CN117904108A - 用于抑制pnpla3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途 - Google Patents

用于抑制pnpla3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117904108A
CN117904108A CN202311684992.XA CN202311684992A CN117904108A CN 117904108 A CN117904108 A CN 117904108A CN 202311684992 A CN202311684992 A CN 202311684992A CN 117904108 A CN117904108 A CN 117904108A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotides
sense strand
double
antisense strand
ribonucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311684992.XA
Other languages
English (en)
Inventor
林国良
黄河
王书成
王岩
汪小君
产运霞
耿玉先
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd filed Critical Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
Publication of CN117904108A publication Critical patent/CN117904108A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本申请涉及用于抑制PNPLA3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途。具体而言，本申请涉及一种用于抑制PNPLA3基因表达的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、药物组合物和用途，以及用于抑制细胞内PNPLA3基因表达的方法。本申请提供的双链核糖核酸能够在细胞内结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，切割PNPLA3基因转录的mRNA，高效、特异地抑制PNPLA3基因的表达，用于治疗PNPLA3基因介导的疾病，在临床疾病治疗中具有重要应用前景。

Description

用于抑制PNPLA3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合 物和用途
技术领域
本公开涉及一种能够抑制PNPLA3基因或其表达产物的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、药物组合物和用途，以及用于抑制细胞内PNPLA3基因表达的方法。
背景技术
PNPLA3(Homo sapiens patatin like phospholipase domain containing 3)基因是脂联素蛋白的指令基因。脂联素蛋白分布于脂肪细胞和肝细胞。脂联素蛋白被认为有助于调节脂肪细胞的发育以及脂肪的产生和分解(脂肪生成和脂肪分解)。
研究表明，PNPLA3基因的活性(表达)在禁食期间降低，进食后增加，这表明产生的脂联素蛋白的量根据需要进行调节，以帮助处理和储存饮食中的脂肪。PNPLA3基因的一个特殊变异与患非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的风险增加有关。与NAFLD相关的PNPLA3基因变异将蛋白质位置148处的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(即Ile148Met或I148M)。研究表明，突变后的蛋白质会导致肝脏中脂肪的产生增加和分解减少。PNPLA3基因的I148M突变也与其他肝脏疾病的恶化有关，例如称为丙型肝炎的病毒感染。这种突变还增加了酗酒者肝损伤的风险。这种效应的机制尚不清楚，但突变的蛋白质似乎会增加肝脏纤维化。
PNPLA3的I148M突变已被证明不仅会影响肝内重构，还会减少极低密度脂蛋白(VLDL)的分泌。VLDL分泌代表脂肪从肝脏流出的途径。因此，该途径的减少可以部分解释在PNPLA3突变携带者中发现的肝脏脂肪增加。I148M突变抑制肝脏细胞中的甘油三酯代谢为脂肪酸和甘油，引起大泡性脂肪变性。同时，I148M突变抑制肝脏星状细胞中的视黄酯代谢为视黄醇，造成脂肪滴膨胀变性。
NAFLD也称为代谢(功能障碍)相关的脂肪性肝病(MAFLD)，是在没有其他明确原因(如饮酒)的情况下，肝脏内脂肪过多积聚。NAFLD是世界上最常见的肝病，约占世界人口的25％。NAFLD可分为两种类型：非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFL的危险性比NASH低，通常不会进展为NASH或肝硬化。当NAFL进展为NASH时会观察到小叶炎症、肝细胞气球样变、窦周纤维化等损伤。与单纯脂肪变性相比，炎症是NASH的标志。NASH是一种进行性疾病，通过凋亡或坏死增加肝细胞死亡，可严重损害肝功能，导致肝硬化、肝衰竭、肝癌或心血管疾病等并发症，现已成为临床上肝脏移植的三大因素之一。
NAFLD目前尚无特殊的治疗方法，主要是通过饮食改变和运动来减轻体重，初步研究表明吡格列酮和维生素E具有治疗的可能性。
因此，开发靶向PNPLA3的药物具有重要的价值。本发明旨在提供siRNA或其组合物，特异性针对PNPLA3基因的RNA转录本，用于RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的切割，从而能够选择性且有效地抑制PNPLA3基因或其表达产物。
发明内容
本公开提供了一种双链核糖核酸，其包含正义链与反义链；所述正义链和所述反义链形成双链区(优选所述正义链和所述反义链反向互补)；所述双链核糖核酸靶向PNPLA3基因或其表达产物。
在一些实施方案中，所述双链核糖核酸靶向PNPLA3基因的CDS区。
在一些实施方案中，所述双链核糖核酸靶向SEQ ID NO：1所示序列中的CDS区。
在一些实施方案中，所述双链核糖核酸靶向所述CDS区中至少连续15个(优选连续17至25个)核苷酸长的任意靶点。
在一些实施方案中，所述双链核糖核酸靶向选自以下任一个靶点或其组合：SEQID NO：1的第339-361位所示的多核苷酸、340-358位所示的多核苷酸、341-363位所示的多核苷酸、342-364位所示的多核苷酸、343-361位所示的多核苷酸、343-363位所示的多核苷酸、344-362位所示的多核苷酸、364-382位所示的多核苷酸、386-408位所示的多核苷酸、387-409位所示的多核苷酸、388-410位所示的多核苷酸、389-407位所示的多核苷酸、389-409位所示的多核苷酸、390-408位所示的多核苷酸、390-410位所示的多核苷酸、441-459位所示的多核苷酸、442-460位所示的多核苷酸、494-512位所示的多核苷酸、517-539位所示的多核苷酸、519-537位所示的多核苷酸、519-541位所示的多核苷酸、520-542位所示的多核苷酸、521-539位所示的多核苷酸、522-540位所示的多核苷酸、522-542位所示的多核苷酸、525-545位所示的多核苷酸、525-543位所示的多核苷酸、553-571位所示的多核苷酸、587-605位所示的多核苷酸、636-654位所示的多核苷酸、710-728位所示的多核苷酸、764-786位所示的多核苷酸、765-787位所示的多核苷酸、766-784位所示的多核苷酸、766-786位所示的多核苷酸、767-785位所示的多核苷酸、767-789位所示的多核苷酸、768-788位所示的多核苷酸、769-789位所示的多核苷酸、818-838位所示的多核苷酸、820-838位所示的多核苷酸、820-840位所示的多核苷酸、821-839位所示的多核苷酸、824-846位所示的多核苷酸、825-843位所示的多核苷酸、825-845位所示的多核苷酸、826-846位所示的多核苷酸、828-846位所示的多核苷酸、828-848位所示的多核苷酸、1082-1100位所示的多核苷酸、1120-1138位所示的多核苷酸、1123-1141位所示的多核苷酸、1143-1161位所示的多核苷酸、1144-1164位所示的多核苷酸、1146-1164位所示的多核苷酸、1147-1165位所示的多核苷酸、1148-1166位所示的多核苷酸、1151-1169位所示的多核苷酸、1194-1212位所示的多核苷酸、1204-1222位所示的多核苷酸、1220-1238位所示的多核苷酸、1467-1489位所示的多核苷酸、1468-1490位所示的多核苷酸、1469-1491位所示的多核苷酸、1471-1489位所示的多核苷酸、1471-1491位所示的多核苷酸、1472-1490位所示的多核苷酸、1472-1492位所示的多核苷酸、1475-1495位所示的多核苷酸、126-144位所示的多核苷酸、154-172位所示的多核苷酸、214-236位所示的多核苷酸、215-237位所示的多核苷酸、216-238位所示的多核苷酸、218-240位所示的多核苷酸、220-242位所示的多核苷酸、228-246位所示的多核苷酸、260-282位所示的多核苷酸、267-285位所示的多核苷酸、293-311位所示的多核苷酸、294-316位所示的多核苷酸、295-317位所示的多核苷酸、297-317位所示的多核苷酸、299-319位所示的多核苷酸、299-317位所示的多核苷酸、414-436位所示的多核苷酸、416-438位所示的多核苷酸、418-440位所示的多核苷酸、468-490位所示的多核苷酸、584-602位所示的多核苷酸、586-606位所示的多核苷酸、590-610位所示的多核苷酸、663-683位所示的多核苷酸、664-684位所示的多核苷酸、665-683位所示的多核苷酸、665-687位所示的多核苷酸、668-690位所示的多核苷酸、670-692位所示的多核苷酸、672-692位所示的多核苷酸、673-695位所示的多核苷酸、674-696位所示的多核苷酸、675-693位所示的多核苷酸、675-697位所示的多核苷酸、676-696位所示的多核苷酸、677-699位所示的多核苷酸、722-740位所示的多核苷酸、751-769位所示的多核苷酸、752-770位所示的多核苷酸、754-772位所示的多核苷酸、755-773位所示的多核苷酸、757-775位所示的多核苷酸、758-776位所示的多核苷酸、758-778位所示的多核苷酸、759-779位所示的多核苷酸、806-824位所示的多核苷酸、845-863位所示的多核苷酸、850-872位所示的多核苷酸、851-873位所示的多核苷酸、854-876位所示的多核苷酸、855-875位所示的多核苷酸、997-1015位所示的多核苷酸、1011-1029位所示的多核苷酸、1011-1031位所示的多核苷酸、1016-1038位所示的多核苷酸、1212-1230位所示的多核苷酸、1262-1280位所示的多核苷酸、1264-1282位所示的多核苷酸、1264-1284位所示的多核苷酸、1264-1286位所示的多核苷酸、1266-1288位所示的多核苷酸、1265-1283位所示的多核苷酸、1265-1285位所示的多核苷酸、1446-1464位所示的多核苷酸、1446-1466位所示的多核苷酸、1447-1465位所示的多核苷酸、1510-1532位所示的多核苷酸、1603-1621位所示的多核苷酸、1604-1626位所示的多核苷酸、1605-1623位所示的多核苷酸、1616-1634位所示的多核苷酸、1647-1667位所示的多核苷酸、1660-1678位所示的多核苷酸、1768-1786位所示的多核苷酸、1768-1788位所示的多核苷酸、1770-1790位所示的多核苷酸、1771-1789位所示的多核苷酸、1801-1819位所示的多核苷酸、1803-1821位所示的多核苷酸、1805-1827位所示的多核苷酸、1806-1826位所示的多核苷酸、1833-1851位所示的多核苷酸、1834-1854位所示的多核苷酸。
上述位点参照NM_025225.3(SEQ ID NO：1)中所示序列的自然顺序编号。应当理解，当采用NM_025225.3的其他等同登录号时，技术人员能够确定前述位点的等同位置。
在一些实施方案中，双链核糖核酸包含正义链与反义链；正义链和所述反义链形成双链区；所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补。
在一些实施方案中，所述反义链与上述靶点之间存在不多于3个、不多于2个、或不多于1个错配。
在一些实施方案中，所述正义链与上述靶点之间差异不多于3个、不多于2个、或不多于1个核苷酸。
本公开提供了一种dsRNA(如siRNA)，其包含正义链与反义链，所述正义链与所述反义链选自以下任一组合：
所述正义链包含与SEQ ID NO：64所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：65所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：88所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：89所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：90所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：91所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：92所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：93所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：379所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：380所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。
在一些实施方案中，所述双链核糖核酸的正义链和反义链选自表7中任一对所示的多核苷酸。
虽然，前面的段落中具体描述了N-ER-FY006039、N-ER-FY006051、N-ER-FY006052、N-ER-FY006053、N-ER-FY006096的正义链和反义链。但是，技术人员知晓，表述“所述双链核糖核酸的正义链和反义链选自表7中任一对所示的多核苷酸”是一种简洁的表述，这意味着表7中任一编号的siRNA都明确地按照以下相同的格式得以充分描述：“所述正义链包含与SEQ ID NO：X所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：X所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸”。作为一个示例，针对N-ER-FY006002编号的siRNA，其正义链包含与SEQ ID NO：2所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且反义链包含与SEQ ID NO：3所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。以此类推。
在一些实施方案中，所述dsRNA(如siRNA)的正义链和/或反义链中包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸选自以下任一项或其组合：2′-甲氧基修饰的核苷酸、2′-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2′-烷基修饰的核苷酸、2′-取代的烷基修饰的核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-取代的氨基修饰的核苷酸、2′-氟代修饰的核苷酸、2′-脱氧核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代修饰的核苷酸、3′-脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA、GNA。在一些优选的实施方案中，修饰的核苷酸选自以下任一项或其组合：2’-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA。
在一些实施方案中，所述正义链和/或反义链中至少一个磷酸酯键为硫代磷酸酯键。在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间。
在另一些实施方案中，所述正义链和/或反义链中至少一个磷酸酯键为硫代磷酸酯键。在所述正义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；以及
在所述反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间。
本公开中的序数词“第一”、“第二”等不意图限制顺序或等级，仅用于区别开不同的特征、分子、步骤、组成、要素等。
在一些实施方案中，提供了第一修饰策略：
表1-1.第一修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以M1表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续tt。注：添加的tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
在一些实施方案中，提供了第二修饰策略：
表1-2.第二修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以M2表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续tt。注：添加的tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
在一些实施方案中，提供了第三修饰策略：
表1-3.第三修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以M3表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续tt。注：添加的tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
在一些实施方案中，提供了第四修饰策略：
表1-4.第四修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以M4表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续tt。注：添加的tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
在一些实施方案中，提供了第五修饰策略。相较于第一、第二、第三、或第四修饰策略，第五修饰策略在于：
表1-5.修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以MD2表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，正义链3’端不再添加两个连续核苷酸，而是只在反义链的3’端添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；注：反义链的3’端添加tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
当所述正义链长度为21或23nt时，去除正义链末端的两个核苷酸。
在一些实施方案中，提供了第六修饰策略：
表1-6.第六修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以M6表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续tt。注：添加的tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
在一些实施方案中，提供了第七修饰策略：
表1-7.第七修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以M7表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续tt。注：添加的tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
在一些实施方案中，提供了第八修饰策略：
表1-8.第八修饰策略(本申请中dsRNA或siRNA将缀以M5表示)
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续tt。注：添加的tt不涉及核苷酸修饰；(适用时)仅参与硫代磷酸酯键修饰。
本公开还提供了一种dsRNA缀合物(如siRNA缀合物)，其包含前述dsRNA(如siRNA)、和缀合至所述dsRNA(如siRNA)的靶向配体；所述靶向配体靶向哺乳动物的肝细胞。所述靶向配体缀合至所述dsRNA(如siRNA)的正义链3′端。在一些实施方案中，所述双链核糖核酸缺失其正义链3′端的第一和第二位核苷酸后缀合至所述靶向配体。
在一些实施方案中，靶向配体包含至少一个靶向基团、第一接头、分支基团、和第二接头；第一接头连接靶向基团和分支基团，第二接头连接分支基团和siRNA。
在一些实施方案中，所述靶向基团独立地选自以下的任一项：N-乙酰基-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺、N-异丁酰基-半乳糖胺。
在一些实施方案中，所述靶向配体是式(II)所示：
本公开提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)。
本公开提供了一种抑制PNPLA3基因或其表达产物的方法，包括向靶细胞体外施用有效量的本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)。
