CN117919196A - 用于脑靶向型自由基清除纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于脑靶向型自由基清除纳米制剂及其制备方法和应用。本发明通过Fe3+诱导多巴胺快速聚合得到聚多巴胺，并应用工程化的狂犬病毒糖蛋白生物膜(RVG)简单快速的包裹聚多巴胺(nDOP)，得到具有良好分散性、形貌规整均一的聚多巴胺纳米粒子制剂(nDOP‑Fe‑RVG)。本发明证明该纳米制剂具有良好的血脑屏障通透性和神经元靶向作用，能够通过清除自由基、抑制神经细胞凋亡、修复受损血脑屏障、减轻炎症反应和改善神经元线粒体功能从而发挥抗脑缺血损伤的作用，是一种神经保护效果显著的纳米制剂，特别适用于脑部疾病的高效治疗。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是应用工程化的狂犬病毒糖蛋白生物膜(RVG)简单快速的包裹聚多巴胺(nDOP)的制备在治疗脑部疾病中的应用。
背景技术
缺血性脑卒中，主要病理特征是由于葡萄糖和氧气的供应短缺，导致部分脑组织出现明显的应激损伤，血脑屏障(brain-blood barrier，BBB)通透性提升，缺血区域依据病理生理特征可以大致分为核心梗死区域和半暗带(penumbra)区域，主要表现为离子泵失效导致的神经兴奋性毒性、氧化级联反应和炎症反应等。依据《中国急性缺血性脑卒中诊疗指南2018》，急性脑缺血患者可选择的治疗手段包括血管内机械取栓和动脉溶栓治疗。其中机械取栓合并溶栓治疗为首选治疗方式，遵循循证医学，强调个体化特点，主要包括以下常用方案：
Ⅰ级推荐，A级证据：对于静脉溶栓和动脉取栓都无禁忌证的患者，推荐首先采用静脉溶栓治疗，并且不应等待静脉溶栓疗效尽快取栓；对于并发6h内由颈内动脉或者大脑中动脉M1段闭塞患者，可采用ERT。
Ⅱ级推荐，B级证据：对于大脑中动脉M2段闭塞患者采用风险评估下的机械取栓治疗；发病后16-24h并符合DAWN标准的患者可行ERT治疗；对分析获益风险后，可以给予符合的患者进行ERT；具有静脉溶栓禁忌，考虑6h内进行动脉溶栓治疗。
Ⅱ级推荐，C级证据：ERT方法中首先推荐采用血管内机械取栓，不应优先使用动脉溶栓治疗。
Ⅲ级推荐，C级证据：对于并发后6-24h且存在明显临床功能缺损与梗死体积不相符者，应根据影像学和临床经验评估结果采用ERT治疗。
Ⅳ级推荐，C级证据：其他复杂风险评估患者或医疗水平受限条件。
虽然缺血性脑卒中后BBB损伤，但绝大多数小分子药物仍然难以跨越BBB抵达受损的脑组织。此外，临床干预措施主要以预防和早治疗为主，传统的取栓及溶栓治疗不能显著改善血流再通后的氧化应激二次损伤。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供用于脑靶向型自由基清除纳米制剂，其为nDOP-Fe-RVG纳米颗粒；其中，nDOP为聚多巴胺纳米颗粒；RVG为神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白肽；狂犬病病毒糖蛋白肽(RVG)包裹聚多巴胺；Fe负载在RVG包裹的聚多巴胺上。
本发明的目的之二，在于提供用于脑靶向型自由基清除纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：称取70-90mg盐酸多巴胺放置于圆底烧瓶中，缓慢加入100-150ml超纯水，充分溶解；同时加入550-650μL 5-15mg/ml的六水合氯化铁，水浴锅升温至35-45℃后继续加热20-40min；随后向上述溶液中加入80-120mM的Tris盐酸缓冲液30-50ml，继续搅拌加热2-4h；加热完成后，将反应液离心，无水乙醇清洗，将沉淀溶于超纯水中，充分溶解，获得nDOP-Fe；
步骤二：将表达有RVG的BHK-21细胞收集于离心管中，超声破碎处理，进行梯度离心，得到含有囊泡的上清液；
步骤三：将RVG室温下PBS溶解，与nDOP-Fe混合，两者比例为质量比(1.5-2.5)：1超声4-6min，4℃环境孵育过夜，得到nDOP-Fe-RVG。
