CN117925851A - 一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性pcr鉴别方法 - Google Patents
一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性pcr鉴别方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925851A CN117925851A CN202410026895.XA CN202410026895A CN117925851A CN 117925851 A CN117925851 A CN 117925851A CN 202410026895 A CN202410026895 A CN 202410026895A CN 117925851 A CN117925851 A CN 117925851A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- precipitate
- buffalo horn
- supernatant
- centrifuge tube
- identifying
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000004415 Burchellia bubalina Nutrition 0.000 title claims abstract description 60
- 240000008537 Burchellia bubalina Species 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 20
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 16
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 16
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241001416153 Bos grunniens Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 3
- 101100329008 Artemia franciscana COI gene Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000594310 Randia aculeata Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000271039 Agkistrodon Species 0.000 description 1
- 241001247317 Bos mutus Species 0.000 description 1
- 241000283698 Bubalus Species 0.000 description 1
- 241000030939 Bubalus bubalis Species 0.000 description 1
- 241000272074 Bungarus Species 0.000 description 1
- 101150087323 COI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283705 Capra hircus Species 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 229920000832 Cutin Polymers 0.000 description 1
- 101710091265 Cytochrome c oxidase subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030878 Cytochrome c oxidase subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010012218 Delirium Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000015220 Febrile disease Diseases 0.000 description 1
- 208000034507 Haematemesis Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]undecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，该方法采用引物SN1，正向：CATAATTGGGGGATTTGGC和反向：GGCGGTGATTATTACGGAT对水牛角DNA进行扩增，得到鉴别水牛角的特异性鉴别条带；本发明建立的方法可为快速鉴别水牛角提供一种有效的辅助手段，同时也为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了一个新的途径，对保障水牛角药材的临床用药安全具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，主要涉及一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法。
背景技术
水牛角为牛科动物水牛Bubalus bubalisLinnaeus的角，具有清热凉血，解毒，定惊的功效，多用于治疗温病高热，神昏谵语，发斑发疹，吐血衄血，惊风，癫狂等疾病，最早记载于《名医别录》：“可疗时气寒热头痛”。作为中国传统的动物药，水牛角与其浓缩粉可作为犀角的代用药用资源，逐渐应用于中药制药行业和中医临床治疗中。而近年来随着水牛养殖规模的逐渐缩小，水牛角资源日益紧缺，市场中常有用牦牛角或者其他动物角类样品混作水牛角进行销售的情况，因此建立一种快速准确地鉴定水牛角的方法显得尤为重要。
