CN117946884A - 具备多功能活性的副干酪乳杆菌fm-lp-m4及其应用 - Google Patents
具备多功能活性的副干酪乳杆菌fm-lp-m4及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株来源于酸马奶同时具有优良抗氧化和降血糖功能的副干酪乳杆菌新菌株FM‑LP‑M4及其应用，经鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，该菌株能显著提高HepG2胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗和糖原生成，显著增加丙酮酸激酶和己糖激酶的活性，并降低甘油三酯的含量；显著提高H2O2诱导HepG2氧化损伤细胞的修复作用。该菌株于2022年1月17在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCCNO.24330，本发明的副干酪乳杆菌FM‑LP‑M4，对丰富复合功能益生菌资源、开发抗氧化和降血糖复合功能制品有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及具多功能活性的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4及其在多功能发酵食品、多功能益生菌粉、多功能保健微生态产品等领域的应用。
背景技术
生命机体内存在促氧化和抗氧化的动态平衡，当促氧化和抗氧化的动态平衡被打破而偏向于促氧化方向时，机体就会处在一个氧化应激(Oxidative stress)的状态，而氧化应激与损伤与一些常见的疾病如糖尿病、高血压、哮喘、过敏、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、慢性炎症、癌症等有着十分密切的关系，因此，保持氧化状态平衡和缓解氧化应激状态很重要，具有抗氧化功能的产品则受到热捧。
由高血糖引起的糖尿病及其并发症严重危害人类健康，已成为继肿瘤、心血管疾病之后成为危害人类健康的第三类慢性非传染性疾病。如何有效降低血清中血糖是亟待解决的问题，自人工合成胰岛素以来，磺脲类药物、双胍类、胰岛素增敏剂、糖抑制剂等各种口服或注射的化学药物相继问世，但长期服用化学药物会产生一定的毒副作用。天然产物类降糖因子、矿物质类降糖因子、维生素类降糖因子，其作用机理各不相同，具有作用时间长、温和、性质稳定，且几乎无毒性反应，还可多种降糖成分并存，综合起作用等优点，因此备受患者以及和医学界的青睐，成为降血糖功能因子的主要研究方向
研究表明，乳酸菌对人体有多方面的保健功能，如抗氧化、提高免疫力、调节肠道菌群、增强抗过敏、降低胆固醇等。因此，乳酸菌已经成为用于生产功能性发酵食品、保健品或是抗衰老药品的主要益生菌来源之一，功能益生菌的筛选及应用是研究热点。
开发具有自主知识产权的具有多功能活性的乳酸菌种将会是今后科技攻关与产品创新的重点和难点，也是一个热点，已经成为一个很有实际意义的研究课题。
技术问题
目前存在很多益生菌产品，但益生菌菌株的功能具有特异性，有某一个功能的益生菌，不一定有另外益生功能，多菌株组合使用需要考虑菌株之间的生长相容性、协同性、拮抗性等，只有具有优良共培特性和协同性的菌株才可组合利用。另外，目前的功能菌一般都是具有某种特定功能的菌株，具有复合多功能的益生菌还鲜有报道。针对这一现状，本发明提供一株具有优良的降血糖、抗氧化、耐酸、耐胆盐和优良粘附功能的副干酪乳杆菌FM-LP-M4及其应用，用于降血糖和抗氧化复合功能发酵食品、固体饮料、微生态制剂、保健品等产品开发与生产。
发明内容
针对技术问题，本发明的目的是提供一株同时具备抗氧化和降血糖多功能的且耐酸、耐胆盐和优良粘附功能的副干酪乳杆菌新菌株(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4。
