碱液的体积对总酸和氨基酸态氮含量分别进行计算：
X1＝(V1-V2)×c×0.09×100(2.5×V0/50)；
X2＝(V3-V4)×c×0.014×100(2.5×V0/50)。
式中：X1为总酸含量(g/100mL)；X2为氨基酸态氮含量(g/100mL)；V0为稀释液取样量(mL)；V1为滴定稀释液消耗的标准NaOH溶液体积(mL)；V2为滴定空白消耗的标准NaOH溶液体积(mL)；V3为加入甲醛后滴定稀释液消耗的标准NaOH溶液体积(mL)；V4为加入甲醛后滴定空白消耗的标准NaOH溶液体积(mL)；c为NaOH标准滴定溶液的浓度(mol/L)；0.090是与1mL的1mol/LNaOH标准滴定溶液相当的乳酸的质量(g)；0.014是与1mL的1mol/LNaOH标准滴定溶液相当的氮的质量(g)。
结果如图7所示，经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后，鱼糜中总酸含量提高了1.59倍，氨基酸态氮含量提高了20％。
6.3多肽含量测定
取2.5g实施例5制备得到的发酵鱼糜，加入25ml的10％(W/V)三氯乙酸(TCA)水溶液于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min后在4000r/min离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀后取6ml上述溶液，置于另一试管中加入双缩脲试剂4ml(样液:双缩脲试剂＝3:2V/V)于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min后2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度c(mg/ml)，进而可求得发酵鱼糜中多肽含量。
表5：发酵鱼糜多肽含量表
从表5的数据可知，经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后，鱼糜中多肽含量提高了92％。
6.4组胺含量的测定
依据组胺含量检测试剂盒说明书方法进行检测，结果如表6所示。
表6：发酵鱼糜组胺含量表
从表6的数据可知，经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后，鱼糜中组胺的含量降低了77％，仅为2.75mg/kg，远低于50mg/kg的限量标准。
6.5游离氨基酸含量测定
准确称取25g实施例5制备得到的发酵鱼糜于均质袋中均质；取1g均质后的发酵鱼糜置于50mL容量瓶中，用5％的三氯乙酸定容，充分摇匀，常温超声20min后于25℃下静置2h，10000r/min下离心10min，将上清液进行微孔过滤，使用高效液相色谱仪进行游离氨基酸分析。
色谱条件：ODS Hypersil色谱柱(250mm×4mm×5μm)；流动相：A为27.6mmol/L醋酸钠∶三乙胺∶四氢呋喃＝500∶0.11∶2.50(v/v/v)，B为80.9mmol/L醋酸钠∶甲醇∶乙腈＝1∶2∶2(v/v/v)；梯度洗脱程序为：0min，8％B；17.0min，50％B；20.1min，100％B；24.0min，0％B；柱温40℃，流动相流速1.0mL/min；紫外检测器检测波长338nm；氨基酸含量以外标法定量。
表7：发酵鱼糜中游离氨基酸含量表
结果如表7所示，经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后，鱼糜中游离氨基酸总量提高了31％；其中，谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸的含量分别提高了70％、29％和173％。
6.6活菌量测定
取实施例5制备得到的发酵鱼糜用生理盐水进行10倍梯度稀释，直到最后的稀释预计含有大约30个菌落形成单位(CFU)/mL。在10～20min内稀释样品，选取最后三个稀释梯度用于分析；每个稀释梯度吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，将冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀；37℃培养48h；计数培养皿上的菌落。按照以下公式计算乳酸片球菌VHProbi S85的活菌含量。公式如下：
N＝∑C/[(n+0.1n’)×d]。
N——样品中的菌落数；
∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；
n——第一稀释度平板个数；
n’——第二一稀释度平板个数；
d——稀释因子(第一稀释度)。
结果表明，经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后，鱼糜中该菌株的活菌量由7×106CFU/g增加到2×107CFU/g，说明乳酸片球菌VHProbi S85在发酵鱼糜的过程中实现了有效增殖。
6.7稳定性评价
(1)保藏过程中发酵鱼糜的pH变化
将实施例5制备的发酵鱼糜分装并置于4℃密封保藏，每3天取一份测定其pH值。
结果如图8所示，在保藏21天过程中，发酵鱼糜的pH值保持稳定。
(2)保藏过程中发酵鱼糜活菌含量变化
将实施例5制备得到的发酵鱼糜分装并置于4℃密封保藏，每3天取一份测定其活菌含量。
结果如图9所示，在保藏21天过程中，发酵鱼糜中活菌数保持稳定。
上述结果表明，乳酸片球菌VHProbi S85发酵制备的鱼糜在21天的保藏过程中品质可保持稳定。
综上，本发明提供的乳酸片球菌VHProbi S85具有很强的抗氧化能力，可广泛应用于发酵鱼糜制品的生产。经乳酸片球菌VHProbi S85发酵后，鱼糜的风味得到明显改善，鲜味提高，腥味、氨味、腐臭味减少，口感紧实度提高；鱼糜中总酸、氨基酸态氮、多肽、游离氨基酸含量显著提高，组胺的含量降至2.75mg/kg；鱼糜在21天的保藏过程中pH和活菌量均可保持稳定，取得了意料不到的技术效果。
Claims (8)
1.一株乳酸片球菌，其特征在于，所述的乳酸片球菌的保藏编号为CCTCC NO：M20231509。
2.如权利要求1所述的乳酸片球菌，其特征在于，所述的乳酸片球菌的蛋白质指纹图谱如图3所示，RAPD指纹图谱如图4所示，rep-PCR图谱如图5所示。
3.如权利要求1所述的乳酸片球菌，其特征在于，所述的乳酸片球菌的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。
4.权利要求1所述的乳酸片球菌在制备具有抗氧化功能的制品中的应用。
5.权利要求1所述的乳酸片球菌在发酵鱼肉中的应用。
6.权利要求1所述的乳酸片球菌在制备酱卤类水产制品或泡菜制品中的应用。
7.一种具有抗脂质过氧化功能的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的乳酸片球菌活菌、其发酵上清液或胞内提取物。
8.一种鱼糜制品，其特征在于，所述鱼糜制品是使用权利要求1所述的乳酸片球菌发酵鱼肉制备的。
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