优选地，步骤二中，梯度离心为：1800-2200rpm离心8-12min，3800-4200rpm离心8-12min，4800-5200rpm离心8-12min。
本发明还提供上述制备方法制备得到的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂。
本发明还提供所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备治疗脑部疾病药物中的用途。
本发明还提供所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备清除自由基药物或减轻炎症反应药物中的用途。
本发明还提供所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备神经元靶向作用药物中的用途。
本发明还提供所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备降低脑缺血后梗死体积药物中的用途。
本发明还提供所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备修复受损血脑屏障药物中的用途。
本发明还提供所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备改善神经元线粒体功能作用药物中的用途。
本发明将工程化的狂犬病病毒糖蛋白肽(RVG)包裹聚多巴胺制备得到新型的纳米制剂(nDOP-Fe-RVG)。
本申请提供的纳米制剂的制备方法，利用RVG短肽，通过组装包裹聚多巴胺纳米制剂，发现此过程可提聚多巴胺药物血脑屏障透过性和脑靶向性，并显著提高药物在心脑血管病变部位的富集效率，从而解决常规治疗制剂透过BBB性差、药物扩散速度较慢、脑部摄取量较低、难以在局部病灶达到治疗所需有效浓度等问题。
本发明所述聚多巴胺可以通过市购获得，也可以通过本领域技术人员自行制备，所述制备方法可采用如实施例中记载方案。
可选地，所述工程化生物膜为狂犬病病毒糖蛋白短肽(RVG)经修饰改造，并通过细胞培养提取所得。
进一步地，将所述聚多巴胺与所述工程化生物膜共投于PBS溶液中，超声5min，4℃环境孵育过夜，即可组装获得用于心脑血管疾病治疗的新型自由基清除纳米制剂(nDOP-Fe-RVG)。
进一步地，所述水溶液包括蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、氯化钠-枸橼酸钠缓冲液、Hank’s缓冲液的一种或几种。进一步地，所述药物中还包含人体可接受的辅料。
进一步地，本发明纳米制剂主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
可选地，所述心脑血管疾病为缺血性脑卒中。
综上，本申请提供的新型自由基清除纳米制剂，与常见技术相比，具有以下优点：
1.本发明涉及的药物聚多巴胺与天然黑色素类似，聚多巴胺可捕获自由基，具有优异的抗炎和抗氧化活性，在多项疾病治疗研究中作为重要的候选药物。
2.采用基因工程技术将能够靶向神经元的RVG实现在BHK细胞膜上过表达，并提取获得RVG短肽，RVG短肽将聚多巴胺纳米颗粒包裹，实现有效跨越血脑屏障透过性，实现对中枢神经系统中神经元的靶向递送，提高治疗的精准性和高效性。
3.本发明发现聚多巴胺通过与神经元铁离子螯和，调控铁离子代谢抑制缺血神经元铁死亡。
附图说明
图1为根据本发明实施例1的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒的表征；其中，A为nDOP纳米颗粒的元素扫描分析图；B为nDOP纳米颗粒的XPS全谱扫描图像；C-F为nDOP纳米颗粒的XPS精细扫描图像；G为nDOP纳米颗粒的红外光谱；H为nDOP纳米颗粒的紫外光谱；I：0、12.5、25、50、100、200μg/mL的nDOP的纳米颗粒溶液在800nm波长下的吸光度；J为nDOP纳米颗粒的光声成像；K为nDOP纳米颗粒的核磁共振图像。