本公开提供了一种治疗或预防与PNPLA3基因表达相关的疾病的方法，包括步骤：向受试者施用有效量的本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物。
在一些实施方案中，所述疾病选自以下任一项或其组合：NAFLD、酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、肝性脂肪变性、肝硬化、肝癌、肝纤维化、肝炎、肝损伤、肝细胞坏死；所述NAFLD选自以下任一项或其组合：非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；所述肝炎选自以下任一项或其组合：慢性肝炎、HCV肝炎。
本公开提供前述dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防选自以下任一项或其组合：NAFLD、酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、肝性脂肪变性、肝硬化、肝癌、肝纤维化、肝炎、肝损伤、肝细胞坏死；所述NAFLD选自以下任一项或其组合：非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；所述肝炎选自以下任一项或其组合：慢性肝炎、HCV肝炎。
本公开提供了一种递送dsRNA(如siRNA)至肝脏的方法，包括步骤：向受试者施用有效量的本公开的dsRNA缀合物(或siRNA缀合物)。
本公开提供的dsRNA(如siRNA)、药物组合物和dsRNA缀合物(或siRNA缀合物)在体外细胞实验中显示出优异的PNPLA3基因表达抑制活性，具有良好的治疗PNPLA3基因过表达相关的疾病的潜力。
本公开提供的dsRNA(或siRNA)在肝细胞中显示出对PNPLA3基因良好的抑制效果。在一些具体实施方式中，本公开提供的dsRNA(或siRNA)在1nM和0.01nM下均可显著抑制PNPLA3基因的表达，其中在1nM下48h抑制率可高达40％至100％(40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100％、或任意两个数值间的范围)。在0.01nM下48h抑制率可高达15％至100％(15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100％、或任意两个数值间的范围)。
在一些具体实施方式中，本公开提供的dsRNA(或siRNA)在肝细胞中有较高的PNPLA3基因抑制活性，例如，IC50不高于0.05nM、不高于0.04nM、不高于0.03nM、不高于0.02nM、不高于0.01nM、不高于0.009nM、不高于0.008nM、不高于0.007nM、不高于0.006nM、不高于0.005nM、或任意两个数值间的范围。
在一些具体实施方式中，本公开提供的dsRNA缀合物(或siRNA缀合物)在肝细胞中具有较高的PNPLA3基因抑制活性；例如，在dsRNA缀合物(或siRNA缀合物)通过自由摄取进入肝细胞的情况下，IC50不高于50nM、不高于45nM、不高于40nM、不高于35nM、不高于30nM、不高于25nM、不高于20nM、不高于19nM、不高于18nM、不高于17nM、不高于16nM、不高于15nM、不高于10nM、不高于9nM、不高于8nM、不高于7nM、不高于6nM、不高于5nM、不高于4nM、不高于3nM、不高于2.5nM、不高于2.4nM、不高于2.3nM、不高于2.2nM、不高于2.1nM、不高于2nM、不高于1nM、或任意两个数值间的范围。
在又一些具体实施方式中，本公开提供的dsRNA缀合物(或siRNA缀合物)在肝细胞中具有较高的PNPLA3基因抑制活性；例如，在dsRNA缀合物(或siRNA缀合物)通过转染进入肝细胞的情况下，IC50不高于1nM、不高于0.9nM、不高于0.8nM、不高于0.7nM、不高于0.6nM、不高于0.5nM、不高于0.4nM、不高于0.3nM、不高于0.25nM、不高于0.24nM、不高于0.23nM、不高于0.22nM、不高于0.21nM、不高于0.2nM、不高于0.19nM、不高于0.18nM、不高于0.17nM、不高于0.16nM、不高于0.15nM、不高于0.14nM、不高于0.13nM、不高于0.12nM、不高于0.11nM、不高于0.10nM、不高于0.095nM、不高于0.094nM、不高于0.093nM、不高于0.092nM、不高于0.091nM、不高于0.09nM、不高于0.08nM、不高于0.07nM、不高于0.06nM、或任意两个数值间的范围。
附图说明
图1：本公开dsRNA缀合物的示例性结构。
具体实施方式
靶标
靶标是指本公开的双链核糖核酸(或其缀合物)所针对的客体；靶标可以是核酸(基因、mRNA等)，也可以是蛋白(前体、成熟蛋白、同种型、变体等)。在本公开中，靶标尤其是指PNPLA3基因或其表达产物。
本公开中PNPLA3应作做广泛的解读，是指PNPLA3基因本身及其在各阶段中各种形式的表达产物，例如但不限于基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。
本公开中，PNPLA3是人(Homo sapiens)的PNPLA3。
作为一个具体的示例，本公开中的靶标是PNPLA3的mRNA。
PNPLA3的核苷酸或氨基酸信息是本领域公知的，例如但不限于可以从文献或数据库中获取。PNPLA3的mRNA登录号NM_025225.3(本公开中以SEQ ID NO：1显示)。技术人员应当理解，尽管给出了具体的登录号，但是PNPLA3不限于特定数据库中的编号，还意图涵盖现有技术中任何文献、书籍、数据库中的等同指代物。
作为一些具体的示例，本公开中的靶标是SEQ ID NO：1所示序列中的CDS区。
作为另一些具体的示例，本公开中的靶标是CDS以外的其他区。
在一些实施方案中，双链核糖核酸靶向CDS区中至少15个核苷酸长的任意靶点(如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)。
在一些实施方案中，双链核糖核酸靶向CDS区中连续17至25个核苷酸长的任意靶点。
在一些实施方案中，双链核糖核酸靶向选自以下任一个靶点或其组合：SEQ IDNO：1的第339-361位所示的多核苷酸、340-358位所示的多核苷酸、341-363位所示的多核苷酸、342-364位所示的多核苷酸、343-361位所示的多核苷酸、343-363位所示的多核苷酸、344-362位所示的多核苷酸、364-382位所示的多核苷酸、386-408位所示的多核苷酸、387-409位所示的多核苷酸、388-410位所示的多核苷酸、389-407位所示的多核苷酸、389-409位所示的多核苷酸、390-408位所示的多核苷酸、390-410位所示的多核苷酸、441-459位所示的多核苷酸、442-460位所示的多核苷酸、494-512位所示的多核苷酸、517-539位所示的多核苷酸、519-537位所示的多核苷酸、519-541位所示的多核苷酸、520-542位所示的多核苷酸、521-539位所示的多核苷酸、522-540位所示的多核苷酸、522-542位所示的多核苷酸、525-545位所示的多核苷酸、525-543位所示的多核苷酸、553-571位所示的多核苷酸、587-605位所示的多核苷酸、636-654位所示的多核苷酸、710-728位所示的多核苷酸、764-786位所示的多核苷酸、765-787位所示的多核苷酸、766-784位所示的多核苷酸、766-786位所示的多核苷酸、767-785位所示的多核苷酸、767-789位所示的多核苷酸、768-788位所示的多核苷酸、769-789位所示的多核苷酸、818-838位所示的多核苷酸、820-838位所示的多核苷酸、820-840位所示的多核苷酸、821-839位所示的多核苷酸、824-846位所示的多核苷酸、825-843位所示的多核苷酸、825-845位所示的多核苷酸、826-846位所示的多核苷酸、828-846位所示的多核苷酸、828-848位所示的多核苷酸、1082-1100位所示的多核苷酸、1120-1138位所示的多核苷酸、1123-1141位所示的多核苷酸、1143-1161位所示的多核苷酸、1144-1164位所示的多核苷酸、1146-1164位所示的多核苷酸、1147-1165位所示的多核苷酸、1148-1166位所示的多核苷酸、1151-1169位所示的多核苷酸、1194-1212位所示的多核苷酸、1204-1222位所示的多核苷酸、1220-1238位所示的多核苷酸、1467-1489位所示的多核苷酸、1468-1490位所示的多核苷酸、1469-1491位所示的多核苷酸、1471-1489位所示的多核苷酸、1471-1491位所示的多核苷酸、1472-1490位所示的多核苷酸、1472-1492位所示的多核苷酸、1475-1495位所示的多核苷酸、126-144位所示的多核苷酸、154-172位所示的多核苷酸、214-236位所示的多核苷酸、215-237位所示的多核苷酸、216-238位所示的多核苷酸、218-240位所示的多核苷酸、220-242位所示的多核苷酸、228-246位所示的多核苷酸、260-282位所示的多核苷酸、267-285位所示的多核苷酸、293-311位所示的多核苷酸、294-316位所示的多核苷酸、295-317位所示的多核苷酸、297-317位所示的多核苷酸、299-319位所示的多核苷酸、299-317位所示的多核苷酸、414-436位所示的多核苷酸、416-438位所示的多核苷酸、418-440位所示的多核苷酸、468-490位所示的多核苷酸、584-602位所示的多核苷酸、586-606位所示的多核苷酸、590-610位所示的多核苷酸、663-683位所示的多核苷酸、664-684位所示的多核苷酸、665-683位所示的多核苷酸、665-687位所示的多核苷酸、668-690位所示的多核苷酸、670-692位所示的多核苷酸、672-692位所示的多核苷酸、673-695位所示的多核苷酸、674-696位所示的多核苷酸、675-693位所示的多核苷酸、675-697位所示的多核苷酸、676-696位所示的多核苷酸、677-699位所示的多核苷酸、722-740位所示的多核苷酸、751-769位所示的多核苷酸、752-770位所示的多核苷酸、754-772位所示的多核苷酸、755-773位所示的多核苷酸、757-775位所示的多核苷酸、758-776位所示的多核苷酸、758-778位所示的多核苷酸、759-779位所示的多核苷酸、806-824位所示的多核苷酸、845-863位所示的多核苷酸、850-872位所示的多核苷酸、851-873位所示的多核苷酸、854-876位所示的多核苷酸、855-875位所示的多核苷酸、997-1015位所示的多核苷酸、1011-1029位所示的多核苷酸、1011-1031位所示的多核苷酸、1016-1038位所示的多核苷酸、1212-1230位所示的多核苷酸、1262-1280位所示的多核苷酸、1264-1282位所示的多核苷酸、1264-1284位所示的多核苷酸、1264-1286位所示的多核苷酸、1266-1288位所示的多核苷酸、1265-1283位所示的多核苷酸、1265-1285位所示的多核苷酸、1446-1464位所示的多核苷酸、1446-1466位所示的多核苷酸、1447-1465位所示的多核苷酸、1510-1532位所示的多核苷酸、1603-1621位所示的多核苷酸、1604-1626位所示的多核苷酸、1605-1623位所示的多核苷酸、1616-1634位所示的多核苷酸、1647-1667位所示的多核苷酸、1660-1678位所示的多核苷酸、1768-1786位所示的多核苷酸、1768-1788位所示的多核苷酸、1770-1790位所示的多核苷酸、1771-1789位所示的多核苷酸、1801-1819位所示的多核苷酸、1803-1821位所示的多核苷酸、1805-1827位所示的多核苷酸、1806-1826位所示的多核苷酸、1833-1851位所示的多核苷酸、1834-1854位所示的多核苷酸。
在具体的实施方案中，所述双链核糖核酸靶向SEQ ID NO：1所示序列中以下靶点中的任一个或其组合：521-539、675-697、824-846、825-845、826-846；或其等同位置。
在具体的实施方案中，双链核糖核酸的反义链允许和靶点之间存在不多于3个、不多于2个、或不多于1个错配。
以基于SEQ ID No：7、21、41的反义链为例，允许和靶点之间存在1个错配，而不影响其siRNA、dsRNA或其缀合物对靶标基因的抑制活性。
在具体的实施方案中，双链核糖核酸的正义链允许和靶点之间差异不多于3个、不多于2个、或不多于1个核苷酸。
在具体的实施方案中，双链核糖核酸的反义链允许和靶点完全互补。
双链核糖核酸
双链核糖核酸(dsRNA)是指由两条多核苷酸链通过完全互补或部分互补而形成的RNA分子。
在干扰领域中，dsRNA用于调节(本公开中尤其用于干扰、抑制、沉默、失活)靶标的表达或活性。
虽不限于具体理论，dsRNA的代表性工作方式为：Dicer(一种核糖核酸酶)将dsRNA切割为约19至23nt的siRNA，siRNA在其3′端有两个tt构成的突出端；然后siRNA结合到核糖核酸酶复合物上形成RISC(RNA-induced silencing complex)；该复合体将siRNA解聚成单链以激活RISC；活化的RISC通过碱基互补配对原理切割具有同源序列的靶标转录体，最终导致基因沉默。
鉴于此，dsRNA、siRNA(而无论其是否带有突出端)都应落入本公开的范围之内。
在一些实施方案中，dsRNA是siRNA。
在一些具体的实施方案中，dsRNA是带有突出端的siRNA。
在另一些具体的实施方案中，dsRNA是去除突出端的siRNA。
在又一些实施方案中，dsRNA是shRNA。
siRNA
siRNA是一种双链结构的多核苷酸。在siRNA引入细胞中后干扰或抑制细胞中靶标的表达或活性。作为一个示例，siRNA靶向并结合靶标mRNA中的互补核苷酸序列。
“干扰或抑制细胞中靶标的表达或活性”是指相对于未经处理的或对照样品中的表达或活性，表达或活性的降低或阻断，不能解读为表达或活性一定被彻底消除。
在RNA介导的基因沉默的情形中，siRNA的正义链(又称ss或有义链)是指包含与靶标mRNA相同或基本上相同的序列的链；siRNA的反义链(又称as)是指具有与靶标mRNA互补(或部分互补)的序列的链。
通过本领域技术人员已知的技术经化学合成或构建siRNA。可以通过本领域已知的技术修饰siRNA的一种或多种核苷酸。除了在核苷酸的水平上修饰之外，也可以修饰主链。例如，siRNA可以使用本领域已知的方法通过化学修饰(例如通过使用2’-OMe和/或2’-F和/或硫代磷酸修饰)得到调节。其他修饰包括使用小分子(例如，糖分子)、氨基酸、肽、胆固醇与siRNA偶联。
核苷酸是指由嘌呤碱基(或嘧啶碱基)、核糖(或脱氧核糖)以及磷酸组成的化合物。本公开中，核苷酸应作广泛理解，涵盖核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。技术人员在上下文中可以明确得知核苷酸是指核糖核苷酸，还是指脱氧核糖核苷酸，还是二者兼有。腺嘌呤核苷酸表示为AMP、鸟嘌呤核苷酸表示为GMP、胞嘧啶核苷酸表示为CMP、尿嘧啶核苷酸表示为UMP、胸腺嘧啶核苷酸表示为TMP。在序列中，常常分别用小写字母a、g、c、u、t表示核苷酸。
术语“互补”或“反向互补”是指在双链核酸中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)相配对；胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)相配对。在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)相配对；胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)相配对。当一条链上的腺嘌呤与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的。从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。
术语“至少部分反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配。
术语“完全互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
术语“错配”意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对。
术语“平端”是指在dsRNA(如siRNA)的末端，没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即没有突出。
当两个末端都是平末端时，dsRNA(如siRNA)在其全长范围内是双链结构(文中也作双链区)。
术语“突出端”是指当dsRNA(如siRNA)的一条链的一个3’端延伸超出另一条链的5’端时从该dsRNA(如siRNA)的双链区结构突出的一个或多个不成对的核苷酸，或反之亦然。
正义链或反义链的“5’端”、“5’末端”可替换使用。
正义链或反义链的“3’端”、“3’末端”可替换使用。
术语“化学修饰”或“修饰”是指任何经化学手段而进行的改变，例如化学基团的添加或去除、或以一个化学基团取代另一个化学基团。
术语“修饰的核苷酸”选自以下任一项或其组合：2′-甲氧基修饰的核苷酸、2′-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2′-烷基修饰的核苷酸、2′-取代的烷基修饰的核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-取代的氨基修饰的核苷酸、2′-氟代修饰的核苷酸、2′-脱氧核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代修饰的核苷酸、3′-脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA、GNA。一些实施方案中，修饰的核苷酸相互独立地选自：2′-甲氧基修饰的核苷酸、2′-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰。
“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3′-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2′-、4′-位处以提供一个2′，4′-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(1)所示，ENA如式(2)所示，cET BNA如式(3)所示：
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开而形成的核苷酸，如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(4)所示，GNA如式(5)所示：
上述式(4)和式(5)中，R选自H、OH或烷氧基。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1′-位移动至2′-位或3′-位而形成的化合物，如式(6)或(7)所示：
上述式(6)、式(7)化合物中，R选自H、OH、F、或非氟基团；
上述式(1)至式(7)化合物中，Base表示碱基，例如A、U、G、C、或T。
术语“烷基”包括直链、支链或环状的饱和烷基。例如，烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、环己基。示例性的，“C1-6烷基”中的“C1-6”是指包含有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链、支链或环状形式排列的基团。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。
术语“烷氧基”(-O-烷基)在本文中是指烷基基团通过氧原子与分子其余部分相连，其中所述烷基如本文中所定义。烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基。
作为一个示例，修饰的核苷酸是如下所示结构：
其中，Base表示碱基，选自A、U、G、C、或T。核糖基团2’位的羟基被R取代。这些核糖基2’位的羟基可以为本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，2’-氟代(2’-F)修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸。
术语“2’-氟代修饰的核苷酸”或“2’-F核苷酸”指核苷酸的核糖基2′位的羟基被氟取代形成的核苷酸。在本公开中，用“nf”表示2’-氟代修饰的核苷酸，其中n表示a、g、c、u、t中的任一个。以序列gscsaggucfcufcfufcagaucuustst为例，“cf”表示2’-氟代修饰的胞苷酸。“uf”表示2’-氟代修饰的尿苷酸。
术语“2’-甲氧基修饰的核苷酸”或“2’-OMe核苷酸”指核苷酸的核糖基2′位的羟基被甲氧基取代形成的核苷酸。在本公开中，用“nm”表示2’-甲氧基修饰的核苷酸，其中n表示a、g、c、u、t中的任一个。“cm”表示2’-甲氧基胞苷酸。“um”表示2’-甲氧基尿苷酸。
术语“硫代磷酸酯键”是指磷酸酯键中至少一个氧原子被硫原子取代形成硫代磷酸酯键。硫代磷酸酯键可以稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的特异性。示例性的，硫代磷酸酯键结构如下所示：
shRNA
shRNA(短发夹RNA)是可以克隆至表达载体并表达siRNA的RNA分子。其包括两个短反向重复序列，中间由茎环序列分隔而形成的发夹结构。在生物体中递送siRNA的一种示例性方式是，将siRNA序列设计为shRNA克隆进质粒载体中，当送入生物体内时，该发夹序列被表达出来，形成dsRNA，并随后经RNAi通路，生成siRNA。
鉴于此，siRNA的前体shRNA应落入本公开的范围之内。技术人员可以根据siRNA序列和表达载体设计对应的shRNA。
靶向PNPLA3的dsRNA
本公开提供一种靶向PNPLA3的dsRNA(作为示例，siRNA)。
一些实施方案中，提供靶向PNPLA3基因(登录号NM_025225.3)的dsRNA。
一些实施方案中，本公开提供了一种dsRNA，其包含形成双链区的正义链与反义链；所述正义链包含至少17个连续核苷酸，与SEQ ID NO：1所示核苷酸中的目标序列(例如，不限于前述限定的靶点)差异不超过3个核苷酸；所述反义链包含至少17个连续核苷酸序列，与SEQ ID NO：1互补核苷酸中的目标序列差异不超过3个核苷酸。