随着生物技术的不断发展，特异性聚合酶链式反应(PCR)已广泛应用于中成药及其配方颗粒的真伪鉴定中。2020年版《中国药典》收载了分子生物学检查法1001“聚合酶链式反应法”，并且此技术已用于金钱白花蛇乌、梢蛇、蕲蛇等动物药材的鉴定。与传统鉴别方法相比，DNA分子鉴定方法具有稳定强、特异性好的特点，受到了众多中药质量研究人员的普遍关注。
发明内容
发明目的：单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化，引起的DNA序列多样性。通过分析SNP位点设计出具有物种特异性的引物，再经过PCR反应扩增出目标条带，可以快速准确地实现物种鉴别。本发明通过对水牛、黄牛、牦牛、山羊等动物的动物细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)序列进行比对分析，寻找差异性SNP位点，设计针对于水牛角的特异性鉴别引物，使水牛角经PCR扩增后出现特异性条带，其它伪品无对应条带产生，从而建立水牛角的位点特异性PCR鉴别方法，为完善水牛角的质量控制体系提供一种新思路。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，采用以下SN1、SN2和SN3三组引物对水牛角DNA进行扩增，得到鉴别水牛角的特异性鉴别条带；
作为优选方案，以上所述的适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，退火温度为60℃、循环次数32次、引物用量为20μLPCR反应体系中正向引物和反向引物各加入0.8μL、DNA模板量为20μL体系中加入100ng DNA模板量、DNA聚合酶用量为20μL体系中加入0.2μL的HieffPlus High-Fidelity DNAPolymeraseDNA聚合酶。
作为优选方案，以上所述的适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，PCR反应程序为：95℃预变性3min，重复扩增循环32次，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，72℃彻底延伸5min。
作为优选方案，以上所述的适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，水牛角DNA提取方法为：
称取水牛角100mg粉末放于2mL离心管中，加入800μL 55℃预热的CTAB沉淀液和10μL蛋白酶K，涡旋振荡后放于55℃温水浴加热2h；冷却至室温后，加入800μL体积比24﹕1的氯仿-异戊醇溶液，涡旋振荡，以4℃12000r/min离心10min；小心吸取上清液约600μL，加入新的2mL离心管中，加入600μL体积比24﹕1的氯仿-异戊醇溶液，涡旋振荡，以4℃，12000r/min离心10min；再取上清液500μL于1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，于-20℃静置60min；之后以12000r/min离心5min，可见离心管底部有少量白色沉淀，小心吸取上清液并弃去，先用75％乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤1次，以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加ddH2O 30μL使溶解，置-20℃保存。
本发明筛选得到的引物SN1，正向：CATAATTGGGGGATTTGGC和反向：
GGCGGTGATTATTACGGAT在作为鉴别水牛角试剂中的应用。
一种鉴别水牛角的试剂盒，该试剂盒包括引物SN1，正向：CATAATTGGGGGATTTGGC和反向：GGCGGTGATTATTACGGAT。
有益效果：本发明基于水牛和黄牛、牦牛、山羊等动物的COⅠ序列差异，设计出水牛特异性鉴别引物，并对影响PCR反应的各种相关因素进行了考察和优化，最后采取最佳鉴别条件进行了方法学适用性考察，水牛角样品中均在358bp出现单一条带，其余伪品均无此条带。本发明建立了一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，为快速鉴别水牛角提供了一种有效的辅助手段，同时也为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了一个新的途径，对保障水牛角药材的临床用药安全具有重要意义。
附图说明
图1退火温度对水牛角鉴别结果的影响(M.GoldBand 100bp plus DNA Ladder；1～2水牛角；3～4黄牛角；5～6牦牛角；7～10山羊角；N.阴性对照，以ddH2O为模板)。
图2为PCR反应循环次数对水牛角鉴别结果的影响；
图3为DNA模板量对水牛角鉴别结果的影响；
图4正反引物对用量对水牛角鉴别结果的影响；
图5DNA聚合酶用量对水牛角鉴别结果的影响；
图6不同类型DNA聚合酶对水牛角鉴别结果的影响；
图7不同PCR仪器对水牛角鉴别结果的影响；
图8水牛角及其伪品的PCR鉴别。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何更改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
1、材料
1.1、试剂
琼脂糖(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，10208ES60)；YeaRedNucleic AcidGel Stain(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，10202ES76)；Tris乙酸盐EDTA缓冲液(50×TAE)(上海碧云天生物技术有限公司，ST716)；GoldBand 100bp plus DNA Ladder(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，10516ES60)；2×Max Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，P515-02)；Hieff/>Plus High-Fidelity DNAPolymerase(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，10153ES60)；2×Taq Plus PCR Mix(天根生化科技(北京)有限公司，KT205-01)；引物为上海生工生物科技有限公司合成。