图2为根据本发明实施例2的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒的水合粒径结果、荧光和电镜形貌；其中，L为基因工程在BHK细胞膜表面过表达RVG；M为nDOP-Fe-RVG粒径大小；N为nDOP-Fe-RVG扫描电镜和透射电镜图；O为nDOP-Fe-RVG的Zeta电位。
图3为根据本发明实施例3的不同浓度nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对血红细胞的毒性；
其中，A为加入梯度浓度的纳米药物后血红细胞的状态；B为全波长酶标仪扫描400-600nm波长下的吸光度。
图4为根据本发明实施例4的不同浓度nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对体外细胞的毒性作用和穿透血脑屏障的能力检测；其中，A为神经元细胞在给予梯度浓度的nDOP-RVG纳米颗粒进行预保护6h以及12h后的细胞活性；B为nDOP-RVG纳米颗粒的摄取；C为Transwell小室实验的示意图以及下室的nDOP-RVG纳米颗粒的摄取。
图5为根据本发明实施例5的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对自由基的清除作用；其中，P为采用ABTS方法检测nDOP-Fe-RVG的抗氧化活性；Q为通过DPPH方法检测nDOP-Fe-RVG的抗氧化活性。
图6为根据本发明实施例6的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对脑缺血模型小鼠梗死面积的保护作用；
其中，A为小鼠脑组织的TTC染色；B为nDOP-Fe-RVG改善脑梗死体积的作用。
图7为根据本发明实施例7的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对脑缺血模型小鼠的皮层神经元完整性的保护作用；C为小鼠脑组织的甲苯胺蓝染色。
图8为根据本发明实施例8的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒能够缓解小鼠脑缺血再灌注后的炎症；其中，A为nDOP-Fe-RVG纳米颗粒抑制小鼠脑缺血再灌注后的炎症反应；B为nDOP-Fe-RVG纳米颗粒抑制缺糖缺氧/复氧后神经元细胞的炎症；C为nDOP-Fe-RVG纳米颗粒纳米颗粒抑制缺糖缺氧/复氧后内皮细胞的炎症。
图9为根据本发明实施例9的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒显著减轻小鼠脑缺血再灌注后血脑屏障损伤。其中，D为免疫荧光染色检测脑缺血再灌注模型小鼠缺血半暗带区域紧密连接蛋白CD31/ZO-1、CD31/Occludin和CD31/Claudin5的表达情况；E-G为Western Blot检测脑缺血再灌注模型小鼠缺血半暗带区域的紧密连接蛋白CD31/ZO-1和CD31/Occludin的表达情况。
图10nDOP-Fe-RVG纳米颗粒显著改善神经元线粒体功能作用，其中，A-C为nDOP-Fe-RVG抑制缺血神经元线粒体ROS水平；D-E为nDOP-Fe-RVG提高缺血神经元线粒体膜电位；F-G为nDOP-Fe-RVG抑制缺血神经元铁死亡。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1nDOP-Fe-RVG纳米颗粒的制备
精确称取80.0mg盐酸多巴胺放置于圆底烧瓶中，缓慢加入120ml超纯水，充分溶解；同时加入580μL 10mg/ml的六水合氯化铁，水浴锅升温至40℃后继续加热0.5h；随后向上述溶液中加入100mM的Tris盐酸缓冲液40ml，继续搅拌加热3h；加热完成后，将反应液离心，无水乙醇清洗3次，将沉淀溶于20ml超纯水中，充分溶解，制备nDOP-Fe储存于4℃备用。
稳定表达RVG的BHK-21细胞株的构建
(1)前期准备待转染细胞：将BHK-21细胞通过细胞传代铺入12孔板中，
以十字摇晃法混合均匀，水平放置于37℃细胞培养箱内，间隔固定时段观察细胞生长情况，待生长至70％左右即可进行细胞转染操作。
