CN117904256A - 一种粪便样本保存液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粪便样本保存液及其制备方法和应用，所述粪便样本保存液包括Tris base、EDTA二钠盐、二水合柠檬酸三钠、氯化钠、无水乙醇、去离子水、ProClin300、L‑薄荷醇、芳樟醇和不锈钢珠。本发明的粪便样本保存液可以于常温下有效保持粪便样本中的核酸稳定性，采样后可直接取上清液进行下游分子生物学检测，提高了粪便样本的保存、提取、检测整体流程的便利性，而且本发明的粪便样本保存液能有效抑制粪便样本的腥臭味，有利于临床应用。
Description
技术领域
本发明属于粪便检测技术领域，具体涉及一种粪便样本保存液及其制备方法和应用。
背景技术
粪便是食物进入人体后经过消化道吸收后形成，食物中的营养物质被胃肠道消化吸收后，剩余的残渣由大肠排出，其中含有数量巨大的各类细菌以及脱落的人类细胞。在临床检测领域，粪便检测是常规项目之一，可以直观的反应胃肠道的病变情况。近些年来，在消化道肿瘤尤其是结直肠癌的临床诊断上，针对粪便样本的检测得到了极大的应用与发展。
结直肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和病死率呈现逐年上升的趋势。其中筛查和早期诊断方法一节提到多个粪便检测方法，包括免疫法粪便隐血试验(FIT)和多靶点粪便FIT-DNA检测。作为一种新兴、非侵入性的结直肠癌早期诊断方法，粪便DNA检测技术应运而生并且飞速发展。因此基于粪便样本的检测产品已成为筛查结直肠肿瘤的有效手段之一。
在临床实践中，医院或第三方体检机构采集的粪便样本由于不易保存的问题，一般要求立即检测，这会显著提高医技人员的工作负担，工作效率和检测通量也难以提升。目前常见的粪便样本保存方式一般是低温冻存，缺点是设备环境要求较高，同时也并不方便易用。如果能有一种简单便捷的保存粪便样本的方式，能够将样本进行一定时间的储存，并且不影响样本核酸提取与检测效果，必将能有效的提高采样-核酸提取-检测流程化整体效率。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种粪便样本保存液，能够在常温下有效保持粪便样本中核酸的稳定性，有利于提高粪便样本保存、提取的全流程便利性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种粪便样本保存液，包括Tris base、EDTA二钠盐、二水合柠檬酸三钠、氯化钠、无水乙醇、去离子水、ProClin300、L-薄荷醇和芳樟醇，且粪便样本保存液的pH值为7.5-8.5。
在本发明的粪便样本保存液中，Tris用于有效维持溶液的pH值，氯化钠起到稳定离子强度的作用；EDTA二钠盐是一种螯合剂，能够螯合粪便样本中的常见金属离子，同时对防腐抑菌也有一定的协同作用；乙醇能快速渗入细胞间质，降解相关的核酸酶，有利于提高粪便样本中的人类或微生物的核酸的长期保存稳定性；柠檬酸盐与其他成分一起协同作用起到螯合剂和固定剂的作用；ProClin300作为防腐抑菌剂，能够防止粪便样本在长期室温放置过程中的杂菌污染，导致样本无法提取核酸或提取的核酸被外源物质污染，相比硫柳汞、叠氮化钠等同类物毒性很低，对人员及环境更为友好。
粪便样本因细菌作用下会产生大量腥臭物质，如吲哚、粪臭素、硫化氢等，工作在恶臭环境下对于医技人员而言极易产生生理不适或厌恶的心理，严重影响工作效率。而在临床实践的粪便样本采集检测保存过程中，因除臭剂可能会影响样本稳定性，故一般不在保存、检测等试剂中使用除臭剂。本发明利用L-薄荷醇和芳樟醇有效地减轻甚至消除粪便样本臭味对操作者的影响，而且经发明人长期大量的实验验证，在本发明特定的保存液组分中添加L-薄荷醇和芳樟醇之后，对于粪便样本的保存及后续的核酸提取无任何不利影响。