1.2、仪器
Biorad C1000 Touch型PCR仪(BIO-RAD)；Gene Touch Plus型PCR仪(杭州博日科技股份有限公司)；Thermo Labserv型PCR仪(Thermo Fisher Scientific)；MastercyclerGradient型PCR仪(Eppendorf)；GelDoc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD)；LEGEND MICRO 21R冷冻型微量台式离心机(Thermo Fisher Scientific)；Tanon HE-120水平电泳槽(上海天能科技有限公司)
1.3、样品
样品收集于广东、安徽、云南、广西、河南等地，共计22批，其中包括水牛角14批，黄牛角2批，牦牛角2批，山羊角4批，样品具体信息见表1。
表1样品来源信息
。
2、方法
2.1、引物设计
从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Nucleotide Database下载水牛Bubalusbubalis、黄牛Bos taurus、牦牛Bos mutus、山羊Capra hircus共41份线粒体基因组DNA序列(表2)，以水牛作为比较对象，使用MEGA 11针对其COⅠ基因序列进行多重比对，筛选并分析SNP位点。接着以水牛线粒体基因组序列MT186742.1为特异性引物设计参照，最终选取三个特异性SNP位点，并将SNP位点置于引物3’的最末端，共设计出3组水牛角特异性引物对，其正反序列如表3所示。将设计好的引物对导入Oligo 7分析其物理特性，并修正引物中存在的二聚体和发夹结构，最后将设计成功的引物交由上海生工生物科技有限公司进行合成。
表2各类样品线粒体基因组DNA序列
2.2、DNA提取
使用超纯水清洗各类角质样品表面，之后用75％乙醇擦拭干净，待样品表面乙醇挥干后，使用骨钻、刮刀等工具取少量样品于研钵中，加入适量液氮，充分研磨使成均匀粉末。称取约100mg粉末放于2mL离心管中，加入800μL 55℃预热的CTAB沉淀液和10μL蛋白酶K，涡旋振荡后放于55℃温水浴加热2h。冷却至室温后，加入800μL氯仿-异戊醇(体积比24﹕1)溶液，涡旋振荡，以4℃12000r/min离心10min。小心吸取上清液约600μL，加入新的2mL离心管中，加入600μL的氯仿-异戊醇(体积比24﹕1)溶液，涡旋振荡，以4℃，12000r/min离心10min。再取上清液500μL于1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，于-20℃静置60min。之后以12000r/min离心5min，可见离心管底部有少量白色沉淀，小心吸取上清液并弃去，先用75％乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤1次，以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加dd H2O 30μL使溶解，置-20℃保存。
2.3、引物筛选
对表3中的引物对进行筛选，分别使用3条设计的水牛特异性引物对进行PCR反应。在Biorad C1000 Touch型PCR仪上进行PCR反应。PCR总反应体系为20μL，其中包括2×RapidTaq Master Mix 10μL，基因组DNA模板量100ng，正反引物对各0.8μL(10μmol·L-1)，加ddH2O补足至20μL。初始的PCR反应参数设置为：95℃预变性3min，重复扩增循环30次(95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s)，72℃彻底延伸5min。PCR反应结束后，放于4℃冰箱保存，之后取5μLPCR产物，加入1μL 6×Loadingbuffer，混匀后用YeaRed NucleicAcid GelStain染色的2％琼脂糖凝胶电泳检测，电压140V，时间35min，最后将凝胶至凝胶成像仪中观察结果。
表3引物信息
由表3的实验结果表明，引物组SN2和SN3对非目标品种产生杂带，引物组SN1对非目标品种不会产生条带，因此，最终选择引物组SN1用于样品DNA扩增。为获得较好的鉴别结果，后续对PCR反应条件进行方法学优化，分别考察退火温度、循环次数、引物用量、DNA模板量、DNA聚合酶用量、DNA聚合酶种类、不同PCR仪对PCR反应的影响。
3、结果与分析
3.1、PCR鉴别条件
3.1.1退火温度
分别设置退火温度为56℃、58℃、60℃、62℃，使用水牛角特异性鉴别引物SN1进行对所有样品进行PCR扩增，结果表明在退火温度为56℃时，因退火温度过低，不能产生阳性条带；退火温度在58℃和60℃时，水牛角均能扩增得约358bp的条带，伪品和阴性对照在此范围内均未扩增；退火温度为62℃时，因退火温度过高，部分伪品有弱扩增出现假阳性条带，综合以上结果确定PCR反应的最佳退火温度为60℃(图1)。
3.1.2循环次数
分别选用PCR循环次数为26次、29次、32次、35次进行考察，结果表明循环次数为26次和29次时产生的条带亮度较弱，循环次数为32次和35次时，水牛角均能扩增得约358bp的亮带(图2)。但当循环次数为35次时，部分伪品有微弱扩增并出现假阳性条带，为保证结果的稳定性和准确性，因此选择循环次数为32次作为PCR反应的最优条件。
3.1.3DNA模板量
为考察20μLPCR反应体系中所需合适的DNA模板量，分别设置加入15ng、50ng、100ng、150ng作为DNA模板用量。结果表明，随着DNA加入量逐渐增多，特异性条带越来越明显，但当DNA模板用量低于50ng，条带亮度不明显(图3)，为保证实验方法的经济性并减少DNA样品损耗，最终选择20μL体系中加入100ng DNA模板量作为最优DNA模板量。
3.1.4鉴别引物用量
首先将引物干粉加入适量灭菌蒸馏水配制到浓度均为10μmol·L-1，之后在20μLPCR反应体系中分别加入0.2μL、0.4μL、0.8μL、1.6μL，对引物用量进行了考察。结果表明随着引物加入量的减少，水牛角特异性条带亮度明显减弱，在引物加入量为0.2μL时，条带完全消失，不能进行水牛角特异性鉴别，因此选择正向引物和反向引物各加入0.8μL为最佳用量(图4)。