(2)将待转染细胞的正常培养基更换为无血清DMEM培养基，同时将PEI转染试剂与RVG质粒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)以3：1比例进行混合，缓慢摇晃至混合均匀，转移至37℃细胞培养箱，孵育30min。
(3)静置直至充分结合后，将质粒与转染试剂复合物缓慢滴加至上述无血清培养的BHK-21细胞中，依次同时需要轻轻摇晃细胞培养板，使转染试剂尽量分布均匀。
(4)转染48小时后吸弃原细胞培养基，补入完全培养基。通过荧光显微镜观察RVG靶向肽上GFP标签蛋白在BHK细胞膜上的表达情况，待荧光表达较强时可进行细胞的传代与进一步扩增。
(5)将表达有RVG的细胞(cRVG)消化后培养于100mm培养皿中，同
时培养基中加入4μg/ml嘌呤霉素，进行细胞传代，传代三代左右即可得到能稳定表达RVG的BHK-21细胞株。经过系列实验验证后，可将部分细胞进行冻存处理并冷冻储存于-80℃冰箱。细胞继续传代扩增以进行后续细胞膜提取。
将表达有RVG的BHK-21细胞收集于离心管中，超声破碎处理，进行梯度离心，2000rpm离心10min，4000rpm离心10min，5000rpm离心10min，得到含有囊泡的上清液，15000rpm离心1h；将囊泡重新悬浮于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲溶液中，BCA法测定细胞膜囊泡蛋白浓度。
将RVG室温下PBS溶解，与nDOP-Fe混合，两者的混合比例为质量比2：1，超声5min，4℃环境孵育过夜，得到nDOP-Fe-RVG。
获得的nDOP-Fe-RVG采用透射电子显微镜、扫描电子显微镜、紫外光谱、光声成像、核磁共振氢谱等检测nDOP-Fe-RVG的载铁量和铁信号强度(图1)。
实施例2 nDOP-Fe-RVG纳米颗粒的水合粒径结果、荧光和电镜形貌
将实施例1制得的nDOP-Fe-RVG纳米颗粒利用透射电子显微镜拍摄粒子真实图像，结果显示其为形态均一分散的球形结构，分散均匀、无明显的黏连现象；动态光散射法测定粒径在200nm左右；水合尺寸相较于电镜拍摄图像的尺寸有所增加，粒径呈现正态分布。电位约为-32mV。见图2。
实施例3不同浓度nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对血红细胞的毒性
采用眼眶取血法，用EDTA-2Na预处理的一次性使用输液针刺向C57BL/6小鼠的内眦静脉丛，引流血液至含肝素钠的真空采血管内；将高速微量离心机预冷至4℃，随后将抗凝全血1500rpm离心10min；离心完成后弃去上清液，再加入2mL 0.9％NaCl溶液离心清洗，重复三次，获得干净的血红细胞堆积液；取血红细胞沉淀50μL加入2mL0.9％NaCl，轻轻混匀以备用；接下来分为阳性对照组(ddH2O)、阴性对照组(0.9％NaCl)、nDOP-Fe-RVG纳米制剂组(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、25.0、30.0mg/mL)，将各组药物加入血红细胞悬液，并置于37℃恒温箱孵育2h。拍照记录，随后4℃2500rpm离心10min保留上清；将上述上清液转移至96孔板中，每组设置3个复孔，测定540nm和577nm处的吸光度值。结果显示在所测浓度范围内的药物溶液均未显示出血红蛋白的特征峰，说明nDOP-Fe-RVG不会发生溶血现象，呈现出良好的生物相容性。见图3。
实施例4不同浓度nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对体外细胞的毒性作用和穿透血脑屏障的能力检测
调整细胞状态，消化后稀释以每孔接种3000个细胞为宜，37℃、5％CO2孵育箱孵育12h，待完全贴壁。分别加入各浓度梯度(1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、300.0μg/mL)的nDOP-Fe-RVG纳米药物；在添加药物之后，重新放入孵育箱孵化至6h和12h，取出相应的96孔板，弃去含有药的培养基，每孔加入100μL 10％CCK-8稀释液孵育1h，多功能酶标仪设定450nm处的测定各个复孔OD值。细胞存活率＝(药物组吸光值-基线吸光值)/(对照组吸光值-基线吸光值)×100％。结果显示，nDOP-Fe-RVG纳米制剂浓度在10.0μg/mL，孵育N2a神经元和bEnd.3内皮细胞时间为6h时细胞毒性作用较小(图4A)。