优选地，在上述粪便样本保存液中，各组分的终浓度分别为：1-3M Tris base，200-400mM EDTA二钠盐，2-5％w/v二水合柠檬酸三钠，20-50mM氯化钠，5-20％v/v无水乙醇，0.06-0.4％v/v ProClin300，0.1-0.3％w/v L-薄荷醇，0.2-0.6％v/v芳樟醇。
优选地，在上述粪便样本保存液中，还包括不锈钢珠；更为优选地，每15mL粪便样本保存液含有2-5粒2-6mm的不锈钢珠。
发明人意外发现，不锈钢珠可以长期存在于本发明的保存液中，不会因化学反应等因素破坏粪便样本与保存液混合体系的稳定性；而且，在不锈钢珠的存在下，配合粪便样本在保存液中的剧荡摇晃或置于振荡器震荡等物理操作后，粪便样本的分散性更佳，与保存液接触更加充分，使得核酸提取浓度更高，同时整体保存的效果更加持久。
在本发明的一实施例中，粪便样本保存液由以下组分组成：1M Tris base，200mMEDTA二钠盐，2％w/v二水合柠檬酸三钠，20mM氯化钠，5％v/v无水乙醇，0.06％v/vProClin300，0.1％w/v L-薄荷醇，0.2％v/v芳樟醇，每15mL 3粒4mm不锈钢珠，余量的去离子水。
在本发明的另一实施例中，粪便样本保存液由以下组分组成：2M Tris base，300mM EDTA二钠盐，3.5％w/v二水合柠檬酸三钠，34mM氯化钠，12.5％v/v无水乙醇，0.22％v/v ProClin300，0.2％w/v L-薄荷醇，0.4％v/v芳樟醇，每15mL 3粒4mm不锈钢珠，余量的去离子水。
在本发明的另一实施例中，粪便样本保存液由以下组分组成：3M Tris base，400mM EDTA二钠盐，5％w/v二水合柠檬酸三钠，50mM氯化钠，20％v/v无水乙醇，0.4％v/vProClin300，0.3％w/v L-薄荷醇，0.6％v/v芳樟醇，每15mL 3粒4mm不锈钢珠，余量的去离子水。
本发明第二方面提供了本发明所述粪便样本保存液的制备方法，具体包括以下步骤：
称取所需量的Tris base、EDTA二钠盐、二水合柠檬酸三钠、氯化钠，加入适量去离子水搅拌溶解混匀，使用盐酸调节pH，高压蒸汽灭菌后得到溶液一；
称取所需量的L-薄荷醇、芳樟醇，加入所需量的无水乙醇中，与所需量的ProClin300一起加入溶液一中，混匀得到溶液二；
用去离子水将溶液二定容至所需体积，混匀后分装，加入所需量的不锈钢珠即得。
本发明第三方面提供了本发明所述粪便样本保存液在粪便样本常温保存中的应用。
优选地，所述应用的方法为：将新鲜采集的粪便样本与保存液按照质量体积1∶3～1∶5的比例混合，剧烈摇晃或置于振荡器混匀后，室温避光保存。本发明的实验数据表明，粪便样本在本发明的保存液中于常温下保存长达60天后，仍能获得较为准确的检测结果。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的粪便样本保存液可以有效的保持粪便样本中的核酸稳定性，采样后可直接取上清液进行下游分子生物学检测，提高了粪便样本的保存、提取、检测整体流程的便利性。本发明的粪便样本保存液以L-薄荷醇和芳樟醇为除臭剂，有效地减轻甚至消除了粪便样本臭味对操作者的影响；同时，通过在粪便保存液中添加不锈钢钢珠，使得粪便样本在保存液中充分分散，进而更有利于核酸保存和提取。本发明粪便样本保存液的原料方便易得，不含硫柳汞、叠氮化钠等有毒成分，且消除了粪便样本的臭味，安全性高，有利于临床使用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细的描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的含义相同；本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”以及它的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