在一些实施方案中，正义链和反义链各自独立地具有17至34个、17至33个、17至32个、17至31个、17至30个、17至29个、17至28个、17至27个、17至26个、17至25个、18至33个、18至32个、18至31个、18至30个、18至29个、18至28个、18至27个、18至26个、18至25个、18至24个、18至23个、19至25个、19至24个、或19至23个核苷酸。
在具体的实施方案中，所述正义链的长度为19至23个核苷酸，反义链的长度为19至23个核苷酸。
在一些实施方案中，正义链和反义链长度相同或不同。
本公开提供的dsRNA的正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25。
一些实施方案中，本公开的dsRNA中，所述正义链与所述反义链选自以下任一组合：
所述正义链包含与SEQ ID NO：2所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：3所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：4所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：5所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：6所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：7所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：8所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：9所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：10所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：11所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：12所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：13所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：14所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：15所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：16所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：17所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：18所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：19所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：20所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：21所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：22所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：23所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：24所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：25所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：26所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：27所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：28所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：29所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：30所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：31所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：32所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：33所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：34所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：35所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：36所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：37所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：38所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：39所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：40所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：41所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：42所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：43所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：44所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：45所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：46所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：47所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：48所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：49所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：50所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：51所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：52所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：53所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：54所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：55所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：56所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：57所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：58所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：59所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：60所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：61所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：62所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：63所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：64所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：65所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：66所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：67所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：68所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：69所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：70所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：71所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：72所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：73所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：74所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：75所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：76所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：77所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：78所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：79所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：80所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：81所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：82所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：83所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：84所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：85所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：86所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：87所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：88所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：89所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：90所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：91所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：92所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：93所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：94所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：95所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：96所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：97所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：98所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：99所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：100所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：101所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：102所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：103所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：104所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：105所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：106所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：107所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：108所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：109所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：110所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：111所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：112所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：113所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：114所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：115所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：116所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：117所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：118所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：119所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：120所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：121所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：122所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：123所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：124所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：125所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：126所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：127所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：128所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：129所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：130所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：131所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：132所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：133所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：134所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：135所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：136所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：137所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：138所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：139所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：345所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：346所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：347所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：348所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：349所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：350所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：351所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：352所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：353所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：354所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：355所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：356所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：357所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：358所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：359所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：360所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：361所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：362所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：363所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：364所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：365所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：366所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：367所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：368所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：369所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：370所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：371所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：372所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