将消化下的bEnd.3内皮细胞离心，弃上清，加入适量预热的细胞培养基(含FBS)重悬混匀，并将细胞混悬液转移至Transwell小室中；待到内皮细胞生长铺满小室底部，能够模拟生理状态下的血脑屏障时，以上述同样的操作在下室铺板N2a神经元细胞和BV2小胶质细胞，一同转入细胞培养箱中培养；用DMED高糖培养基配制nDOP-Fe-RVG(10.0μg/mL)药物，Transwell小室每孔200μL加入上述药物溶液并再进行培养6h，通过向上室给药后检测下室细胞的药物摄取情况，测定纳米药物的血脑屏障渗透性。结果显示nDOP-Fe-RVG纳米药物呈现出良好的血脑屏障渗透性。见图4。
实施例5nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对自由基的清除作用
称取1mg DPPH粉末溶解于24mL95％乙醇中，超声5min(室温，80％功率)；称取ABTS二铵盐3mg，加去离子水0.735mL配制成溶液1，称取过硫酸钾(K2S2O8)1mg溶解于去离子水1.43mL配制成溶液2，同等比例混合上述溶液1和溶液2，避光反应24h；采用对应溶液体系配制nDOP、nDOP-Fe-BHK和nDOP-Fe-RVG纳米制剂待测样品缓冲液20.0μg/mL；将待测样品加入ABTS或者DPPH母液中，以0.00625mg/mL、0.0125mg/mL、0.02mg/mL、0.025mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.16mg/mL、0.2mg/mL、0.32mg/mL和0.64mg/mL、作为终浓度，每个样本设置5个复孔；将96孔板转移至多功能酶标仪中，检测519nm和734nm吸光度值，吸光度值归一化为相同摩尔分数下的吸收值(以nDOP为基准)。
ABTS试验和DPPH试验结果相似，即nDOP-Fe-RVG纳米制剂相较于nDOP化合物在相同的药物剂量之下具有更好的自由基清除效率。见图5。
实施例6nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对脑缺血模型小鼠梗死面积的保护作用
异氟烷气麻系统完成小鼠麻醉后迅速剥离颈总动脉，并沿其主干向下分离颈内动脉和颈外动脉，分岔口处穿行4-0可吸收缝合线一根；用眼科剪在颈外动脉远离分岔口处破开一小口，并将端口有硅胶包被的尼龙线栓插入缺口，并穿过岔口深入颈内动脉直至出现阻力，此时记为0h；缺血60min后，每组注射20mg/kg药物，再灌注24h后，每组取小鼠5只，断头处死取脑；将脑组织放入-20℃稍冰冻固定形状后切成3mm薄片；将切片浸入装有3％TTC工作液的6孔板，于37℃恒温箱孵育30min，正常区域将被染成红色，病灶区不染色；染色后可转移至4％PFA溶液固定1h，后用镊子小心将组织切片平铺于滤纸上拍摄图像；利用ImageJ软件测定图像中脑缺血梗死灶(梗死灶不染色，显白色；正常组织部位显红色)的面积；梗死体积百分率＝(梗死区域总面积/脑组织总面积)×100％。
TTC脑梗死体积统计结果所示，nDOP具有较好的防止缺血细胞梗死效果，nDOP-Fe-RVG纳米制剂具有相比nDOP更好的脑卒中治疗效果。见图6。
实施例7nDOP-Fe-RVG纳米颗粒对脑缺血模型小鼠的皮层神经元完整性的保护作用
动物模型构建同实施例6模型构建和给药方法，即24h再灌注完成后剥离脑组织并加入OCT组织包埋剂，并以20μm厚度制备脑切片，后续染色步骤如下：
A.烤片取出冰冻切片放置通风橱/烘箱风干20min。
B.脱脂0.1M PBS洗3次，每次5min；按顺序：75％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇在各个试剂中脱脂3min；