目前粪便样本保存方式仍以低温冻存为主，成本高且取用不方便，而且粪便样本的臭味增加了对于医技人员的心理和生理负担。为了更有利于粪便样本的临床检测，本发明提供了一种常温使用的粪便样本保存液及其制备方法，通过在本发明开发的常温粪便样本保存液中添加L-薄荷醇、芳樟醇和不锈钢珠，在不破坏粪便样本与保存液混合体系稳定性的情况下，实现了臭味的消除和核酸的高效保存、提取。
本发明实施例提供的粪便样本保存液主要由以下成分组成：1-3M Tris base、200-400mM EDTA二钠盐、2-5％w/v二水合柠檬酸三钠、20-50mM氯化钠、5-20％v/v无水乙醇、去离子水、0.06-0.4％v/v ProClin300、0.1-0.3％w/v L-薄荷醇、0.2-0.6％v/v芳樟醇和不锈钢钢珠，且粪便样本保存液的pH值为7.5-8.5。
本发明通过大量实验，确定了适用于粪便样本常温长期保存的保存液体系，各组分协同、稳定地维持了粪便样本中核酸的稳定性。在本发明的粪便样本保存液中，Tris用于有效维持溶液的pH值，氯化钠起到稳定离子强度的作用，EDTA二钠盐能够螯合粪便样本中的常见金属离子，同时对防腐抑菌也有一定的协同作用，乙醇有利于提高粪便样本中的人类或微生物的核酸的长期保存稳定性，二水合柠檬酸三钠起到螯合剂和固定剂的作用，ProClin300能够防止粪便样本在长期室温放置过程中的杂菌污染，L-薄荷醇和芳樟醇有效地减轻甚至消除粪便样本臭味对操作者的影响，不锈钢珠有利于核酸的高效保存和提取。
下面列举了一些具体实施例，需说明的是，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本例的粪便样本保存液的组成具体为：1M Tris base，200mM EDTA二钠盐，2％w/v二水合柠檬酸三钠，20mM氯化钠，5％v/v无水乙醇，0.06％v/v ProClin300，0.1％w/v L-薄荷醇，0.2％v/v芳樟醇，4mm不锈钢珠(3粒/15mL)，其余为去离子水；pH值为7.5。
本例通过以下过程配制1L的粪便样本保存液：
根据各成分的终浓度计算所需添加量，然后依次向去离子水中添加Tris base、EDTA二钠盐、二水合柠檬酸三钠、氯化钠，搅拌均匀溶解，同时用盐酸调节pH值至7.5，进行121℃21min高压蒸汽灭菌，得到溶液一。
向无水乙醇中添加称取所需量的L-薄荷醇、芳樟醇，再与所需量的ProClin300一起加入溶液一中，搅拌溶解混匀，得到溶液二。
用去离子水将溶液二定容至1L，混合均匀后进行分装，每一份保存液按15mL分装后再加入4mm不锈钢珠3粒，获得所述粪便样本保存液。
实施例2
本例的粪便样本保存液的组成具体为：2M Tris base，300mM EDTA二钠盐，3.5％w/v二水合柠檬酸三钠，34mM氯化钠，12.5％v/v无水乙醇，0.22％v/v ProClin300，L-薄荷醇0.2％w/v，芳樟醇0.4％v/v，4mm不锈钢珠(3粒/15mL)，其余为去离子水；pH值为8.0。
参照实施例1中的方法配制本例的粪便样本保存液。
实施例3
本例的粪便样本保存液的组成具体为：3M Tris base，400mM EDTA二钠盐，5％w/v二水合柠檬酸三钠，50mM氯化钠，20％v/v无水乙醇，0.4％v/v ProClin300，0.3％w/v L-薄荷醇，0.6％v/v芳樟醇，4mm不锈钢珠(3粒/15mL)，其余为去离子水；pH值为8.5。
参照实施例1中的方法配制本例的粪便样本保存液。
实施例4
本例以2个志愿者提供的新鲜粪便样本为例，展示了本发明粪便样本保存液的使用方法以及保存效果，具体过程如下：
(1)粪便样本的保存。
取新鲜采集的不含水分和尿液的粪便样本，与实施例1-3所述的保存液按照质量体积1∶3的比例混合，置于振荡器1min后，置于室温避光保存，每份样本取2份作为平行重复。间隔0天、3天、10天、25天、40天、50天、60天进行提取核酸操作。
(2)粪便样本核酸提取方法。