：373所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：374所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：375所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：376所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：377所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：378所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：379所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：380所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：381所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：382所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：383所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：384所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：385所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：386所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：387所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：388所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：389所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：390所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：391所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：392所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：393所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：394所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：395所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：396所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：397所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：398所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：399所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：400所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：401所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：402所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：403所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：404所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：405所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：406所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：407所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：408所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：409所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：410所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：411所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：412所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：413所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：414所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：415所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：416所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：417所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：418所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：419所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：420所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：421所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：422所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：423所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：424所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：425所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：426所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：427所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：428所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：429所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：430所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：431所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：432所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：433所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：434所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：435所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：436所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：437所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：438所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：439所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：440所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：441所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：442所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：443所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：444所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：445所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：446所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：447所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：448所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：449所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：450所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：451所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：452所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：453所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：454所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：455所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：456所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：457所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：458所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：459所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：460所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：461所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：462所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：463所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：464所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：465所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：466所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：467所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：468所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：469所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：470所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：471所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：472所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：473所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：474所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：475所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：476所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：477所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：478所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：479所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：480所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：481所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：482所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：483所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：484所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：485所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：486所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：487所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：488所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：489所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：490所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：491所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：492所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：493所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：494所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：495所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：496所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：497所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：498所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：499所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：500所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：501所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：502所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：503所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：504所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：505所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：506所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：507所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：508所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：509所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：510所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。
一些具体的实施方案中，本公开dsRNA(或siRNA)的正义链和反义链选自表7中任一对所示的多核苷酸。
一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA中，所述正义链和/或反义链中包含至少一个修饰的核苷酸。
一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA中，所述正义链和/或反义链中包含至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自以下任一项或其组合：2’-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA。
I.本公开的dsRNA或siRNA
在一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了如下的修饰策略。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
2)在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起偶数位中的至少一个位点；更优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于全部偶数位；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于5’端起奇数位中的至少一个位点；更优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于全部奇数位；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
5)反义链的5’端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
在一些实施方案中，5’磷酸衍生基团包括但不限于
II.本公开的dsRNA或siRNA
在又一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了其他的修饰策略，如下。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
2)在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、14、16位中的一个或多个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
5)反义链的5’端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
III.本公开的dsRNA或siRNA
在又一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了其他的修饰策略，如下。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
2)在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、8、9、14、16位中的一个或多个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
5)反义链的5’端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
IV.本公开的dsRNA或siRNA
在又一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了其他的修饰策略，如下。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
2)在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、14、16位中的一个或多个位点；
GNA修饰位于5’端起第7位；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的全部其余位点；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
5)反义链的5’端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
V.本公开的dsRNA或siRNA
在又一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了其他的修饰策略，如下。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
2)在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、14、16位中的一个或多个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
5)反义链的5’端的核苷酸为缺失5’磷酸基团的核苷酸。
VI.本公开的dsRNA或siRNA
在又一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了其他的修饰策略，如下。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
2)在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、8、9、14、16位中的一个或多个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
5)反义链的5’端的核苷酸为缺失5’磷酸基团的核苷酸。
VII.本公开的dsRNA或siRNA
在又一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了其他的修饰策略，如下。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
2)在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、14、16位中的一个或多个位点；
GNA修饰位于5’端起第6位；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的全部其余位点；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)在所述正义链和反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
5)反义链的5’端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
VIII.本公开的dsRNA或siRNA
在又一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA采取了其他的修饰策略，如下。
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA：
1)在所述正义链中：同I至VII中的1)；
2)在所述反义链中：同I至VII中的2)；
3)当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，仅在反义链的3’端添加两个连续核苷酸(作为示例，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)；
4)当所述正义链长21或23个核苷酸时，在所述正义链的基础上使其缺失3’端的两个连续核苷酸；
5)在所述正义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
6)在所述反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
7)反义链的5’端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团；或者为缺失5’磷酸基团的核苷酸。
另一方面，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为通式。
在本公开中，通式的编号体现Mx(y)-as或Mx(y)-ss，其中Mx为修饰策略的编号，y表示链的长度，as表示反义链，ss表示正义链。
1.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M1)
在一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为：
所述正义链具有通式M1(19)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(19)-as所示结构：
其中：
n表示a、c、u、g中的任一个核苷酸；n随后的数字表示从5’端起的位点；
f表示在该位点是2’-氟代修饰的核苷酸；
m表示在该位点是2’-甲氧基修饰的核苷酸；
s表示与其紧邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接；
p1表示5’端的核苷酸为5’-磷酸核苷酸。
2.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M1)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(21)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(21)-as所示结构：
符号的注解同上。
3.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M1)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(23)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(23)-as所示结构：
符号的注解同上。
4.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(MD2)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式MD2(19)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(19)-as所示结构。
符号的注解同上。
5.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(MD2)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式MD2(21minus2)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(21)-as所示结构。
符号的注解同上。
6.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(MD2)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式MD2(23minus2)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(23)-as所示结构。
符号的注解同上。
7.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M2、MD2)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M2-as所示结构：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M2-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M2-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M2-as所示。
符号的注解同上。
8.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M3、MD2)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M3-as所示结构：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M3-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M3-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M3-as所示。
符号的注解同上。
9.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M4、MD2)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M4-as所示结构：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M4-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M4-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M4-as所示；
其中，GNA表示在该位点是GNA修饰的核苷酸；其他符号的注解同上。
10.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M5)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M5-as所示结构：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M5-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M5-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M5-as所示；
其中，GNA表示在该位点是GNA修饰的核苷酸；其他符号的注解同上。
11.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M6)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M6-as所示结构：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M6-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M6-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M6-as所示。
p0为缺失缺失5’-磷酸基团的核苷酸，其余符号的注解同上。
12.通式所示的本公开dsRNA或siRNA(M7)
在另一些实施方案中，本公开的dsRNA或siRNA可以表示为以下通式：
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M7-as所示结构：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M7-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M7-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M7-as所示。
p0为缺失缺失5’-磷酸基团的核苷酸，其余符号的注解同上。
在前述实施方案中，正义链和/或反义链中至少一个磷酸酯键为修饰的磷酸酯键。例如，但不限于，所述修饰使得所述dsRNA在生物样品或环境中具有改善的活性(如提高的稳定性)。
在前述实施方案中，所述修饰的磷酸酯键为硫代磷酸酯键。具体地，硫代磷酸酯键是指一个非桥接氧原子被硫原子替代而修饰的磷酸二酯基。
本公开中，“磷酸酯键”包括磷酸一酯基、磷酸二酯基或磷酸三酯基。若无特别说明，天然核苷酸间键磷酸酯键为磷酸二酯基。
在前述实施方案中，当公开的dsRNA不包含突出端时，允许在正义链和/或反义链的3’端额外添加突出端以提高性能(如稳定性)。例如，在正义链和/或反义链的3’端额外添加两个连续核苷酸构成的突出端。作为一个非限制示例，tt突出端。以SEQ ID No.12和SEQID No.13形成的19met dsRNA为例，其两端是平端，可以使二者带有突出端(如tt)，而形成SEQ ID No.140和SEQ ID No.141所示的dsRNA。额外添加突出端的dsRNA仍落入本公开的范围。
在一些具体的实施方式中，5’磷酸基团或磷酸衍生基团共价连接在戊糖的5’碳上，形成选自以下的任一结构：
其中，N表示碱基(A、U、G、C或T)。R’为羟基或被取代(例如，2’-氟代、2’-甲氧基)。
在一些具体的实施方式中，本公开的dsRNA(如siRNA)包含带修饰的正义链和反义链，所述正义链和反义链选自表8-1、表8-2、表8-3、表8-4、表8-5、表8-6、表8-7、表8-8中任一对所示的多核苷酸。
技术人员知晓，表述“正义链和反义链选自表8-1、表8-2、表8-3、表8-4、表8-5、表8-6、表8-7、表8-8中任一对所示的多核苷酸”是一种简洁的表述，这意味着表8-1、表8-2、表8-3、表8-4、表8-5、表8-6、表8-7、表8-8中任一编号的siRNA都明确地按照以下相同的格式得以充分描述：“所述正义链包含SEQ ID NO：X所示的多核苷酸，所述反义链包含SEQ IDNO：X所示的多核苷酸”。作为一个示例，针对N-ER-FY006009M1编号的修饰的siRNA，其正义链包含SEQ ID NO：140所示多核苷酸，且反义链包含SEQ ID NO：141所示多核苷酸。以此类推。
dsRNA缀合物(如siRNA缀合物)
本公开还提供了一种dsRNA缀合物，其包含上述dsRNA(如siRNA)中的任一种和缀合至所述dsRNA(如siRNA)的靶向配体。
“缀合”是指两个或多个化学部分之间以共价连接的方式彼此连接。
“缀合物”是指各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。
“dsRNA/siRNA缀合物”表示一个或多个化学部分共价连接至dsRNA/siRNA而形成的化合物。
在一些实施方案中，dsRNA(如siRNA)和所述靶向配体共价或非共价连接。
在一些实施方案中，所述靶向配体缀合至所述dsRNA(如siRNA)的正义链3’端。
在一些实施方案中，靶向配体通过磷酸酯键(或硫代磷酸酯键)与dsRNA(如siRNA)末端连接。
在一些实施方案中，靶向配体通过磷酸酯键(或硫代磷酸酯键)与dsRNA(如siRNA)正义链3’端直接连接。
本公开的dsRNA(如siRNA)正义链的3’端具有延伸出双链区的突出的核苷酸，将位于正义链中3’端的突出的核苷酸去除后形成的序列作为用于连接缀合基团的核苷酸序列，在正义链的3’端连接靶向配体，形成dsRNA缀合物。
在一些实施方案中，靶向配体能够靶向哺乳动物(尤其是人)的肝细胞。
在一些实施方案中，所述靶向配体包含：
-至少一个靶向基团、
-第一接头、
-分支基团、和
-第二接头。
在一些实施方案中，第一接头连接所述靶向基团和所述分支基团。
“分支基团”意指具有至少3个以下位置的一组原子，所述位置能够与至少3个靶向基团形成共价连接。
在一些具体的实施方案中，所述分支基团是式(I)所示：
本公开中第一接头为靶向基团与分支基团间的连接部分，第一接头在分支基团和各靶向基团之间发挥连接、间隔作用。
在一些实施方案中，第一接头的一端直接/间接缀合至靶向基团，而另一端直接/间接连接至分支基团。
在一些实施方案中，本文公开的靶向配体包括多个第一接头和多个靶向基团。
在一些实施方案中，本文公开的靶向配体包括2个第一接头和2个靶向基团。
在一些实施方案中，本文公开的靶向配体包括3个第一接头和3个靶向基团。
在一些实施方案中，第一接头的非限制性示例为1至20个选自以下的任一项或其组合：
在一些具体的实施方案中，靶向配体包括具有如下所示结构的第一接头：
在一些实施方案中，第二接头连接所述分支基团和本公开的dsRNA(如siRNA)。
在一些实施方案中，第二接头的一端直接/间接缀合至dsRNA(如siRNA)，而另一端直接/间接连接至分支基团。
在一些实施方案中，第二接头的非限制性示例选自以下任一项或其组合：
其中：
R1和R2各自独立的选自：-S-、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、CH2o-、-NH-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-NH-、-NH(CO)NH-、3-12元杂环基；
R3选自：氘、卤素、烷基、氨基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羟基、巯基、烷巯基、烷氧基、烷氨基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基；
k选自0至4的整数；
j选自0至20的整数。
在一些具体的实施方案中，靶向配体包括具有如下所示结构的第二接头：
一些实施方案中，靶向配体协助引导将与其连接的治疗性试剂递送至所需靶位置。靶向基团可以结合细胞(尤其指的是肝细胞)或肝细胞表面受体，并且启动内吞作用以促进治疗性化合物(siRNA)进入肝细胞。靶向基团对细胞受体或细胞表面分子具有亲和性。含有靶向基团的靶向配体可以与siRNA和其它化合物连接以将试剂靶向至肝细胞或其表面受体。
一些实施方案中，靶向基团的类型包括碳水化合物、胆固醇和胆甾醇基团或类固醇。可以结合细胞受体的靶向基团包括糖，如半乳糖、半乳糖衍生物(如N-乙酰基-半乳糖胺，N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺)、甘露糖和甘露糖衍生物)。
已知结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的靶向基团可特别用于引导递送siRNA至肝脏。ASGPR在肝细胞上大量表达。靶向ASGPR的细胞受体靶向基团包括半乳糖和半乳糖衍生物。具体而言，半乳糖衍生物的簇(由2、3、4或超过4个GalNAc组成的簇)可以促进肝细胞中某些化合物的摄取。
一些实施方案中，靶向配体可以包括2、3或4个相同或不同的靶向基团。
在一些实施方案中，各靶向基团是半乳糖胺衍生物(N-乙酰基-半乳糖胺)。可用作靶向基团且对ASGPR具有亲和性的其他糖，例如但不限于：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺、N-异丁酰基-半乳糖胺。
在一些实施方案中，靶向配体包括3个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(如N-乙酰基-半乳糖胺)，其各自对ASGPR均具有亲和性。
在一些实施方案中，靶向配体包括4个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(如N-乙酰基-半乳糖胺)，其各自对ASGPR均具有亲和性。
在具体实施方案中，本公开提供的靶向配体具有如下所示结构：
在一些具体的实施方案中，本公开的dsRNA缀合物选自表9中任一组所示的缀合物。
技术人员知晓，表述“dsRNA缀合物选自表9中任一组所示的缀合物”是一种简洁的表述，这意味着表9中任一编号的缀合物都明确地得以充分描述：该缀合物的正义链是表9中对应的“正义链5’至3’”一栏中结构所示，反义链是对应的“反义链5’至3’”一栏中结构所示。
作为一个示例，针对N-ER-FY006009M1-L96编号的缀合物，其正义链是gmsumsgmgmamumgfcmcfufufgmgmumamumgmumumL96所示，目反义链是plamsafscmafumafcmcfamafgmgfcmafumcfcmafcmstst所示。以此类推。
药物组合物
本公开另一方面提供一种药物组合物，其包含：
-本公开的任一项dsRNA(如siRNA)或其缀合物，和
-一种或多种药学上可接受的载剂。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种活性成分(或其可药用盐)与其他化学组分的混合物。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
“药学上可接受的载剂”包括但不限于任何已经被食品和药物管理机构批准用于人或动物使用可接受的助剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、渗透压调节剂等渗剂、溶剂或乳化剂(例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy第19版，1995)。作为一个非限制性的示例，所述药学上可接受的载剂选自以下任一项或其组合：盐水溶液、糖溶液、聚合物、肽(如多肽)、脂质、凝胶、胶束、二氧化硅纳米颗粒、金属纳米颗粒、质粒、病毒载体。
本公开的dsRNA(如siRNA)或其缀合物可以其可药用盐(选自无机盐或有机盐)的形式存在。本公开dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)可与酸性或碱性物质反应成相应盐。
“与酸性物质反应成相应盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。
“与碱性物质反应成相应盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐，优选钠盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。
一些实施方案提供了包含一种或多种dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或其可药用盐的药物组合物。
在一些实施方案中，可以将本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或配制品。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于多个因素，包括但不限于施用途径、疾病程度、或待施用的剂量。
在一些实施方案中，药物组合物包含合适的药学上可接受的稀释剂或载体。