C.染色0.1M PBS洗2次，每次5min；1％甲苯胺蓝(去离子水配制)染色20min；去离子水洗净；70％乙醇分化10-20s；
D.脱水75％、95％、无水乙醇依次脱水3min；二甲苯透明5min×2次；
E.封片镜检中性树脂封片，晾干后可常温保存或者直接镜检观察。
尼氏体主要成分为粗面内质网和游离核糖体；在不同功能的神经元中有着相对明显的差别。而甲苯胺蓝是一种碱性染料，可用于尼氏体染色，能较好反应尼氏体状态。本次试验通过观察皮层神经元尼氏体完整性，评价药物制剂的神经元保护性能；试验结果显示，正常组神经元细胞形态边缘规整排列紧密，细胞形态良好；与正常组相比，缺血性脑卒中模型组神经元细胞数量明显减少，排列较为稀疏，显示细胞严重受损。nDOP和nDOP-Fe-BHK对照组仅局部细胞疏松；而nDOP-Fe-RVG纳米制剂组的神经元细胞形态规整排列紧密，细胞形态良好，大而圆，与正常组几乎无差异。见图7。
实施例8nDOP-Fe-RVG纳米颗粒能够缓解小鼠脑缺血再灌注后的炎症
OGD/R模型：调整细胞状态，6孔每孔接种1.2×106个细胞为宜，37℃、5％CO2孵育箱孵育12h，待完全贴壁；用DMED高糖培养基配制nDOP(10.0μg/mL)、nDOP-Fe-BHK(10.0μg/mL)和nDOP-Fe-RVG(10.0μg/mL)纳米颗粒溶液；每孔加入100μL药物溶液预保护6h；去掉培养基，PBS缓冲溶液轻柔洗细胞3次，加入无糖培养基，将6孔板转移入缺氧小室，充入94％氮气和5％二氧化碳混合气，将缺氧体系放入细胞孵箱，形成缺糖缺氧造模条件，N2a神经元细胞缺糖缺氧造模时间为2h，bEnd.3内皮细胞缺糖缺氧造模时间为4h，而后吸弃原培养基，加入DMEM高糖培养基，转移至细胞培养箱，实现复氧24h。
细胞蛋白提取：六孔板吸弃原培养基，预冷PBS清洗细胞三次；加入蛋白裂解液，细胞刮刀将贴壁细胞充分刮下来；将细胞裂解液转移至离心管中，低温超声粉碎细胞；破碎后的细胞继续裂解30min；4℃，12000rpm离心15min；取上清液，BCA法测定蛋白浓度；
组织蛋白提取：精确称取实施例6的脑组织，按质量：体积为1:10加入蛋白裂解液，研磨棒充分研磨后，将裂解液转移至离心管中，低温超声粉碎细胞；破碎后的细胞继续裂解30min；4℃，12000rpm离心15min；取上清液，BCA法测定蛋白浓度；
Western blot：进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将凝胶上的蛋白电转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，加入适量用1×TBST按比例稀释的一抗抗体，置于4℃摇床上孵育过夜；回收一抗抗体，取出PVDF膜，漂洗后将PVDF膜转移至新的杂交袋中，并根据一抗抗体来源，加入适量带荧光标签的二抗抗体，摇床上室温避光孵育1h，回收二抗抗体，取出PVDF膜，用1×TBST漂洗3次，用扫描仪进行扫描，分析样品中目的蛋白表达情况。
研究表明，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)都是诱导型酶，在缺血性损伤期间的炎症反应中起着至关重要的作用，缺血性脑卒中后iNOS产生一氧化氮，与神经毒性有关，COX-2是前列腺素合成的限速酶，在炎症引起的细胞毒性和缺血性中风反应性自由基的产生中起着至关重要的作用。此外，越来越多的证据表明，NLRP3炎症小体是炎症的另一个关键因素，并通过促进促炎细胞因子的产生和分泌，在调节神经元和胶质细胞死亡中发挥关键作用。缺血性脑卒中可显著增加iNOS、COX-2和NLRP3的表达。我们的实验结果表明与假手术组相比，MCAO组的缺血半暗区的iNOS、COX-2和NLRP3的蛋白表达均显著上调，nDOP、nDOP-Fe-BHK和nDOP-Fe-RVG可显著减弱iNOS、COX-2和NLRP3的上调。在培养的N2a和bEnd.3细胞中也观察到类似的结果。见图8。
实施例9nDOP-Fe-RVG纳米颗粒显著减轻小鼠脑缺血再灌注后血脑屏障损伤
动物模型构建同实施例6模型构建和给药方法，即24h再灌注完成后剥离脑组织并加入OCT组织包埋剂，并以20μm厚度制备脑切片，后续染色步骤如下：
A.烤片：取出待测片子，37℃恒温箱，干燥10-20min以充分固定脑片；
B.洗涤：PBS缓冲溶液洗涤7min，共3次，以清洗掉残存的OCT包埋试剂；
C.破膜：0.5％TritonX-100破膜液中室温条件下孵育时长10-20min；
D.封闭：10％山羊血清封闭液室温条件下封闭1h；
E.孵育一抗：配制目标蛋白的免疫荧光染色一抗稀释液，4℃冰箱孵育过夜；
F.洗涤：预冷的PBS洗涤7min，洗涤3次，以清洗掉残存的一抗稀释液；
G.孵育二抗：配制目标蛋白对应的免疫荧光染色二抗稀释液，室温避光孵育2h；
H.洗涤：预冷的PBS洗涤7min，洗涤3次，以清洗掉残存的二抗稀释液；
I.核染：配制DAPI工作液室温条件下避光孵育5min；
J.洗涤：用预冷的PBS洗涤脑片7min，洗涤3次，以清洗掉残存的DAPI工作液；
K.封片：用滤纸吸干脑组织周围残存水分，在脑片中央滴加抗荧光猝灭剂，盖玻片封片，尽可能避免出现气泡；
L.共聚焦荧光显微镜观察。
Western blot实验方法同实例8。
本次试验采用CD31标记脑中微血管，采用ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白标记血管上的三种紧密连接蛋白，进行双染共定位。荧光染色结果表明，MCAO组相比于Control组，CD31+/ZO-1+、CD31+/Occludin+以及CD31+/Claudin-5+三种共定位程度明显降低，而nDOP、nDOP-Fe-BHK以及nDOP-Fe-RVG三种纳米颗粒对小鼠脑缺血再灌注引起的血脑屏障损伤表现出明显的改善作用。本试验又通过Western Blot方法对上述结论进行验证，定量分析条带中蛋白的灰度值，所得到的结论与免疫荧光染色的结论一致。综上所述，nDOP-RVG纳米颗粒能够减轻小鼠脑缺血再灌注后的血脑屏障损伤。见图9。
实施例10nDOP-Fe-RVG纳米颗粒显著改善神经元线粒体功能作用
JC-1是一种阳离子染料荧光探针试剂盒，用于检测线粒体膜电位(MitochondrialMembrane Potential，MMP)。线粒体自身存在极性，离子流调控电位差。当线粒体功能状态较好时，JC-1聚集于线粒体基质形成聚合物，最大激发波长585nm，最大发射波长590nm，产生红色发射光；线粒体发生去极化时，线粒体功能状态较差，JC-1则不会聚集于线粒体基质，此时低浓度JC-1以单体存在，最大激发波长514nm，最大发射波长529nm，产生绿色发射光，因而就能够通过JC-1从红色荧光向绿色荧光的变化，即红光强度/绿光强度的比值变化，达到检测线粒体膜电位的目的。JC-1从红色荧光向绿色荧光的转变，表明线粒体膜电位下降，标志着细胞处于凋亡早期阶段。
细胞模型构建同实施例8模型构建，即细胞OGD 2h后，再复糖复氧24h，吸弃培养基，24孔板每孔加入1mL无菌4％PFA固定液，锡箔纸包裹避光，常温固定30min；吸弃上清，每孔加入1mL无菌PBS缓冲溶液，清洗细胞一次；每孔加入300μL JC-1染色工作液，轻柔晃动混匀，锡箔纸避光，37℃孵育20min；吸弃上清，加入200μL预冷JC-1染色缓冲液，轻柔晃动混匀，清洗细胞两次；吸弃上清后加入200μL DAPI工作液(5μg/mL)染色细胞核，常温孵育5min；孵育结束后，每孔加入200μL预冷PBS缓冲溶液，轻柔晃动混匀，清洗细胞三次；将细胞面朝上，将爬片贴到载玻片上，避光晾干，将抗荧光猝灭剂滴在爬片中央，盖上盖玻片，放置于4℃避光保存，共聚焦荧光显微镜观察。
MitoSOXTMRed线粒体超氧化物指示剂，可渗透入活细胞，高选择性快速靶向线粒体，并能够迅速被超氧化物氧化，而不被其他的活性氧以及活性氮(Reactive NitrogenSpecies，RNS)氧化，呈现红色荧光。