采用Apostle公司所生产基因组DNA提取试剂盒-粪便版试剂盒(医疗器械备案号：粤深械备20180540号)进行提取，操作方法严格按照其试剂盒说明书进行。
(3)核酸的PCR检测。
使用荧光定量PCR的方法检测样本核酸DNA中的内参基因肌动蛋白ACTB的Ct值，检测所用引物和探针的序列如表1所示。
表1
| 引物探针名称 | 序列(5’-3’) |
| ACTB-F | CGAGAAGATGACCCAGGTGAGT(SEQ ID NO.1) |
| ACTB-R | GAAAACGGCAGAAGAGAGAACC(SEQ ID NO.2) |
| ACTB-P | FAM-CGCTACCTCTTCTGGTG-MGB(SEQ ID NO.3) |
使用AB7500进行PCR检测，且PCR反应体系如表2所示。
表2
设置FAM荧光通道，扩增反应条件如下：95℃、5分钟；95℃、15秒，60℃、60秒(采集荧光)，40循环。结果判读：每次实验同步检测纯化水和ACTB阳性质粒作为阴阳性对照，PCR反应结束后，根据扩增曲线，适当调整基线和荧光阈值，得到样本的Ct值。每次反应的阴性对照应无明显扩增曲线、无Ct值或Ct值＞35，阳性对照应具有明显扩增曲线，Ct值≤30。
最终检测结果如表3所示。从表3可知，在常温保存60天后，实施例1-3的保存液保存的样本核酸的Ct值与0天的Ct值差值很小，可认为是正常的实验操作误差，表明实施例1-3的保存液均能够确保粪便样本中的人类脱落细胞60天内不降解，提取的DNA扩增结果与0天差异不大，不影响核酸提取及下游的分子生物学检测实验。
表3保存不同时间后粪便样本的核酸检测结果
对比例1
与实施例1不同的是，本例提供的粪便样本保存液中不含有4mm不锈钢珠。
对比例2
与实施例1不同的是，本例提供的粪便样本保存液中不包含EDTA二钠盐和Trisbase。
对比例3
与实施例1不同的是，在本例提供的粪便样本保存液中，Tris base浓度为6M，EDTA二钠盐浓度为1M，二水合柠檬酸三钠浓度为1％w/v，氯化钠浓度为5mM，无水乙醇浓度为1％v/v。
对比例4
与实施例1不同的是，在本例提供的粪便样本保存液中，Tris base浓度为0.5M，EDTA二钠盐浓度为20mM，二水合柠檬酸三钠浓度为15％w/v，氯化钠浓度为100mM，无水乙醇浓度为40％v/v。
对比例5
与实施例1不同的是，本例提供的粪便样本保存液中不包含ProClin300。
对比例6
与实施例1不同的是，本例提供的粪便样本保存液中不包含L-薄荷醇和芳樟醇。
实施例5
参照实施例4，另取2个不同志愿者(记作3号志愿者和4号志愿者)提供的新鲜采集的不含水分和尿液的粪便样本，与对比例1-4以及实施例1所述的保存液按照质量体积1∶3的比例混合，剧烈摇晃后，置于室温避光保存。间隔0天、3天、7天、10天进行提取核酸操作，并上机检测核酸样本中内参基因肌动蛋白ACTB的Ct值。本例的结果如表4和表5所示。
表4实施例1与对比例1-6中粪便样本保存液的保存效果对比
注，/*表示样本杂菌污染严重，没有进行核酸提取操作。
从表4可知，在常温保存不同天数后，对比例1保存液保存的样本核酸的Ct值与实施例1的Ct值相比明显降低，但随着时间延长趋于稳定，说明对比例1保存样本效果不如实施例1，但也具有长期保存的能力，二者差异在于对比例1不含不锈钢珠，说明不锈钢珠的加入可以显著提升样本与保存液的混匀效果，提高核酸得率，同时也协同促进长期保存效果。结合实验例1-3的结果可以看出，包含不锈钢珠的本发明的保存液可以确保粪便样本核酸扩增结果60天后无太大差异，保存效果最佳。
对比例2-4保存液组分相比实施例1有缺失或者浓度大小改变，其保存的样本核酸的Ct值在第3天及之后相比实施例1的Ct值，可发现其提取的核酸浓度降低甚至无法检出，说明对比例2-4保存液组分差异明显不利于粪便样本的核酸长期保存，实施例1具备更佳的长期保存粪便样本的能力。