在一些实施方案中，药物组合物包含无菌盐溶液。在一些实施方案中，这样的药物组合物由无菌盐溶液和一种或多种dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)组成。在一些实施方案中，该无菌盐水是药用级盐水。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)和无菌水；或由一种dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)和无菌水组成。在一些实施方案中，该无菌水是药用级水。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)和磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，药物组合物由一种或多种本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)和无菌缓冲液(如PBS)组成。在一些实施方案中，该无菌PBS是药用级PBS。
所述缓冲液的pH可以为5.5至8.5(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)，例如可以为pH值5.5-8.5的PBS缓冲液。
所述稳定剂可以为山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，保护剂的含量可以为0.01至30％w/w。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700mOsm/kg。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
药物组合物可方便地以单位剂型呈现。通常，药物组合物可配制为任何适当的剂型，例如但不限于，注射剂、片剂、胶囊、凝胶等。药物组合物包括但不限于溶液、乳液、含脂质体制剂。
在一个非限制示例中，将溶于注射用水或生理盐水的本公开dsRNA缀合物制备成预填充式注射器(皮下注射型)的形式。
药盒或试剂盒
本公开还提供了一种药盒或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器独立地包含本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)、药物组合物。
预防/治疗方法
本公开提供一种上述dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)在制备预防/治疗受试者疾病的药物中的用途，在一些实施方案中，所述疾病是肝源性疾病或PNPLA3基因表达相关的疾病。
在一些实施方案中，与PNPLA3基因表达相关的疾病选自：NAFLD、酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、肝性脂肪变性、肝硬化、肝癌、肝纤维化、肝炎、肝损伤、肝细胞坏死。所述NAFLD选自以下任一项或其组合：非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；所述肝炎选自以下任一项或其组合：慢性肝炎、HCV肝炎。
本公开另一方面提供一种治疗受试者疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)，或药物组合物。
本公开另一方面提供一种抑制受试者体内PNPLA3 mRNA表达的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物。
本公开另一方面提供一种体内递送dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)至肝脏的方法，向受试者施用本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)。
本文所公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)、药物组合物可以在细胞、细胞群、组织或受试者中降低靶标mRNA的水平，包括：向受试者施用治疗有效量的本文所述的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物。
递送可以是通过、注射、植入、皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、透皮、气道、鼻、口服、直肠等给药。
一些实施方案中，本公开提供的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物可以通过注射施用，例如，静脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内注射。
各种递药系统是已知的，可以用于本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物，例如封装在脂质体、微粒、微囊、能够表达该化合物的重组细胞中、构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分。
dsRNA(如siRNA)给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒、碳纳米管、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒、PEI、PAMAM、PLL、DOTAP、PLGA、PPEEA、PDMAEMA或其衍生物。
“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”交替使用，并且包括任何水平的抑制。可通过变量与对照水平相比的绝对或相对减少来评估抑制。该对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平、或从未经处理的受试者或样品的水平。例如，可以采用mRNA剩余表达量来表征dsRNA(如siRNA)对靶标基因的抑制程度。
在一些实施方案中，上述dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物当接触到表达靶标基因的细胞时，会抑制靶标基因的表达至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。
在一些实施方案中，上述dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物当接触到表达靶标基因的细胞时，引起的靶标基因mRNA剩余表达百分比为不高于99％、不高于95％、不高于90％、不高于85％、不高于80％、不高于75％、不高于70％、不高于65％、不高于60％、不高于55％、不高于50％、不高于45％、不高于40％、不高于35％、不高于30％、不高于25％、不高于20％、不高于15％、或不高于10％。
在一些实施方案中，dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物当接触到表达靶标基因的细胞时，在保持在靶(on-target)活性的同时，将脱靶(off-target)活性减少了至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
在一些实施方案中，dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)或药物组合物当接触到表达靶标基因的细胞时，使在靶活性提高至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％的同时，将脱靶活性减少了至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
本公开还提供了一种用于沉默细胞中靶标基因或其表达产物的方法，该方法包括将本公开的dsRNA(如siRNA)(或其缀合物)和/或药物组合物引入肝细胞中的步骤。
“有效量”是指药物活性成分(如siRNA或其缀合物)在受试者中引发期望效果的量。在具体的实施方案中，本领域技术人员可以基于对多种因素的考虑(例如经由临床试验)来确定有效量的选择，所述因素包括待治疗的疾病、所涉及的症状、施用途径、疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状态和本领域技术人员已知的其他因素。
具体实施方案中的有效量，可以从来源于动物模型测试系统的剂量-应答曲线而得到，并允许根据医生的判断和每位患者的情况来决定。其中，动物和人的用药量的相互关系描述于Freireich等人1966，Cancer Chemother Rep 50：219，且人体表面积可以近似地由患者的身高和体重确定。
患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。例如，在制备药物的过程中，一般认为成人体重为50-70kg，可以最初可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如，可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见，也可参考(黄继汉等，“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，《中国临床药理学与治疗学》，2004Sep；9(9)：1069-1072)来确定。在一些实施方式中，可以使用按照人和小鼠的体表面积折算系数0.0026来换算人和小鼠的剂量。
本文中，同一药物活性成分(指的是单一的药物化合物)或不同药物活性成分(指的是两个以上的药物化合物)可一次性施用，或者可分成许多更小的单位剂量，以一定时间间隔施用。相邻两次的施用可间隔30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、一天半、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。
术语“包括”或“包含”意指包括但不限于该词之后的元素。“包括”或“包含”表示：所列出的元素是必需的或强制性的，但是其他元素是可选的并且可以存在或不存在的。
短语“由...组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。
在本公开的化学结构式中，或表示连接一个或多个基团。
术语“直接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团在没有任何间插原子或原子基团的情况下连接。
术语“间接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团通过中间基团、化合物(例如接头)连接。
实施例
实施例1.siRNA的合成
通过固相亚磷酰胺法，按照核苷酸排布顺序自3′-5′方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。其中：1)两个核苷酸之间采用磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应；2)两个核苷酸之间采用硫代磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、盖帽、硫化四步反应。
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4，4’-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5∶1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1∶10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1∶65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1∶1的CapA和CapB的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐：N-甲基咪唑：固相载体上连接的核酸序列＝1∶1∶1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30∶1。反应在四氢呋喃：水：吡啶＝3∶1∶1的混合溶剂中进行。
每一步硫化反应的条件相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120∶1。反应在乙腈：吡啶＝1∶1的混合溶剂中进行。
待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干得到正义链和反义链；最后将两条链进行加热退火得到产品，冻干，得到冻干粉。
实施例2.对siRNA的修饰
根据前述表1-1、表1-2、表1-3、表1-4、表1-5、表1-6、表1-7、或表1-8的修饰策略，按照公知方法或委托第三方合成带修饰核苷酸和硫代磷酸酯键的siRNA。
实施例3.siRNA缀合物(GalNAc-siRNA)的合成
1.siRNA缀合物具有如下式(V)所示的结构：
2.siRNA缀合物的合成过程(方法见于WO2014025805A1)：
第一步，通过将DMTr-L96和丁二酸酐反应，得到化合物L96-A：
制备过程：将DMTr-L96、丁二酸酐、4-二甲基氨基吡啶和二异丙基乙胺加入二氯甲烷中，25℃下搅拌反应24小时，然后用0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷洗涤三次，合并有机相减压蒸干得粗品。然后柱层析纯化得到得到纯品L96-A。
第二步，将L96-A与NH2-SPS反应得到L96-B：
制备过程：将L96-A、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)混合溶于乙腈中，室温搅拌5分钟得到均一溶液，加入氨甲基树脂(100-200目)至反应液体中，25℃下开始摇床反应，反应18小时后过滤，滤饼依次用二氯甲烷和乙腈洗涤，得滤饼。
所得滤饼用CapA/CapB混合溶液进行盖帽反应得到L96-B，即为含有靶向配体的固相载体。然后，在偶联反应下将核苷单体连接至靶向配体，按照实施例1和实施例2所述的siRNA合成方法，合成连接至靶向配体的siRNA正义链；采用实施例1和实施例2所述的siRNA合成方法，合成siRNA反义链；二者退火生成本公开的siRNA缀合物。
实施例4.siRNA的抑制能力测试
一、实验材料：
Hep3B细胞，ATCC，货号HB-8064；
RNAiMAX转染试剂，购自Invitrogen，货号13778-150；
Opti-medium：减血清培养基，购自Gibco，货号31985-070；
MEM培养基：购自Gibco，货号11090-081；
RNA提取试剂盒，96Kit，货号QIAGEN-74182；
Fastking RT试剂盒(含gDNA酶)，购自TIANGEN，货号KR116-02；
PBS：购自Gibco，货号10010-023；
TaqMan探针引物(GAPDH)购自Thermo，货号Hs02786624_g1
TaqMan探针引物(PNPLA3)购自Thermo，货号Hs00228747_m1；
FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)，购自Roche，货号4913914001。
二、实验方法：
1.取Hep3B细胞，先用DPBS洗涤后，加入胰蛋白酶进行消化，调整细胞密度至5.5×105细胞/mL，然后以每孔20,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。将Hep3B细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养过夜。
2.将待测siRNA干粉以低温高速离心，然后用超纯蒸馏水(ULtraPure DistilledWater)溶解，配制成100μM siRNA母液。
3.配制20nM的siRNA稀释液Z和0.2nM的siRNA稀释液W
(1)0.1μM siRNA贮备液Y和0.001μM siRNA贮备液J的制备：
a)取上述步骤2中制得的100μM siRNA母液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为10μM的siRNA稀释液；
b)取步骤a)中制得的10μM的siRNA稀释液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为1μM的siRNA贮备液Q；
c)取步骤b)中制得的1μM的siRNA贮备液Q2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.1μM的siRNA贮备液Y；
d)取步骤c)中制得的0.iLμM的siRNA贮备液Y2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.01μM的siRNA贮备液E；
e)取步骤d)中制得的0.01μM的siRNA贮备液E2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.001μM的siRNA贮备液J；
(2)取上述配置好的siRNA贮备液Y和siRNA贮备液J各2μL，分别加入8μL Opti-medium，分别得到20nM的siRNA稀释液Z和0.2nM的siRNA稀释液W。
4.转染Hep3B细胞
(1)取RNAiMAX转染试剂3μL，加入97μL Opti-medium，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与步骤3中制得的20nM siRNA稀释液Z以1：1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μL转染混合物加入到96孔板中转染步骤1中培养的Hep3B细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为1nM)；
(2)取RNAiMAX转染试剂3μL，加入97μL Opti-medium，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与步骤3中制得的0.2nM siRNA稀释液W以1：1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μL转染混合物加入到96孔板中转染步骤1中培养的Hep3B细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为0.01nM)。
上述转染后培养48小时，每个浓度(1nM和0.01nM)设置2个重复。
5.根据RNeasyKit说明书提取步骤4中获得的Hep3B细胞中的总RNA。
6.利用Fastking RT Kit(含gDNA酶)试剂盒对提取的总RNA进行逆转录至cDNA，按照以下步骤进行：
(1)按照下表用gDNA酶除去gDNA：
表2
体积/μL
5×gDNA缓冲液 2
样本(RNA) 8
42℃，3min；4℃静置。
(2)向步骤(1)得到的体系中加入如下所述各试剂并进行逆转录：
表3
体积/μL
FastKing RT混合酶 1
FQ-RT混合引物 2
10×King RT缓冲液 2
无RNA酶ddH2O 5
42℃，15min；95℃，3min。
(3)将步骤(2)所得逆转录产物储存在-20℃以进行实时PCR分析。
7.实时PCR分析
(1)如下表所示制备qPCR反应混合物，在整个操作过程中，所有试剂都放置在冰上；
表4
体积/μL
FastStart Universal SYBR Green Master 5
target special gene TaqMan探针引物(PNPLA3) 0.4
target special gene TaqMan探针引物(GAPDH) 0.4
步骤6得到的cDNA模版和H2O 4.2
总体积 10
(2)如下所述进行qPCR程序
95℃，10分钟；
95℃，15秒；60℃，1分钟(该操作40个循环)。
8.结果分析
使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(PNPLA3基因)-Ct(GAPDH)；
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)-ΔCt(Mock组)；
相对mRNA表达比(相对于Mock组)＝2-ΔΔCt。
Mock组表示：和检测样品组相比，Mock组未加入siRNA的组。
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量-检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％。
三、沉默实验结果
选取浓度1nM和0.01nM进行测试，结果可见于表7、表10-1至表10-6。
从表7结果可见，本公开中未经修饰的siRNA双链体在高浓度(1nM)测试条件时，对靶点实现了至少40％的抑制，甚至在低浓度(0.01nM)测试条件时仍可以实现至少20％的抑制。其中，N-ER-FY006039、N-ER-FY006051、N-ER-FY006052、N-ER-FY006053、N-ER-FY006096在高浓度(1nM)测试条件时对靶点实现了至少80％的抑制，在低浓度(0.01nM)测试条件时可以实现50％的抑制(表7)。
从靶点的分布来看，在靶基因PNPLA3的全长范围内本公开的siRNA双链体都实现了有效抑制。
将本公开的siRNA双链体分别采用前述不同策略(M1至M7)进行修饰，在高浓度(1nM)测试条件时，对靶点的抑制保持在至少40％，在低浓度(0.01nM)测试条件时对靶点的抑制保持在至少20％。其中，N-ER-FY006039、N-ER-FY006051、N-ER-FY006052、N-ER-FY006053、N-ER-FY006096经修饰所得的siRNA，抑制能力最优(表10-1至表10-6)。
四、IC50测试
浓度范围设置(nM；3倍稀释，8个测试点)：5、1.67、0.56、0.185、0.062、0.021、0.0068和0.0023nM。
再按照与步骤二相似的方法进行IC50测定(结果见表5)。
使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(PNPLA3基因)-Ct(GAPDH)；
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)-ΔCt(Mock组)；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA的组。
抑制率＝(Mock组mRNA表达量-检测样品组mRNA表达量)/Mock组mRNA表达量×100％。
以siRNA浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPadPrism 8的log(抑制剂)vs.响应-变量斜率，以拟合量效曲线，从而得出各个siRNA的IC50值。
拟合公式为：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)*HillSlope))
其中：Top表示顶部平台，曲线的Top标准一般在80％至120％；Bottom表示底部平台，曲线的Bottom一般在-20％至20％之间。
表5.IC50测试结果
siRNA代号 IC50(nM)
N-ER-FY006009M1 0.009
N-ER-FY006019M1 0.010
N-ER-FY006025M1 0.009
N-ER-FY006031M1 0.017
N-ER-FY006035M1 0.007
N-ER-FY006039M1 0.009
N-ER-FY006042M1 0.013
N-ER-FY006053M1 0.009
N-ER-FY006055M1 0.010
N-ER-FY006059M1 0.022
N-ER-FY006061M1 0.007
N-ER-FY006063M1 0.034
ICs0是指半抑制率，表示抑制率达到50％时活性物质的浓度。因此，ICs0值越低，活性物质的抑制能力越强。
采用本公开修饰策略(以M1为例)得到的siRNA，获得了不高于0.04nM的IC50，优选不高于0.03nM、不高于0.025nM、不高于0.024nM、不高于0.023nM、不高于0.022nM、不高于0.021nM、不高于0.020nM、不高于0.019nM、不高于0.018nM、不高于0.017nM、不高于0.016nM、不高于0.015nM、不高于0.014nM、不高于0.013nM、不高于0.012nM、不高于0.011nM、不高于0.010nM；最优选不高于0.009nM、不高于0.008nM、不高于0.007nM的IC50。
实施例5.siRNA缀合物的体内外活性测试
1.实验材料：
人原代肝细胞，由第三方机构市售提供；
肝细胞培养基：invitroGRO CP Meduim serum free BIOVIT，货号：S03316；
RNAiMAX转染试剂，购自Invitrogen，货号：13778-150；
RNA提取试剂盒96Kit，购自QIAGEN，货号：QIAGEN-74182；
逆转录试剂盒FastKing RT Kit(含有gDNase)，购自TianGen，货号：KR116-02；
FastStart Universal Probe master，购自Roche，货号：04914058001；
TaqMan探针引物(GAPDH)购自Thermo，货号Hs02786624_g1；
TaqMan探针引物(PNPLA3)购自Thermo，货号Hs00228747_m1。
2.实验方法：
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度为10nM、2.5nM、0.63nM、0.16nM、0.04nM、0.01nM、0.0024nM和0.0006nM)通过转染进入原代肝细胞。过程如下所述：取冻存的原代肝细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时应用RNAiMax转染试剂将siRNA缀合物转入细胞，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μl。细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度为500nM、125nM、31.25nM、7.81nM、1.95nM、0.49nM、0.12nM和0.03nM)通过自由摄取进入原代肝细胞细胞。过程如下所述：取冻存的原代肝细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时加入siRNA缀合物，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。细胞置于5％Co2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
采用与实施例4中相似的方法，通过逆转录反应将提取的总RNA逆转录为cDNA，以及通过qPCR对逆转录得到的PNPLA3 cDNA进行定量扩增。GAPDH cDNA将作为内部对照进行平行扩增。PCR反应程序为：95℃，10分钟，然后进入循环模式，95℃，15秒，随后60℃，60秒，共40个循环。
3.结果分析：
使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(PNPLA3基因)-Ct(GAPDH)；
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)-ΔCt(Mock组)；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA缀合物的组。
抑制率＝(Mock组mRNA表达量-检测样品组mRNA表达量)/Mock组mRNA表达量×100％。
以siRNA缀合物浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 8的log(抑制剂)vs.响应-变量斜率，来拟合量效曲线，从而得出各个siRNA缀合物的ICs0值。
拟合公式为：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)*HillSlope))
其中：Top表示顶部平台，曲线的Top标准一般在80％至120％；Bottom表示底部平台，曲线的Bottom一般在-20％至20％之间。
表6-1.siRNA缀合物抑制PNPLA3基因表达的IC50值
本实施例通过细胞摄取实验评价了活性物质被细胞吸收的能力。细胞摄取可以分为被动摄取和主动摄取。
IC50是指半抑制率，表示抑制率达到50％时活性物质的浓度。因此，IC50值越低，活性物质的抑制能力越强。本实施例通过IC50对siRNA缀合物靶向并吸收至靶细胞(即肝细胞)中的能力进行定量。
结果可知，采用本公开修饰策略(以M1为例)得到的siRNA，将其缀合至靶向配体(以L96为例)后，缀合物可以结合肝细胞或肝细胞的表面受体，并且启动内吞作用以促进siRNA进入肝细胞，发挥抑制活性(表6-1)。
实施例6.siRNA缀合物的体内外活性测试
1.实验材料：
人原代肝细胞，由第三方机构市售提供；
肝细胞培养基：invitroGRO CP Meduim serum free BIOVIT，货号：S03316；
RNAiMAX转染试剂，购自Invitrogen，货号：13778-150；
RNA提取试剂盒96Kit，购自QIAGEN，货号：QIAGEN-74182；
逆转录试剂盒FastKing RT Kit(含有gDNase)，购自TianGen，货号：KR116-02；
FastStart Universal Probe master，购自Roche，货号：04914058001；
TaqMan探针引物(GAPDH)购自Thermo，货号Hs02786624_g1；
TaqMan探针引物(PNPLA3)购自Thermo，货号Hs00228747_m1。
2.实验方法：
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度为5nM和0.1nM)通过转染进入原代肝细胞。过程如下所述：取冻存的原代肝细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时应用RNAiMax转染试剂将siRNA缀合物转入细胞，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度为200nM和10nM)通过自由摄取进入原代肝细胞细胞。过程如下所述：取冻存的原代肝细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时加入siRNA缀合物，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
采用与实施例4中相似的方法，通过逆转录反应将提取的总RNA逆转录为cDNA，以及通过qPCR对逆转录得到的PNPLA3 cDNA进行定量扩增。GAPDH cDNA将作为内部对照进行平行扩增。PCR反应程序为：95℃，10分钟，然后进入循环模式，95℃，15秒，随后60℃，60秒，共40个循环。
3.结果分析：
使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(PNPLA3基因)-Ct(GAPDH)；
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)-ΔCt(Mock组)；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA缀合物的组。
抑制率＝(Mock组mRNA表达量-检测样品组mRNA表达量)/Mock组mRNA表达量×100％。
表6-2.siRNA缀合物抑制PNPLA3基因表达的抑制率
注：L96是指实施例3中的所示结构。
本实施例通过细胞摄取实验评价了活性物质被细胞吸收的能力。细胞摄取可以分为被动摄取和主动摄取。通过抑制率％对siRNA缀合物靶向并吸收至靶细胞(即肝细胞)中的能力进行定量。
采用本公开修饰策略(以M2、M3、M6、M7为例)得到的siRNA，将其缀合至靶向配体(以L96为例)后，缀合物可以结合肝细胞或肝细胞的表面受体，并且启动内吞作用以促进siRNA进入肝细胞，发挥抑制活性。表6-2可知，在PHH自由摄取实验中，高浓度条件下(200nM)，缀合物的抑制率不低于60％；低浓度条件下(10nM)，缀合物的抑制率不低于30％；在PHH转染实验中，高浓度条件下(5nM)，缀合物的抑制率不低于65％；低浓度条件下(0.1nM)，缀合物的抑制率不低于30％。
实施例7.制剂的制备示例
将实施例3制备的siRNA缀合物进行无菌处理，包装至预填充式注射器(皮下注射型)，规格为1支×1.0mL、1支×1.5mL、1支×2.0mL。溶液是透明、无色到淡黄色，没有肉眼可见的微粒。辅料为注射用水或生理盐水。
皮下注射使用时，将注射器用于腹部、上臂或大腿。每个单位剂量使用一支预充式注射器。
实施例8.siRNA缀合物在表达人PNPLA3(hPNPLA3)基因的小鼠体内沉默效果
(1)AAV构建过表达hPNPLA3基因小鼠模型
6-8周龄的C57BL/6小鼠(由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供)进入设施，适应性喂养3-5天后，尾静脉单次注射hPNPLA3基因的腺相关病毒AAV(pAAV[Exp]-CBh-hPNPLA3 CDS-T2A-SEAP-tWPA}：WPRE，病毒由云舟生物提供)进行靶基因过表达造模，给药体积：100μL(3*1011vg)/只，随后普通饲料喂养。
(2)针对hPNPLA3小鼠模型体内沉默siRNA缀合物的药效考察
AAV病毒注射14日后，分组(每组6只)，小鼠皮下给药，单一3mg/kg剂量的N-ER-FY006051M2-L96、N-ER-FY006052M2-L96、N-ER-FY006053M2-L96、N-ER-FY006039M2-L96、N-ER-FY006096M2-L96。给药后第7天、14天、21天、28天、35天、42天和49天进行检测SEAP蛋白表达量(即hPNPLA3蛋白表达量)。
表6-3.siRNA缀合物对hPNPLA3的抑制率
本实施例测试了siRNA缀合物在动物体内随时间变化的抑制能力。从表6-3可以看出，本申请的siRNA缀合物(以M2修饰策略为例)在体内对hPNPLA3基因具有较高的抑制活性，能够长时间降低hPNPLA3蛋白水平，剂量效应明显。siRNA缀合物通常在14-28天附近达到抑制率的峰值，在长达49天期间，没有观察到抑制率的显著下降。这表明，本申请的siRNA缀合物能够在体内有效靶向肝细胞，并抑制活性的作用时间长。
实施例9.siRNA缀合物在CD-1小鼠中的血浆动力学研究
试验动物：CD-1小鼠，SPF级，雄性，30g左右，购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。
给药剂量和方式：siRNA缀合物在3mg/kg(10mL/kg)的剂量下给药，随机分组后单次皮下注射给药，每组6只小鼠。
样品采集：采集给药后0.0833、0.25、0.5、1、2、4、8、24、36、48h全血样品，共10个点。每组前3只采集0.0833、0.5、2、8、36h，后3只采集0.25、1、4、24、48h，采集全血后离心分离血浆进行检测分析。
样品检测与分析：采用LC-MS/MS方法检测各时间点血浆样品中原形药物的浓度，使用WinNonlin软件计算PK参数：Cmax、Tmax、AUC、MRT、t1/2。
从该实验中可以得出，本公开的siRNA缀合物No.154-209和双链No.362-395在血浆中半衰期较短，清除较快。
实施例10.siRNA缀合物在CD-1小鼠中的组织分布试验
试验动物：CD-1小鼠，SPF级，雄性，30g左右，购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。
给药剂量和方式：siRNA缀合物在3mg/kg(10mL/kg)的剂量下给药，随机分组后单次皮下注射给药，每个时间点3只动物，共24只小鼠。
样品采集：
给药后24h：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后72h：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后168h(1周)：采集血浆、肝、肾、脾、脑、心、肺、胃、小肠、肌肉、睾丸；
给药后336h(2周)：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后672h(4周)：采集血浆、肝、肾、脾、脑、心、肺、胃、小肠、肌肉、睾丸；
给药后1008h(6周)：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后1344h(8周)：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后1680h(10周)：采集血浆、肝、肾、脾、脑、心、肺、胃、小肠、肌肉、睾丸。
样品检测与分析：采用LC-MS/MS方法检测各时间点血浆和组织样品中原形药物的浓度，采用梯形面积法计算血浆及组织中的AUC。
从该实验中可以得出，本公开的siRNA缀合物No.154-209和双链No.362-395主要富集于肝脏，在组织中保留时间较长，具有很好的稳定性。
实施例11.siRNA缀合物单次皮下注射C57小鼠给予MTD试验
试验动物：C57小鼠，SPF级，雄性，25g左右，购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。动物根据适应期最后1天的体重，采用体重随机区组的方法，具体剂量设计和分组如下表所示：
表6-4.剂量设计和分组
检测指标：
临床观察：给药日连续观察4小时，恢复期每天至少进行一次临床观察。
体重：对所有存活动物每周进行2次体重称量。
免疫毒性：MTD剂量组动物于D1给药后1h±2min，4h±5min，8h±10min，24h±20min交替采血，每个时间点采集3只/性别/组动物，检测细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2/6/8)。
毒代动力学：MTD剂量组动物于D1给药前、给药后30min±2min，1h±2min，4h±5min，8h±10min，24h±20min交替采血，每个时间点采集3只/性别/组动物，检测血药浓度。
血液生化学：主试验组动物于D28剖检，卫星组动物于D7、D14、D21、D28分批次剖检，检测血液生化学。
组织分布：主试验组动物于D28剖检，卫星组动物于D7、D14、D21、D28分批次剖检，采集血、肝，检测组织药物浓度。
组织病理学检查：主试验组动物于D28剖检，采集主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、胸腺、胃、子宫/睾丸、卵巢/附睾)以及发现异常的组织或脏器，取材并固定，进行组织病理学检查。
从该实验中可以得出，本公开的siRNA缀合物No.154-209和双链No.362-395毒性较低，具有优异的用药安全窗口。
靶基因mRNA序列(SEQ ID NO：1)：

Claims (27)

1.一种双链核糖核酸，其包含正义链与反义链；
所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述正义链为17至25个核苷酸长，优选19、20、21、22、23个核苷酸长；
所述反义链为17至25个核苷酸长，优选19、20、21、22、23个核苷酸长；
所述双链区的长度是17至25个核苷酸长，优选19、20、21、22、23个核苷酸长；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向PNPLA3基因或其表达产物；
所述双链核糖核酸靶向PNPLA3基因的CDS区，PNPLA3基因是SEQ ID NO：1所示序列；优选地，所述双链核糖核酸靶向所述CDS区中至少连续15个核苷酸长的任意靶点，
更优选地，所述靶点选自以下任一个或其组合：SEQ ID NO：1的第339-361位所示的多核苷酸、340-358位所示的多核苷酸、341-363位所示的多核苷酸、342-364位所示的多核苷酸、343-361位所示的多核苷酸、343-363位所示的多核苷酸、344-362位所示的多核苷酸、364-382位所示的多核苷酸、386-408位所示的多核苷酸、387-409位所示的多核苷酸、388-410位所示的多核苷酸、389-407位所示的多核苷酸、389-409位所示的多核苷酸、390-408位所示的多核苷酸、390-410位所示的多核苷酸、441-459位所示的多核苷酸、442-460位所示的多核苷酸、494-512位所示的多核苷酸、517-539位所示的多核苷酸、519-537位所示的多核苷酸、519-541位所示的多核苷酸、520-542位所示的多核苷酸、521-539位所示的多核苷酸、522-540位所示的多核苷酸、522-542位所示的多核苷酸、525-545位所示的多核苷酸、525-543位所示的多核苷酸、553-571位所示的多核苷酸、587-605位所示的多核苷酸、636-654位所示的多核苷酸、710-728位所示的多核苷酸、764-786位所示的多核苷酸、765-787位所示的多核苷酸、766-784位所示的多核苷酸、766-786位所示的多核苷酸、767-785位所示的多核苷酸、767-789位所示的多核苷酸、768-788位所示的多核苷酸、769-789位所示的多核苷酸、818-838位所示的多核苷酸、820-838位所示的多核苷酸、820-840位所示的多核苷酸、821-839位所示的多核苷酸、824-846位所示的多核苷酸、825-843位所示的多核苷酸、825-845位所示的多核苷酸、826-846位所示的多核苷酸、828-846位所示的多核苷酸、828-848位所示的多核苷酸、1082-1100位所示的多核苷酸、1120-1138位所示的多核苷酸、1123-1141位所示的多核苷酸、1143-1161位所示的多核苷酸、1144-1164位所示的多核苷酸、1146-1164位所示的多核苷酸、1147-1165位所示的多核苷酸、1148-1166位所示的多核苷酸、1151-1169位所示的多核苷酸、1194-1212位所示的多核苷酸、1204-1222位所示的多核苷酸、1220-1238位所示的多核苷酸、1467-1489位所示的多核苷酸、1468-1490位所示的多核苷酸、1469-1491位所示的多核苷酸、1471-1489位所示的多核苷酸、1471-1491位所示的多核苷酸、1472-1490位所示的多核苷酸、1472-1492位所示的多核苷酸、1475-1495位所示的多核苷酸；
126-144位所示的多核苷酸、154-172位所示的多核苷酸、214-236位所示的多核苷酸、215-237位所示的多核苷酸、216-238位所示的多核苷酸、218-240位所示的多核苷酸、220-242位所示的多核苷酸、228-246位所示的多核苷酸、260-282位所示的多核苷酸、267-285位所示的多核苷酸、293-311位所示的多核苷酸、294-316位所示的多核苷酸、295-317位所示的多核苷酸、297-317位所示的多核苷酸、299-319位所示的多核苷酸、299-317位所示的多核苷酸、414-436位所示的多核苷酸、416-438位所示的多核苷酸、418-440位所示的多核苷酸、468-490位所示的多核苷酸、584-602位所示的多核苷酸、586-606位所示的多核苷酸、590-610位所示的多核苷酸、663-683位所示的多核苷酸、664-684位所示的多核苷酸、665-683位所示的多核苷酸、665-687位所示的多核苷酸、668-690位所示的多核苷酸、670-692位所示的多核苷酸、672-692位所示的多核苷酸、673-695位所示的多核苷酸、674-696位所示的多核苷酸、675-693位所示的多核苷酸、675-697位所示的多核苷酸、676-696位所示的多核苷酸、677-699位所示的多核苷酸、722-740位所示的多核苷酸、751-769位所示的多核苷酸、752-770位所示的多核苷酸、754-772位所示的多核苷酸、755-773位所示的多核苷酸、757-775位所示的多核苷酸、758-776位所示的多核苷酸、758-778位所示的多核苷酸、759-779位所示的多核苷酸、806-824位所示的多核苷酸、845-863位所示的多核苷酸、850-872位所示的多核苷酸、851-873位所示的多核苷酸、854-876位所示的多核苷酸、855-875位所示的多核苷酸、997-1015位所示的多核苷酸、1011-1029位所示的多核苷酸、1011-1031位所示的多核苷酸、1016-1038位所示的多核苷酸、1212-1230位所示的多核苷酸、1262-1280位所示的多核苷酸、1264-1282位所示的多核苷酸、1264-1284位所示的多核苷酸、1264-1286位所示的多核苷酸、1266-1288位所示的多核苷酸、1265-1283位所示的多核苷酸、1265-1285位所示的多核苷酸、1446-1464位所示的多核苷酸、1446-1466位所示的多核苷酸、1447-1465位所示的多核苷酸、1510-1532位所示的多核苷酸、1603-1621位所示的多核苷酸、1604-1626位所示的多核苷酸、1605-1623位所示的多核苷酸、1616-1634位所示的多核苷酸、1647-1667位所示的多核苷酸、1660-1678位所示的多核苷酸、1768-1786位所示的多核苷酸、1768-1788位所示的多核苷酸、1770-1790位所示的多核苷酸、1771-1789位所示的多核苷酸、1801-1819位所示的多核苷酸、1803-1821位所示的多核苷酸、1805-1827位所示的多核苷酸、1806-1826位所示的多核苷酸、1833-1851位所示的多核苷酸、1834-1854位所示的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的双链核糖核酸，其中：