3.1.5DNA聚合酶用量
为考察DNA聚合酶用量的多少对PCR反应的影响，在20μLPCR反应体系中分别加入不同体积的HieffPlus High-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增。结果表明，DNA聚合酶加入量为0.05μL时，水牛角扩增条带亮度不明显，随着聚合酶浓度提高，DNA条带亮度逐渐加深，当DNA聚合酶加入量为0.4μL时，部分伪品产生了微弱的假阳性条带(图5)。因此最终选择20μL体系中加入0.2μL的Hieff/>Plus High-Fidelity DNAPolymerase作为最佳DNA聚合酶用量。
3.2耐受性考察
3.2.1不同类型DNA聚合酶考察
分别使用HieffPlus High-Fidelity DNA Polymerase，/>MaxMaster Mix和2×Taq Plus PCR Mix进行PCR扩增试验，琼脂糖凝胶成像结果显示，不同厂家品牌的DNA聚合酶因其种类与酶活力存在差异，最终经PCR反应扩增产生的条带亮度也不尽相同(图6)，但均能将水牛角样品与其他常见伪品相区分。
3.2.2不同型号PCR仪考察
为测试不同型号PCR仪对水牛角及其伪品鉴别结果的影响，分别使用4种不同型号的PCR仪进行扩增，考察试验方案的耐受性。结果表明，Biorad C1000Touch型、Gene TouchPlus型和Thermo Labserv型PCR仪均可得到预期的鉴定结果，使用EppendorfMastercyclerGradient型PCR仪进行水牛角特异性PCR鉴别时，部分伪品出现微弱扩增条带(图7)。因此在使用EppendorfMastercycler Gradient型PCR仪进行位点特异性PCR鉴别试验时，应当对PCR反应的退火温度和循环次数进行微调，进行条件优化和方法确认。
根据上述实验结果，最终确定水牛角位点特异性PCR鉴别的最优实验方案为：PCR反应体系(20μL)包含基因组DNA提取物100ng，HieffPlus High-FidelityDNAPolymerase 0.2μL，/>Plus PCRbuffer(含Mg2+，dNTPs)10μL，正反引物对各0.8μL(10μmol·L-1)，dd H2O补足至20μL。PCR反应程序为：95℃预变性3min，重复扩增循环32次(95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s)，72℃彻底延伸5min。
3.3适用性考察
为考察不同产地和饲养条件下的水牛角检出的一致性，以及所建立鉴别方法的科学性和可行性，本发明对来自全国不同产地的14批水牛角药材成品、2批黄牛角样品、2批牦牛角样品、4批山羊角样品，使用水牛角特异性鉴别引物组SN1按上述优化后的条件进行PCR扩增，取扩增后的产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，各产地水牛角经DNA提取后，基因组DNA均能扩增出358bp的特异性鉴别条带，其余8种伪品无条带产生(图8)，说明本发明所建立的方法具有广泛的适用性，可用于水牛角的真伪鉴别。
Claims (7)
1.一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，其特征在于，采用以下SN1、SN2和SN3三组引物对水牛角DNA进行扩增，得到鉴别水牛角的特异性鉴别条带；
2.根据权利要求1所述的适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，其特征在于，退火温度为60℃、循环次数32次、引物用量为20μLPCR反应体系中正向引物和反向引物各加入0.8μL、DNA模板量为20μL体系中加入100ng DNA模板量、DNA聚合酶用量为20μL体系中加入0.2μL的HieffPlus High-Fidelity DNAPolymeraseDNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃预变性3min，重复扩增循环32次，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，72℃彻底延伸5min。
4.根据权利要求1所述的适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，其特征在于，水牛角DNA提取方法为：
称取水牛角粉末放于离心管中，加入预热的CTAB沉淀液和蛋白酶K，涡旋振荡后放于温水浴加热；冷却至室温后，加入氯仿-异戊醇溶液，涡旋振荡，离心；小心吸取上清液，加入新的离心管中，加入氯仿-异戊醇溶液，涡旋振荡，离心；再取上清液于离心管中，加入异丙醇，低温静置；之后离心，小心吸取离心管上清液并弃去，取离心管底部的沉淀，先用乙醇洗涤沉淀，再用无水乙醇洗涤，离心，弃上清液，对沉淀孵育，待乙醇挥发后，加dd H2O使溶解，低温保存。
5.根据权利要求4所述的适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性PCR鉴别方法，其特征在于，水牛角DNA提取方法为：
称取水牛角100mg粉末放于2mL离心管中，加入800μL 55℃预热的CTAB沉淀液和10μL蛋白酶K，涡旋振荡后放于55℃温水浴加热2h；冷却至室温后，加入800μL体积比24﹕1的氯仿-异戊醇溶液，涡旋振荡，以4℃12000r/min离心10min；小心吸取上清液约600μL，加入新的2mL离心管中，加入600μL体积比24﹕1的氯仿-异戊醇溶液，涡旋振荡，以4℃，12000r/min离心10min；再取上清液500μL于1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，于-20℃静置60min；之后以12000r/min离心5min，小心吸取离心管上清液并弃去，取离心管底部的沉淀，先用75％乙醇洗涤沉淀，再用无水乙醇洗涤，以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加dd H2O 30μL使溶解，置-20℃保存。
6.引物SN1，正向：CATAATTGGGGGATTTGGC和反向：