在常温保存不同天数后，对比例5中的保存液由于缺乏防腐抑菌成分，从第3天开始杂菌污染严重，Ct值相比0天明显增大，7天及10天由于杂菌问题未开始后续检测，无实验数据，说明对比例5无法对样本进行长期室温存储。对比例6在不同时间点的检测结果相比0天差异不大，可认为是正常的实验操作误差，但是在实验过程中，由于对比例6缺乏L-薄荷醇和芳樟醇，样本自然产生的强烈腥臭味无法抑制，对于实验操作人员产生了明显的不利影响，对于实验操作也有潜在的错误风险。
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
综上所述，本发明提供的粪便样本保存液能够实现新鲜粪便样本在常温下的长期保存，而且能够抑制粪便样本的腥臭味，有利于临床推广应用。
需要说明的是，以上实施例仅是本发明一部分实施例而不是全部的实施例，仅用以说明本发明的技术方案而非限制；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种粪便样本保存液，其特征在于，包括Tris base、EDTA二钠盐、二水合柠檬酸三钠、氯化钠、无水乙醇、去离子水、ProClin300、L-薄荷醇和芳樟醇，且所述粪便样本保存液的pH值为7.5-8.5。
2.根据权利要求1所述的粪便样本保存液，其特征在于，包含以下组分：1-3M Trisbase，200-400mM EDTA二钠盐，2-5％w/v二水合柠檬酸三钠，20-50mM氯化钠，5-20％v/v无水乙醇，0.06-0.4％v/v ProClin300，0.1-0.3％w/v L-薄荷醇，0.2-0.6％v/v芳樟醇。
3.根据权利要求1或2所述的粪便样本保存液，其特征在于，还包括不锈钢珠，所述每15mL粪便样本保存液含有2-5粒2-6mm不锈钢珠。
4.根据权利要求3所述的粪便样本保存液，其特征在于，由以下组分组成：
1M Tris base，200mM EDTA二钠盐，2％w/v二水合柠檬酸三钠，20mM氯化钠，5％v/v无水乙醇，0.06％v/v ProClin300，0.1％w/v L-薄荷醇，0.2％v/v芳樟醇，每15mL 3粒4mm不锈钢珠，余量的去离子水。
5.根据权利要求3所述的粪便样本保存液，其特征在于，由以下组分组成：
2M Tris base，300mM EDTA二钠盐，3.5％w/v二水合柠檬酸三钠，34mM氯化钠，12.5％v/v无水乙醇，0.22％v/v ProClin300，0.2％w/v L-薄荷醇，0.4％v/v芳樟醇，每15mL 3粒4mm不锈钢珠，余量的去离子水。
6.根据权利要求3所述的粪便样本保存液，其特征在于，由以下组分组成：
3M Tris base，400mM EDTA二钠盐，5％w/v二水合柠檬酸三钠，50mM氯化钠，20％v/v无水乙醇，0.4％v/v ProClin300，0.3％w/v L-薄荷醇，0.6％v/v芳樟醇，每15mL 3粒4mm不锈钢珠，余量的去离子水。
7.一种如权利要求1-6任一项所述粪便样本保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取所需量的Tris base、EDTA二钠盐、二水合柠檬酸三钠、氯化钠，加入适量去离子水搅拌溶解混匀，使用盐酸调节pH，高压蒸汽灭菌后得到溶液一；
称取所需量的L-薄荷醇、芳樟醇，加入所需量的无水乙醇中，与所需量的ProClin300一起加入溶液一中，混匀得到溶液二；
用去离子水将溶液二定容至所需体积，混匀后分装，加入所需量的不锈钢珠即得。
8.如权利要求1-6任一项所述粪便样本保存液在粪便样本常温保存中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将新鲜采集的粪便样本与保存液按照质量体积1∶3～1∶5的比例混合，剧烈摇晃或置于振荡器混匀后，室温避光保存。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述保存的时间≤60天。
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