细胞模型构建同实施例8模型构建，即细胞OGD 2h后，再复糖复氧24h，吸弃培养基，24孔板每孔加入1mL无菌4％PFA固定液，锡箔纸包裹，常温固定30min；吸弃细胞上清，每孔加入1mL无菌PBS缓冲溶液，清洗细胞三次；加入400μL MitoSOXTM Red工作液(5μM)，轻柔混匀，37℃避光孵育30min；孵育结束后，吸弃上清，每孔加入200μL预冷PBS缓冲溶液，轻柔混匀，清洗细胞三次；吸弃上清，加入200μL DAPI工作液(5μg/mL)染色细胞核，常温孵育5min；孵育结束后，每孔需要加入200μL预冷PBS缓冲溶液，轻柔混匀，清洗细胞三次；载玻片写好信息，每片滴加3滴PBS缓冲溶液方便黏附固定细胞爬片；将细胞面朝上，将爬片贴到载玻片上，避光晾干，将抗荧光猝灭剂滴在爬片中央，盖上盖玻片，放置于4℃避光保存，共聚焦荧光显微镜观察。
综上，根据本发明实施例，本发明公开了一种通过Fe3+诱导多巴胺快速聚合得到聚多巴胺，并应用工程化的狂犬病毒糖蛋白生物膜(RVG)简单快速的包裹聚多巴胺(nDOP)，得到具有良好分散性、形貌规整均一的聚多巴胺纳米粒子制剂(nDOP-Fe-RVG)。研究证明该纳米制剂具有良好的血脑屏障通透性/神经元靶向作用，能够通过清除自由基、抑制神经细胞凋亡、修复受损血脑屏障、减轻炎症反应和改善神经元线粒体功能从而发挥抗脑缺血，是一种神经保护效果显著的纳米制剂，特别适用于脑部疾病的高效治疗。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.用于脑靶向型自由基清除纳米制剂，其特征在于，为nDOP-Fe-RVG纳米颗粒；其中，nDOP为聚多巴胺纳米颗粒；RVG为神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白肽；RVG包裹聚多巴胺；Fe负载在RVG包裹的聚多巴胺上。
2.用于脑靶向型自由基清除纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：称取70-90mg盐酸多巴胺放置于圆底烧瓶中，缓慢加入100-150ml超纯水，充分溶解；同时加入550-650μL 5-15mg/ml的六水合氯化铁，水浴锅升温至35-45℃后继续加热20-40min；随后向溶液中加入80-120mM的Tris盐酸缓冲液30-50ml，继续搅拌加热2-4h；加热完成后，将反应液离心，无水乙醇清洗，将沉淀溶于超纯水中，充分溶解，获得nDOP-Fe；
步骤二：将表达有RVG的BHK-21细胞收集于离心管中，超声破碎处理，进行梯度离心，得到含有囊泡的上清液；
步骤三：将RVG室温下PBS溶解，与nDOP-Fe混合，两者比例为质量比(1.5-2.5)：1超声4-6min，4℃环境孵育过夜，得到nDOP-Fe-RVG。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤二中，梯度离心为：1800-2200rpm离心8-12min，3800-4200rpm离心8-12min，4800-5200rpm离心8-12min。
4.如权利要求2或3所述的制备方法制备得到的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂。
5.如权利要求1或4所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备治疗脑部疾病药物中的用途。
6.如权利要求1或4所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备清除自由基药物或减轻炎症反应药物中的用途。
7.如权利要求1或4所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备神经元靶向作用药物中的用途。
8.如权利要求1或4所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备降低脑缺血后梗死体积药物中的用途。
9.如权利要求1或4所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备修复受损血脑屏障药物中的用途。
10.如权利要求1或4所述的用于脑靶向型自由基清除纳米制剂在制备改善神经元线粒体功能作用药物中的用途。
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