本发明还要解决的技术问题是提供上述副干酪乳杆菌新菌株及其应用，本发明菌株可用于具有抗氧化和降血糖功能的复合功能发酵食品、固体饮料、微生态制剂、保健品等产品开发与生产中应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株抗氧化和降血糖多功能的且发酵性能和耐逆性能优良的副干酪乳杆菌新菌株，其分类命名为副干酪乳杆菌新菌株(Lactobacillus paracasei)，菌株号FM-LP-M4，该菌株于2022年1月17在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCCNO24330，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明以MRS培养基为筛选培养基，根据革兰氏染色、过氧化氢接触酶实验、生长速度、产酸速度等试验结果，从新疆酸马奶中样品中初步分离出生长速度快、产酸能力强的乳酸菌12株，以菌体的DPPH自由基清除率、还原活性、ABTS自由基清除率、PTIO自由基清除率测定菌株的抗氧化能力，以发酵上清液及细胞提取物的α-葡萄糖苷酶活抑制率、α-淀粉酶活抑制率为指标测定菌株的降血糖能力，综合试验结果，筛选出一株产酸快、耐酸性强、抗氧化性能优良、降血糖功能显著的乳酸菌，命名为FM-LP-M4，通过测定16s rDNA序列和持家基因recA基因进行系统发育分析鉴定该菌株，鉴定结果该菌株为副干酪乳杆菌。然后对FM-LP-M4的耐胆盐、耐酸性、细胞粘附特性等特性进行分析，利用HepG2胰岛素抵抗细胞实验测定菌株的降血糖功能，利用H2O2诱导HepG2氧化损伤模型测定菌株的氧化修复功能；然后利用该菌株进行食品的发酵，比较菌株对产品的抗氧化和降血糖功能的影响，同时明确该菌株的菌粉制备技术。
有益效果：
1、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4来源于传统发酵食品酸马奶，来源安全；
2、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4，同时具备优良的抗氧化能力和降血糖能力，且具有优良的发酵性能，与发酵乳制品的商业发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)具有良好的共培养特性，可作为发酵剂单独或与其他商业发酵剂复配发酵奶制品(羊奶、豆奶、牛奶等)和果蔬产品，可提高产品的抗氧化能力和降血糖功能。
3、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4具备优良的耐肠胃环境性能，且具有优良的粘附特性，因此可以作为复合功能性益生菌微生态制剂的菌株资源。
4、经测定，FM-LP-M4能显著提高HepG2胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗和糖原生成，显著增加丙酮酸激酶和己糖激酶的活性，并降低甘油三酯的含量。
5、经测定，FM-LP-M4能显著降低H2O2诱导HepG2氧化损伤细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)活性，显著提升HepG2氧化损伤细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶活性(CAT)和还原型谷胱甘肽(GSH)的量，同时降低HepG2氧化损伤细胞中丙二醛(MDA)含量。
6、该菌株于2022年1月17在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCCNO24330，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
五、附图说明
图1 FM-LP-M4 16srRNA系统发育分析
图2 FM-LP-M4菌落图片
图3 FM-LP-M4细胞形态图片
五、具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
1、菌株的筛选
本发明以MRS培养基(固体和液体)为筛选培养基，利用梯度稀释的方法从新疆酸马奶样品中初步分离出乳酸菌35株，通过挑取单菌落划线的方法进行3次分离纯化，获得纯化菌株，根据革兰氏染色、过氧化氢接触酶实验、测定菌株培养液的OD600和pH值，根据上述的结果，筛选出12株生长速度快，菌体密度高且产酸性能优良的乳酸菌菌株。然后在挑取筛选出的12株菌株的单菌落分别接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养16-18h后，4℃条件下8000rpm/min离心5min，分别收集上清和菌体，测定菌株发酵上清液的α-葡萄糖苷酶活抑制率和α-淀粉酶活抑制率抑制活性；菌体用无菌PBS(0.01M pH 6.8)洗3次后，再用PBS重悬，且调整菌体密度为1.01×109CFU/mL，测定菌体细胞的DPPH自由基清除率、总还原力、ABTS自由基清除率、PTIO自由基清除率能力；菌体细胞提取物的方法：将5mL上述调整好的菌体重悬液(1.01×109CFU/mL)超声破碎，超声破碎条件设置为：功率45％，超声5s停5s共超声90min。将超声后的液体以12000rpm离心20min后取其上清，经过0.22μm的滤膜过滤后得到细胞提取物，测定细胞提取物的抗氧化能力和降血糖能力(所选指标同上)。