GGCGGTGATTATTACGGAT在作为鉴别水牛角试剂中的应用。
7.一种鉴别水牛角的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括引物SN1，正向：CATAATTGGGGGATTTGGC和反向：GGCGGTGATTATTACGGAT。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410026895.XA CN117925851A (zh) | 2024-01-09 | 2024-01-09 | 一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性pcr鉴别方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410026895.XA CN117925851A (zh) | 2024-01-09 | 2024-01-09 | 一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性pcr鉴别方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925851A true CN117925851A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90760723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410026895.XA Pending CN117925851A (zh) | 2024-01-09 | 2024-01-09 | 一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性pcr鉴别方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925851A (zh) |
-
2024
- 2024-01-09 CN CN202410026895.XA patent/CN117925851A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3998352A1 (en) | Detection technology system for enriching low-abundance dna mutation on the basis of nuclease-coupled pcr principle and application thereof | |
| JP2001519672A (ja) | 多重拮抗逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用して遺伝子発現を定量的に測定する方法 | |
| CN112176076B (zh) | 一种与山羊生长性状相关的nfat5基因分子标记及其应用 | |
| CN107841566B (zh) | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 | |
| CN108342464A (zh) | 一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法 | |
| CN108753952A (zh) | 一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 | |
| CN117363750A (zh) | 一种可用于民猪选育的15k液相芯片制备方法及基因分型方法 | |
| CN110878376B (zh) | 用于鉴定霍山石斛的ssr分子标记引物及其应用 | |
| CN117925851A (zh) | 一种适用于水牛角真伪鉴别的位点特异性pcr鉴别方法 | |
| CN111518896A (zh) | 用于检测尼古丁依赖相关的snp位点的引物组、应用、产品及方法 | |
| CN108531598B (zh) | Ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
| CN106755330B (zh) | 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用 | |
| CN112592972B (zh) | 弥漫性毒性甲状腺肿易感基因的早筛方法及试剂盒 | |
| CN114196740A (zh) | 用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒 | |
| CN114717303A (zh) | 基于多重pcr及高通量测序技术检测成骨不全症相关基因的引物组、试剂盒及应用 | |
| CN110857451B (zh) | 一种检测复发性流产的微缺失或/和微重复的引物组合、mlpa探针、基因芯片及试剂盒 | |
| CN113930485A (zh) | 一种检测基因拷贝数变异的试剂及其应用 | |
| CN112779322A (zh) | 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用 | |
| CN108060233B (zh) | 30个y染色体str基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用 | |
| CN106520973B (zh) | 一种对男性个体进行快速y-str分型的方法和系统 | |
| CN110468197A (zh) | 一种aldh2基因g1510a多态性快速分析检测试剂盒及方法 | |
| CN110129432A (zh) | 一种个体化用药相关基因多态性的检测方法 | |
| CN110272987A (zh) | 一种mthfr基因c677t位点快速分型检测试剂盒及方法 | |
| CN111560422A (zh) | 一种靶向测序试剂盒和方法 | |
| CN114763575B (zh) | 人pole基因突变的新型测定方法及试剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |