CN117925732A - 一种制酒精湿玉米副产物发酵制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制酒精湿玉米副产物发酵制剂及其应用，涉及微生物发酵生产饲料技术，所述制酒精湿玉米副产物发酵制剂是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BC10113作为菌种，以制酒精湿玉米副产物作为发酵基质，经发酵处理后获得。本发明将制酒精湿玉米副产物发酵制剂掺入肥育猪的基础日粮中，经研究发现，在肥育猪饲料中添加制酒精湿玉米副产物发酵制剂能够在不影响肥育猪生长性能的同时促进了猪肉中重金属的降解，从而为枯草芽孢杆菌在猪的无公害生产上的应用提供了参考。
Description
技术领域
本发明涉及的是微生物发酵生产饲料技术领域，尤其涉及的是一种针对制酒精湿玉米副产物的资源化利用，即利用枯草芽孢杆菌菌株发酵制酒精湿玉米副产物获得发酵制剂，并将发酵制剂应用于肥育猪饲料开发中的应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在猪生产上的应用研究也较为多，主要围绕枯草芽孢杆菌促进猪的生产性能、抗氧化性能、肉品质以及免疫指标展开。在猪的饲料中添加枯草芽孢杆菌可以促进猪的抗氧化能力，提高猪的生长性能及生产性能，并且还能够提高猪的免疫能力，降低猪的腹泻率从而促进猪健康生长。
制酒精湿玉米副产物是以玉米为原料发酵生产酒精后产生的湿态副产物，含有丰富的蛋白、脂肪和有效磷等营养物质，由于其含水量高(70％-85％，鲜样)，运输及烘干成本高。目前其常见的资源化方式是利用微生物发酵直接将制酒精湿玉米副产物进行饲用开发，常用的微生物如酵母菌类、乳酸杆菌类以及芽孢杆菌类等。发酵产物用作动物饲料，可缓解蛋白质饲料缺乏的压力，同时减少抗生素的使用，例如，张光勤等在“湿态酒糟发酵蛋白饲料饲喂蛋鸡效果研究”一文中指出，以玉米为原料，由酵母经过液体深层发酵，提取酒糟浓缩后，由又经混合益生菌(乳酸菌类、多种芽孢杆菌等)发酵获得，用于饲喂蛋鸡能提高饲料利用率提高蛋鸡的生产性能。
基于枯草芽孢杆菌在猪生产上的应用研究，利用枯草芽孢杆菌发酵制酒精湿玉米副产物并将其用作猪饲料也被广泛研究应用，但多集中枯草芽孢杆菌促进猪的生长、生产性能及免疫能力方面的研究，但针对枯草芽孢杆菌促进无公害猪肉生产的研究报道却较少，而目前因猪场消毒措施、疫病防治及抗生素等的使用造成畜产品中重金属残留，危害消费者身体健康的问题也普遍存在，因此，如何限制和有效降低猪肉中重金属残留成为值得认真研究的课题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种制酒精湿玉米副产物发酵制剂及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
本发明的第一个方面，提供了一种制酒精湿玉米副产物发酵制剂，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BC10113作为菌种，以制酒精湿玉米副产物作为发酵基质，经发酵处理后获得。
作为本发明的进一步优化方案，所述制酒精湿玉米副产物发酵制剂的制备方法为，将枯草芽孢杆菌BC10113经液态培养基培养获得种子液，将种子液按发酵基质总质量的12％接种至发酵基质中，翻拌均匀，调整发酵基质的初始含水率为45％，在发酵温度34℃下，发酵60h后，获得发酵产物，将发酵产物经常温风干处理得到所述枯草芽孢杆菌制酒精湿玉米副产物发酵制剂。
本发明的第二个方面，提供了一种如上述任一所述的制酒精湿玉米副产物发酵制剂在制备肥育猪饲料上的应用。
本发明的第三个方面，提供了一种如上述任一所述的制酒精湿玉米副产物发酵制剂在促进肥育猪肌肉、肝脏、肾脏中的重金属降解上的应用。
本发明的第四个方面，提供了一种如上述任一所述的制酒精湿玉米副产物发酵制剂促进肥育猪血清中促胰液素分泌上的应用。
作为本发明的进一步优化方案，所述制酒精湿玉米副产物发酵制剂的掺入量为肥育猪养殖用基础日粮质量的3-9％。