具体测定方法如下：参照Xicai LI等(Journal of Agricultural and FoodChemistry，2017)的方法测定菌体细胞的PTIO自由基清除能力，参照Xicai LI等(Chemistry central Journal，2012)的方法测定菌体细胞的ABTS自由基清除能力，参照Lee B等(Food cheimistry，2010)测定菌体细胞的DPPH自由基清除率，参照Jeongmin Lee等(J Med Food，2005)和陈晓华(博士论文，2011)中的方法测定菌体细胞还原活性；参照Fangfang Dang等(Food &Function，2018)中的方法测定菌株的α-葡萄糖苷酶活抑制率；参照孙志斌(博士论文，2016)的方法检测菌株的α-淀粉酶活抑制率。
综合各菌株发酵上清液的α-葡萄糖苷酶活抑制率、α-淀粉酶活抑制率；菌体细胞的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除能力，还原力活性和PTIO自由基清除能力以及细胞提取液的抗氧化和降血糖能力，筛选出1株抗氧化功能和降血糖功能都很优良的菌株FM-LP-M4。该菌株的发酵上清液的α-葡萄糖苷酶活抑制率为49.23％、α-淀粉酶活抑制率68.13％；菌体细胞的DPPH自由基清除率75.21％、ABTS自由基清除能力68.65％，还原活性为252.38um/L半胱氨酸当量，PTIO自由基清除率为78.45％，细胞提取液的α-葡萄糖苷酶活抑制率为43.45％、α-淀粉酶活抑制率56.89％、DPPH自由基清除率63.87％、ABTS自由基清除能力53.37％，还原力活性为187.56um/L半胱氨酸当量，PTIO自由基清除率为62.34％。
2、菌株的鉴定
提取FM-LP-M4的基因组，利用16S r DNA通用引物，以基因组为模版进行PCR扩增，扩增出的产物经纯化后送上海生物工程有限公司进行测序。将获得序列在NCBI数据库的核算序列比对(Blast)程序进行比对，比对结果显示FM-LP-M4与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei strain 2716，Accession：MT611729.1)的16S r RNA的相似性高于99％，以MEGA5.10生物学软件进行序列比对和构建系统发育树，采用NeighborJoining法P距离公式进行系统发育分析，并进行1000次重复，鉴定结果显示FM-LP-M4与Lactobacillus paracasei自然聚为一支(图1)；同时，利用持家基因recA对菌株FM-LP-M4进一步鉴定，扩增序列在NCBI数据库中进行序列比对，比对结果显示FM-LP-M4的基因recA与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei partial recA gene forrecombinase A，strain NCFB 151T，Accession：AJ621664.1)序列相似性高达97.62％，因此，FM-LP-M4菌株鉴定为副干酪乳杆菌的新成员。FM-LP-M4在MRS琼脂培养基培养48h后，在平板形成的菌落呈现不规则圆形，且边缘不整齐，有时呈现锯齿状，表面光滑，凸起不明显、乳白色、直径在0.2～0.6mm之间，见图2。采用结晶紫染色法观察FM-LP-M4的菌体形态，菌体呈现杆状，且常多个相连，无芽孢，见图3。
3、FM-LP-M4菌株耐酸、耐胆盐能力、粘附能力测定
菌株的耐酸、耐胆盐能力决定了菌株能否耐受胃酸和肠道胆盐逆境，另外菌株的粘附能力，决定了菌株能够在动物肠道繁殖和定殖的关键，因此，作为益生菌必须具有良好的耐酸、耐胆盐和优良的粘附能力。因此研究了FM-LP-M4菌株的耐酸、耐胆盐和粘附能力。
以2％的接种量分别接种pH为2.0和3.0的MRS培养基中和牛胆汁盐含量分别为0.3％(w/v)的MRS培养基中，4h后采用平板培养法测定菌体密度。