本发明相比现有技术具有以下优点：利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BC10113直接发酵制酒精湿玉米副产物获得发酵制剂，将发酵制剂应用于肥育猪饲料，即将发酵制剂掺入肥育猪的基础日粮中进行肥育猪的饲养，经后续试验研究可知，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌BC10113发酵制酒精湿玉米副产物得到的发酵制剂能够促进肥育猪血清中促胰液素的分泌，利于饲料的消化吸收，在不影响肥育猪平均日增重的同时降低料重比，另外，在降低肥育猪的肌肉、肝脏、肾脏中砷、铅、镉、铜残留量上同样具有显著优势，为枯草芽孢杆菌在猪的无公害生产上的应用提供了参考。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
一、试剂及材料
以下所用的试剂及材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
1号菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BC10113，分离于豌豆蛋白废水，保藏编号为CGMCC No.21218，来源：中粮生物科技股份有限公司。
2号菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-2022，保藏编号为CCTCC NO：M2022073，来源：华中农业大学。
3号菌株为商购枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，购于淘宝，货号为hssw013，生产厂家为湖北回盛生物科技有限公司。
NA液体培养基：即牛肉膏蛋白胨培养基，配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15～20g、水1000ml，pH为7.2～7.4；
二、方法
以下所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法。
1、利用不同菌株发酵制酒精湿玉米副产物
将1号菌株、2号菌株、3号菌株分别接种至NA液体培养基中，在温度37℃、转速100r/min条件下，振荡培养48h，从上述培养好的菌液中，按照2％接种量分别接种到NA液体培养基中，在温度37℃、转速100r/min条件下，振荡培养24h，其活菌数达到108个/mL，得到1号菌株、2号菌株、3号菌株的种子液。
以制酒精湿玉米副产物作为发酵基质，各种子液接种量为发酵基质总质量的12％，翻拌均匀，再调整发酵基质的初始含水率为45％，在发酵温度34℃下，发酵60h后，风干处理即可获得制酒精湿玉米副产物发酵制剂，记为FWCARP-1、FWCARP-2以及FWCARP-3。
2、饲粮中添加不同类型的FWCARP对肥育猪生长性能及生产性能的影响
选取64头质量为(54.64±0.22)kg/头的健康安庆六白猪，随机分为4个组，每组4个重复，每个重复共4头，公母各半，各组初始体重差异不显著(P>0.05)。对照组饲喂基础日粮，试验组分别将FWCARP-1、FWCARP-2以及FWCARP-3以6％比例等能等氮替代基础日粮。
饲养试验在安徽省太湖县程岭黑猪养殖基地进行，试验期60d；试验期间猪只自由采食和饮水，按猪场常规程序消毒免疫，基础日粮参照NRC(1998)和《中国猪饲养标准》(2004)，其营养成分见表1。
表1饲粮组成及营养水平(风干基础)单位：％
注：(1)前期通过预混料为每千克饲粮提供：VA 5000IU，VD3 3000IU，VE 12IU，VK3
1.2mg，VB1 1mg，VB2 4mg，VB6 2mg，VB12 0.02mg，烟酸20mg，叶酸1mg，泛酸9.2mg，乙酰胆碱0.4g，Se 0.33mg，Cu 0.1g，Fe 0.25g，Zn 0.12g，Mn 0.045g，I 0.7mg。
(2)消化能为计算值，其余为实测值。
2.1、饲粮中添加不同类型的FWCARP对肥育猪血清中激素水平的影响
试验结束前一天空腹12h，至次日早上8：00各组随机抽取8头猪，使用EDTA真空抗凝采血管前腔静脉采血2ml，采完血后来回缓慢摇匀，使抗凝剂与血液充分混合，放入约4℃冰盒中；使用非抗凝真空采血管前腔静脉采血约15ml，室温下倾斜放置30min，3500r/min离心10min，将血清分装与1.5mL Ep管中，-20℃保存备用。
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血清中促胰液素(SCT)、胃动素(MTL)、胆囊收缩素(CKK)的含量，测定所用试剂盒购自上海酶联科技有限公司，结果如表2所示。
表2饲粮中添加不同种类的FWCARP对生长肥育猪血清中激素水平的影响
由表2可知，在饲料中添加不同类型芽孢杆菌发酵湿玉米酒精副产物在促进CCK、MTL分泌的作用上不显著。
但是，在促进SCT分泌的作用上，相较于其他菌株，枯草芽孢杆菌BC10113具有显著促进的作用，促胰液素是一种激素，其主要功能是调节血糖水平和促进能量代谢，通常情况下，促胰液素的作用有升高血糖水平、抑制胰岛素分泌、促进肠道吸收葡萄糖、抑制胃排空、促进脂肪分解等，因此可知，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌BC10113发酵湿玉米酒精副产物相较于其他菌株，能更好地调节猪胃肠道活动，利于饲料的消化吸收。
2.2、饲粮中添加不同类型的FWCARP对肥育猪的生长性能的影响
分别在饲养试验开始和结束时禁食12h，对每头猪只逐一称重。记录各组重复的饲料消耗量，计算平均日增重(ADG)和料重比(F/G)，结果如表3所示。
表3饲粮中添加不同种类的FWCARP对肥育猪生长性能的影响
从表3中可以看出，基础日粮+FWCARP-1这一组在提高肥育猪平均日增重及降低料重比上显著优于其他组及对照组，基础日粮+FWCARP-3这一组虽然其平均日增重与基础日粮+FWCARP-1这一组相当，但其料重比显著高于与基础日粮+FWCARP-1这一组。由此可以看出，在饲料中添加枯草芽孢杆菌BC10113发酵湿玉米酒精副产物可提高肥育猪平均日增重的同时降低其料重比，意味着饲料的利用率得到进一步提升。
2.3、饲粮中添加不同类型的FWCARP对肥育猪生产性能的影响
饲养试验结束空腹12h，立即进行屠宰试验，每组选择2头接近平均体重的肥育猪屠宰，采集背最长肌肉样品分装至自封袋密封暂置于4℃条件下保存，随后马上进行屠宰率及瘦肉率的测定。
屠宰率为胴体重(本试验含蹄和尾重)占宰前活重的百分比。
瘦肉率参考李业国等提出的预测模型回归方程进行计算：
Y(瘦肉率)＝57.742-0.5871Xl+0.2023X2；其中，Xl为最后腰椎处背膘厚，X2为臀脊长。
结果见表4。
表4饲粮中添加不同种类的FWCARP对肥育猪生产性能的影响
从表4可以看出，在饲料中添加不同类型芽孢杆菌发酵湿玉米酒精副产物在肥育猪屠宰率的提高上表现并不显著，但基础日粮+FWCARP-1这一组在肥育猪瘦肉率的提高上要优于其他组及对照组，可见，在饲料中添加枯草芽孢杆菌BC10113发酵湿玉米酒精副产物可保证肥育猪屠宰率的同时进一步提高猪肉的瘦肉比例。
2.4、饲粮中添加不同类型的FWCARP对肥育猪肌肉、肝脏、肾脏中重金属残留的影响
取2.3试验部分所屠宰的8头猪的样品，每头猪的肌肉、肝脏、肾脏平行取两个样。并按照国家食品标准(GB/T5009.11-13，15，17，123.2003)食品中砷的测定；食品中铅的测定；食品中铜的测定；食品中镉的测定对样品进行测定。
2.4.1、试样预处理
砷、铅、镉采用湿式消解法：称取试样1.00g左右(每个平行样均为1.00g)于100mL锥形瓶中，放入数粒玻璃珠，加10mL混合酸，加盖浸泡过夜。加一小漏斗在电炉上消解，若变成棕黑色，关火，小心滴加混合酸直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带淡黄色，放冷。将消化液过滤入25mL容量瓶中，用少量水多次洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中。砷单独处理好定容时加入基体改进剂硫脲(50g/L)2.5mL，定容至刻度并混匀，待测；铅、镉同时处理，处理好后加入基体改进剂磷酸铵溶液(20g/L)3μL，定容至刻度并混匀，待测；同时作试剂空白；
铜采用干式消解法：取1.00g捣碎混匀的试样，置于瓷坩锅中，加入1-2mL优级纯硝酸，浸泡1h以上，将坩锅置于电炉上，小心蒸干，炭化到不冒烟为止，转移到高温炉中，550℃恒温2h，取出、冷却后，加数滴浓硝酸(浸湿试样灰为宜)于坩锅内的试样灰中，再转入550℃高温炉中，继续灰化1-2h，到试样呈现白灰状，冷却后从高温炉中取出，用硝酸(体积分数为l％)溶解试样灰，将溶液定量移入10mL容量瓶中，定容至刻度并混匀，待测，同时作试剂空白。
2.4.2、标准曲线的制备
(1)砷标准曲线：取25m1容量瓶6支，依次准确加入1μg/mL砷使用标准液0、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0mL(各相当于砷浓度0、2.0、8.0、20.0、80.0、200.0ng/mL)，各加(1+9)硫酸12.5mL，50g/L硫脲2.5mL，补加水至刻度，混匀测定。得到砷标准曲线为，y＝0.0163x+0.1014，R2＝0.9997。
(2)铅标准曲线：准确吸取铅标准液(500mg/L)分别配制浓度为0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ng/L的标准液，分别置于10mL容量瓶中，分别导入原子吸收分光光度计，记录与铅含量对应浓度吸光度，得到铅标准曲线：y＝0.0065x+0.0032，R2＝0.9971。
(3)镉标准曲线：准确吸取镉标准液(100mg/L)分别配制浓度为0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ng/L的标准液，分别置于10mL容量瓶中，分别导入原子吸收分光光度计，记录与镉含量对应浓度吸光度，得到镉标准曲线：y＝0.0123x+0.0046，R2＝0.993。
(4)铜标准曲线：准确吸取铜标准液(500mg/L)分别配制浓度为0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ng/L的标准液，分别置于10mL容量瓶中，分别导入原子吸收分光光度计，记录与铅含量对应浓度吸光度，得到铜标准曲线：y＝0.0050x+0.0004，R2＝0.999。
2.4.3、结果分析
肥育猪的肌肉、肝脏、肾脏中砷、铅、镉、铜残留量的结果如表5所示。
表5饲粮中添加不同类型的FWCARP对肥育猪肌肉、肝脏、肾脏中重金属残留的影响
从表5中可以看出，基础日粮+FWCARP-1这一组在降低肥育猪的肌肉、肝脏、肾脏中砷、铅、镉、铜残留量的效果上要显著优于其他组及对照组，可见，在饲料中添加枯草芽孢杆菌BC10113发酵湿玉米酒精副产物在降低肥育猪的肌肉、肝脏、肾脏中砷、铅、镉、铜残留量上具有显著优势。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种制酒精湿玉米副产物发酵制剂，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BC10113作为菌种，制酒精湿玉米副产物作为发酵基质，经发酵处理后获得。
2.根据权利要求1所述的一种制酒精湿玉米副产物发酵制剂，其特征在于，所述制酒精湿玉米副产物发酵制剂的制备方法为，将枯草芽孢杆菌BC10113经液态培养获得种子液，将种子液按发酵基质总质量的12％接种至发酵基质中，翻拌均匀，调整发酵基质的初始含水率为45％，在发酵温度34℃下，发酵60h后，获得发酵产物，将发酵产物经常温风干处理得到所述枯草芽孢杆菌制酒精湿玉米副产物发酵制剂。
3.一种如权利要求1-2任一所述的制酒精湿玉米副产物发酵制剂在制备肥育猪饲料上的应用。
4.一种如权利要求1-2任一所述的制酒精湿玉米副产物发酵制剂在促进肥育猪肌肉、肝脏、肾脏中的重金属降解上的应用。
5.一种如权利要求1-2任一所述的制酒精湿玉米副产物发酵制剂在促进肥育猪血清中促胰液素分泌上的应用。
6.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于，所述制酒精湿玉米副产物发酵制剂的掺入量为肥育猪养殖用基础日粮质量的3-9％。
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