利用体外Caco-2细胞黏附模型可评价FM-LP-M4的黏附能力。经革兰氏染色后，在显微镜下可观察到Caco-2细胞表面有明显附着的乳酸菌菌体。采用Rosenberg等人首次提出并经过Geertsema等人改进的微生物黏附碳氢化合物法(Math)进行测定FM-LP-M4细胞表面疏水性(Journal of Microbiological Methods，1993)，采用Kos和Pan等人改进的方法进行乳酸菌自凝集能力的测定(Journal of Applied Microbiology，2010)。
结果显示FM-LP-M4具有很强的耐酸和耐胆盐能力，在pH 2环境下，其4h后存活率为28.56％以上；在牛胆汁盐含量为0.3％(w/v)的MRS中，其4h后存活率为58.69％以上，表明FM-LP-M4具有优良耐酸和耐胆盐能力。
Caco-2细胞黏附模型结果显示，FM-LP-M4在Caco-2细胞上黏附数在43个/cells以上。
FM-LP-M4的细胞表面疏水性和自凝集能力的结果表明，根据Rodríguez C等疏水性判定标准(Anaerobe，2011)：强疏水性(60％＜H％＜100％)、中疏水性(30％＜H％＜59％)和弱疏水性(0％＜H％＜29％)，FM-LP-M4在氯仿中疏水值为高于45％，属于中度疏水性。FM-LP-M4的自凝集率为54.68％。
4、FM-LP-M4细胞提取物对HepG2胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗及糖原合成的影响
挑取单菌接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养16-18h后，取5mL培养液4℃条件下8000rpm/min离心5min，收集菌体，用无菌PBS(0.01M pH 6.8)洗3次后，再用PBS重悬，且调整菌体密度为5.01×108CFU/mL，FM-LP-M4细胞提取参照前面的实验中的步骤制备，用无菌水定容至5mL。HepG2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下静置培养，细胞铺满瓶底80％以上，取对数生长期细胞进行实验。利用经0.4mmoL/L棕榈酸诱导和1×10-6mmoL/L胰岛素抵抗浓度制备细胞HepG2胰岛素抵抗模型，检测FM-LP-M4细胞提取物对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗及糖原合成的影响，将细胞分为正常组、模型组、不同量细胞提取物组处理组(添加量分别加入2％、3％、4％、5％，每组n＝6)。利用96孔板，实验流程为：接板→培养12h→饥饿12h→棕榈酸诱导24h→胰岛素抵抗24h→样品处理24h。实验结束后按照葡萄糖消耗量和糖原试剂盒说明，评估细胞的葡萄糖消耗和糖原含量。具体结果见表1，结果显示，与IR组相比，加入FM-LP-M4细胞提取物不同剂量组的细胞葡萄糖的消耗量呈现不同程度的增加(p＜0.05)，且糖原合成量也呈现不同程度的增加(p＜0.05)，葡萄糖消耗和糖原含量的结果表明，FM-LP-M4细胞提取物可以改善IR-HepG2细胞的胰岛素抵抗状态，且改善效果呈现剂量依赖性，能够促进细胞对糖的吸收，具有明显的降糖功能。
表1 FM-LP-M4细胞提取物对HepG2胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗及糖原合成的影响
注：结果为平均值±标准偏差；同列不同字母表示有显著性差异(p＜0.5)，下表同
5、FM-LP-M4细胞提取物对胰岛素抵抗细胞丙酮酸激酶、己糖激酶活性和甘油三脂的影响：
参照实施方案4，采用6孔板培养及处理细胞，培养结束后取出6组细胞，分别以1000r/min离心10min，然后收集沉淀物并与1mL的PBS混合。采用超声破碎细胞，破碎条件：功率45％，工作10s停5s共超声90s；采用丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)试剂盒、己糖激酶(hexokinase，HK)和甘油三脂试剂盒分别测定细胞的三个指标。结果见表2，结果表明，经FM-LP-M4细胞提取物处理可以改善HepG2细胞的胰岛素抵抗状态，提高抵抗HepG2细胞的丙酮酸激酶和己糖激酶的活性，并降低甘油三酯的含量，表明FM-LP-M4具有明显的降糖功能。
表2 FM-LP-M4细胞提取物对HepG2胰岛素抵抗细胞丙酮酸激酶、己糖激酶活性和甘油三酯含量的影响
6、FM-LP-M4细胞提取物对HepG2氧化损伤细胞的修复作用
FM-LP-M4细胞提取物采用前面实例中方法，HepG2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、含5％CO2、饱和湿度条件下静置培养，细胞铺满瓶底80％以上，取对数生长期细胞进行实验。参照金明等(中国公共卫生，2015)的操作方法进行制备HepG2细胞的氧化应激损伤模型细胞，根据细胞抑制率、细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)含量和肝细胞中SOD活性和MDA含量等多种指标，最终选择氧化损伤细胞模型制备条件为350μmol/L H2O2作用4h。将对数生长期的细胞接种于培养板或培养皿中，随机进行分组：①正常对照组：与其他组同时换为新鲜培养基继续培养。②H2O2损伤组：换新鲜培养基，然后加入H2O2溶液，损伤结束后弃去原上清液，用PBS洗涤细胞两次，加入新鲜培养基。③处理组：H2O2损伤前12h加入不同剂量的FM-LP-M4细胞提取物，后续处理同H2O2损伤组。实验结束后按照采用南京建成生物科技公司的试剂盒测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和谷丙转氨酶(ALT)含量，并测定肝细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)，同时检测肝细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量。具体结果见表3，从表中结果可以看出，利用350μmol/L H2O2作用4h，可以获得可靠的HepG2氧化损伤细胞，利用不同含量的FM-LP-M4细胞提取物处理损伤模型细胞可以缓解和修复损伤模型细胞的氧化应激状态，在所选的剂量范围内，随着剂量的增多，修复效果越好。因此，FM-LP-M4对细胞的氧化损伤有修复作用，进一步说明，FM-LP-M4具有优良的抗氧化能力，可以利用在抗氧化功能益生菌发酵产品及益生菌剂产品的开发与生产中。
表3 FM-LP-M4细胞提取物对HepG2氧化损伤细胞的修复作用
7、FM-LP-M4菌株的安全性初步评价
乳酸菌的安全性评价是商业化利用的前提条件，因此对FM-LP-M4菌株是否产生物胺、抗药性、溶血特性、是否存在质粒、有害代谢产物检测等进行安全性进行初步测定。采用药敏纸片(链霉素、氨苄西林、万古霉素、四环素、氯霉素、庆大霉素、利福平、多粘菌素、青霉素G、环丙沙星和红霉素)扩散法进行药敏试验，以大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控标准菌；采用TIANGEN质粒小提试剂盒提取质粒；参照Argyri A A等(Food Microbiology，2013)文献中方法测定菌株的溶血特性；参照文献Bover-Cid S等(International Journal of Food Microbiology，1999)文献中方法检测菌株产生物胺情况；参照王梦姣等(食品科学，2014)的方法测定菌株的产硝基还原酶活性；采用含有5mg/L直接蓝71的固体培养基测定菌株产偶氮还原酶能力；对FM-LP-M4菌株进行吲哚实验。
结果显示，FM-LP-M4菌株的溶血型是γ-型，不具有溶血活性；吲哚实验、硝酸盐还原酶实验、氨基脱羧酶实验均为阴性，因此FM-LP-M4在代谢活动中不产生有害代谢产物；菌株对实验所选药品中的万古霉素、链霉素和庆大霉素具有抗性，但未检测到可转移的耐药质粒。因此，FM-LP-M4安全性能高，可作为降血糖和抗氧化复合功能发酵产品的发酵剂和微生态制剂的优良菌株资源。
8、FM-LP-M4在复合功能乳制品产品开发中的应用-以发酵牛乳为例
配制含有12％的脱脂牛奶粉和8％的蔗糖的溶液，105℃灭菌10min，冷却至37℃左右，分为FM-LP-M4、商业的酸奶发酵剂、商业酸奶发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)和FM-LP-M4混合接种三个处理，其中商业酸奶发酵剂和FM-LP-M4混合接种处理的之间的菌体量比例为1∶1∶1。接种之后置于40-42℃条件下发酵，凝乳后，90℃处理10min，离心取上清，水相膜过滤后测定酸奶上清液对α-淀粉酶活抑制率、α-葡萄糖苷酶活抑制率、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清率进行测定，并组织专业技术人员15名对发酵酸奶感观评定，具体结果见表4。从表中可以看出，FM-LP-M4能显著提高酸奶的抗氧化活性和降血糖活性，感官评分显示，FM-LP-M4与商业发酵剂混合发酵感官评分与纯商业发酵剂的感官评分没有显著差异，因此可以作为复合功能益生菌添加到酸奶发酵之中，进而提高发酵酸奶的抗氧化和降血糖功能。
表4 FM-LP-M4发酵牛奶对其降血糖功能活性、抗氧化活性及感官的影响
9、FM-LP-M4在降血糖发酵果蔬汁产品开发中的应用-以发酵草莓汁为例
购买新鲜草莓(红颜)，洗净后去皮加入20％的水打浆，加入0.05-0.1％复合果胶酶在45-50℃条件下酶解2-3h，然后离心取上清，加入5％的蔗糖，巴氏灭菌后(80℃，15s)后，迅速冷却至35℃左右，按照0.02-0.04％的量接种FM-LP-M4冻干菌粉，接种之后置于30-35℃条件下发酵48-72h，离心取上清，水相膜过滤后对发酵上清液对α-淀粉酶活抑制率、α-葡萄糖苷酶活抑制率、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清率进行测定，并组织专业技术人员10名对发酵草莓汁进行感观评定，具体结果见表5。从表中可以看出，经FM-LP-M4发酵的草莓汁的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、α-淀粉酶活抑制率和α-葡萄糖苷酶活抑制率显著提升，且发酵结束的草莓汁口感良好，感官评分达到90以上。结果表明FM-LP-M4能显著提高发酵果草莓汁的抗氧化和降血糖功能，因此可以作为降血糖和抗氧化复合功能发酵果蔬汁的可靠菌株资源。
表5 FM-LP-M4发酵草莓汁对其抗氧化和降血糖功能活性及感官的影响
10、FM-LP-M4制备抗氧化和降血糖功能菌粉
挑取FM-LP-M4单菌落接种于8mL MRS液体培养基中，在37℃培养箱中培养18h的条件经过3次活化复壮后，然后按照6％的接种量接种5L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH 6.8和条件下培养18h。之后在离心收集菌体(8000r/min、4℃，用无菌磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.0)漂洗菌体2次，即可得到FM-LP-M4菌泥。
复合冻干保护剂配方：脱脂乳粉220g/L、海藻糖55g/L、甘油10g/L、谷氨酸钠50g/L，水作为溶剂，于110℃灭菌备用。
将上述制备的FM-LP-M4菌泥按1∶6的比例与保护剂溶液充分混匀。于-80℃条件下预冻2h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18～20h后，即可得到FM-LP-M4菌粉。利用平板基数法测定所得菌粉中的活菌数高于8.01×1011CFU/g。通过SEM观察，添加此复合保护剂的菌体细胞表面光滑平整，几乎无皱缩。将菌粉置于-20℃保藏，保藏半年后，菌体活性仍能保持在85％以上。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (5)
1.一株来源于酸马奶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4，该菌株于2022年1月17在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCCNO.24330。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4，同时具备优良的降血糖和抗氧化功能。
3.权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4，具有生长速度快、产酸速度快、耐酸耐胆盐、粘附性强且安全性能优良等特性。
4.权利要求1-3所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4，在制备具有降血糖和抗氧化复合功能的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是：具有抗氧化和降血糖功能的产品中包含副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)FM-LP-M4的活菌制剂或菌株代谢产物或细胞提取物。
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