所述双链核糖核酸靶向SEQ ID NO：1所示序列中以下靶点中的任一个或其组合：
521-539、675-697、824-846、825-845、826-846；或其等同位置。
3.根据权利要求1或2所述的双链核糖核酸，其中：
所述反义链与所述靶点之间存在不多于3个、不多于2个、或不多于1个错配。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双链核糖核酸，其中：
所述正义链与所述靶点之间差异不多于3个、不多于2个、或不多于1个核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的双链核糖核酸，其中：所述正义链与所述反义链选自以下任一组合：
所述正义链包含与SEQ ID NO：64所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：65所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：88所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：89所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：90所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：91所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：92所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：93所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸；
所述正义链包含与SEQ ID NO：379所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸，且所述反义链包含与SEQ ID NO：380所示序列差异不超过3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的双链核糖核酸，所述双链核糖核酸的正义链和反义链选自表7中任一对所示的多核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的双链核糖核酸，所述正义链和/或反义链中包含至少一个修饰的核苷酸。
8.根据权利要求7所述的双链核糖核酸，所述修饰的核苷酸选自以下任一项或其组合：2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-取代的氨基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-脱氧-2'-氟代修饰的核苷酸、3'-脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA、GNA；
优选地，所述修饰的核苷酸选自以下任一项或其组合：2’-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA。
9.根据权利要求8所述的双链核糖核酸，在所述正义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第7位至第11位中的至少一个位点；优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10、11位中的至少一个位点；
2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点。
10.根据权利要求9所述的双链核糖核酸，在所述反义链中：
2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起偶数位中的至少一个位点；更优选地，2’-氟代修饰的核苷酸位于全部偶数位；2’-甲氧基修饰的核苷酸位于5’端起奇数位中的至少一个位点；更优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于全部奇数位；
或者，2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、14、16位中的一个或多个位点；2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
或者，2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、8、9、14、16位中的一个或多个位点；2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸以外的全部其余位点；
或者，2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、6、14、16位中的一个或多个位点；GNA修饰位于5’端起第7位；2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的全部其余位点；
或者，2’-氟代修饰的核苷酸位于5’端起第2、14、16位中的一个或多个位点；GNA修饰位于5’端起第6位；2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的至少一个其余位点；优选地，2’-甲氧基修饰的核苷酸位于2’-氟代修饰的核苷酸和GNA修饰以外的全部其余位点。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的双链核糖核酸，其中：
当所述正义链和反义链长为19个核苷酸时，在所述正义链和反义链的3’端添加两个连续核苷酸；优选地，添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；
或者，当所述正义链长21或23个核苷酸时，在所述正义链的基础上使其缺失3’端的两个连续核苷酸；
或者，当所述正义链长19个核苷酸时，所述正义链的3’端未添加两个连续核苷酸，只在所述反义链的3’端添加两个连续胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
12.根据权利要求7至10中任一项所述的双链核糖核酸，所述正义链和/或反义链中至少一个磷酸酯键为硫代磷酸酯键，其中：
在所述正义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间；
和/或
在所述反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间。
13.根据权利要求12所述的双链核糖核酸，所述正义链和/或反义链中至少一个磷酸酯键为硫代磷酸酯键，其中：
在所述正义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
和/或
在所述反义链中，所述硫代磷酸酯键位于选自以下的任一位置或其组合：
5’端起第1位和第2位核苷酸之间；
5’端起第2位和第3位核苷酸之间；
3’端起第1位和第2位核苷酸之间；
3’端起第2位和第3位核苷酸之间。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的双链核糖核酸，其中：
任选地，所述反义链的5’端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
15.一种双链核糖核酸，其包含正义链与反义链；
所述正义链与反义链选自以下的任一项：
(a)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(19)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(19)-as所示结构：
(b)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(21)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(21)-as所示结构：
(c)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(23)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(23)-as所示结构：
(d)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式MD2(19)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(19)-as所示结构；
(e)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式MD2(21minus2)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(21)-as所示结构；
(f)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式MD2(23minus2)-ss所示结构：
所述反义链具有通式M1(23)-as所示结构；
(g)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M2-as所示结构：
其中：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M2-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M2-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M2-as所示；
(h)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M6-as所示结构：
其中：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M6-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M6-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M6-as所示；
(i)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M3-as所示结构：
其中：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M3-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M3-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M3-as所示；
(j)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M7-as所示结构：
其中：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M7-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M7-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M7-as所示；
(k)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M4-as所示结构：
其中：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M4-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M4-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M4-as所示；
(l)所述正义链和所述反义链形成双链区，优选所述正义链和所述反义链至少部分地反向互补；
所述双链核糖核酸选自以下的任一项：siRNA、shRNA；
所述双链核糖核酸靶向权利要求1所限定的PNPLA3基因或其表达产物；
所述正义链具有通式M1(19)-ss、M1(21)-ss、M1(23)-ss、MD2(19)-ss、MD2(21minus2)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构；
所述反义链具有通式M5-as所示结构：
其中：
当正义链是M1(21)-ss或MD2(21minus2)-ss所示结构时，通式M5-as中n22至n23缺失，s位于n19和n20、n20和n21之间；
当正义链是M1(19)-ss或MD2(19)-ss所示结构时，通式M5-as中n22至n23缺失，n20和n21分别为t取代，s位于t和t、n19和t之间；
当正义链是M1(23)-ss或MD2(23minus2)-ss所示结构时，反义链是通式M5-as所示；
n表示a、c、u、g中的任一个核苷酸；n随后的数字1-23表示从5’端起的位点；
f表示在该位点是2’-氟代修饰的核苷酸；
m表示在该位点是2’-甲氧基修饰的核苷酸；
GNA表示在该位点是GNA修饰的核苷酸；
s表示与其紧邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接；
p1表示5’端的核苷酸为5’-磷酸核苷酸；
p0表示5’端的核苷酸为缺失5’-磷酸基团的核苷酸。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的双链核糖核酸，所述双链核糖核酸的正义链和反义链选自表8-1、表8-2、表8-3、表8-4、表8-5、表8-6、表8-7、表8-8中任一对所示的多核苷酸。
17.一种双链核糖核酸缀合物，其包含：
1)权利要求1-16中任一项所述的双链核糖核酸、和
2)缀合至所述双链核糖核酸的靶向配体；
所述靶向配体靶向哺乳动物的肝细胞；
优选地，所述双链核糖核酸缺失其正义链3'端的第一和第二位核苷酸后缀合至所述靶向配体。
18.根据权利要求17所述的双链核糖核酸缀合物，其中：
所述靶向配体包含：
-至少一个靶向基团、
-第一接头、
-分支基团、和
-第二接头；
所述第一接头连接所述靶向基团和所述分支基团；
所述第二接头连接所述分支基团和所述双链核糖核酸；
所述第一接头为1至20个选自以下的任一项或其组合：
优选所述第一接头是式(III)所示；
所述第二接头选自以下的任一项：
其中：
R1和R2各自独立的选自：-S-、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、CH2O-、-NH-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-NH-、-NH(CO)NH-、3-12元杂环基；
R3选自：氘、卤素、烷基、氨基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羟基、巯基、烷巯基、烷氧基、烷氨基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基；
k选自0至4的整数；
j选自0至20的整数；
优选地，第二接头是式(IV)所示；
所述分支基团是式(I)所示：
19.根据权利要求18所述的双链核糖核酸缀合物，其中：
所述靶向基团独立地选自以下的任一项：N-乙酰基-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺、N-异丁酰基-半乳糖胺；
优选地，所述靶向基团是N-乙酰基-半乳糖胺；
更优选地，所述靶向配体包含三个N-乙酰基-半乳糖胺。
20.根据权利要求18所述的双链核糖核酸缀合物，其中所述靶向配体是式(II)所示：
21.根据权利要求17至20中任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其选自表9中任一对所示的双链核糖核酸缀合物。
22.一种药物组合物，其包含：
-药学上可接受的载剂；和
-权利要求1至16中任一项所述的双链核糖核酸、或权利要求17至21中任一项所述的双链核糖核酸缀合物；
优选地，所述药学上可接受的载剂选自以下任一项或其组合：盐水溶液、糖溶液、聚合物、肽、脂质、凝胶、胶束、二氧化硅纳米颗粒、金属纳米颗粒、质粒、病毒载体。
23.一种抑制PNPLA3基因或其表达产物的方法，包括：
向靶细胞施用有效量的权利要求1至16中任一项所述的双链核糖核酸、或权利要求17至21中任一项所述的双链核糖核酸缀合物；
优选地，所述施用是体外或离体施用。
24.一种治疗或预防与PNPLA3基因表达相关的疾病的方法，包括步骤：
向受试者施用治疗有效量或预防有效量的权利要求1至16中任一项所述的双链核糖核酸、或权利要求17至21中任一项所述的双链核糖核酸缀合物、或权利要求22所述的药物组合物；
优选地，所述疾病选自以下任一项或其组合：非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、肝性脂肪变性、肝硬化、肝癌、肝纤维化、肝炎、肝损伤、肝细胞坏死；
所述NAFLD选自以下任一项或其组合：非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；
所述肝炎选自以下任一项或其组合：慢性肝炎、HCV肝炎。
25.权利要求1至16中任一项所述的双链核糖核酸或权利要求17至21中任一项所述的双链核糖核酸缀合物在制备药物中的用途，其中：
所述药物用于治疗或预防选自以下任一项或其组合：NAFLD、酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、肝性脂肪变性、肝硬化、肝癌、肝纤维化、肝炎、肝损伤、肝细胞坏死；
所述NAFLD选自以下任一项或其组合：非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；
所述肝炎选自以下任一项或其组合：慢性肝炎、HCV肝炎。
26.权利要求1至16中任一项所述的双链核糖核酸、或权利要求17至21中任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其用于治疗或预防选自以下任一项或其组合：NAFLD、酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、肝性脂肪变性、肝硬化、肝癌、肝纤维化、肝炎、肝损伤、肝细胞坏死；
所述NAFLD选自以下任一项或其组合：非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；
所述肝炎选自以下任一项或其组合：慢性肝炎、HCV肝炎。
27.一种递送双链核糖核酸至肝脏或肝细胞的方法，包括步骤：
向受试者施用有效量的权利要求1至16中任一项所述的双链核糖核酸、或权利要求17至21中任一项所述的双链核糖核酸缀合物、或权利要求22所述的药物组合物。
CN202311684992.XA 2022-12-12 2023-12-08 用于抑制pnpla3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途 Pending CN117904108A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211597287 2022-12-12
CN2022115972871 2022-12-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117904108A true CN117904108A (zh) 2024-04-19

Family

ID=90690146

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311684992.XA Pending CN117904108A (zh) 2022-12-12 2023-12-08 用于抑制pnpla3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN117904108A (zh)
WO (1) WO2024125404A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR113490A1 (es) * 2017-12-12 2020-05-06 Amgen Inc CONSTRUCCIONES DE ARNi PARA INHIBIR LA EXPRESIÓN DE PNPLA3 Y MÉTODOS DE USO DE LAS MISMAS
WO2020135581A1 (zh) * 2018-12-28 2020-07-02 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
JP2022552249A (ja) * 2019-10-14 2022-12-15 アストラゼネカ・アクチエボラーグ Ｐｎｐｌａ３発現のモジュレーター
EP4347823A1 (en) * 2021-06-02 2024-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
CN116987696A (zh) * 2022-08-04 2023-11-03 北京福元医药股份有限公司 用于抑制angptl3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024125404A1 (zh) 2024-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI680767B (zh) 用於增強的細胞攝取之化合物及方法
RU2566724C2 (ru) Композиции и способы модуляции smn2 сплайсинга у субъекта
TW202024324A (zh) 用於抑制17β-HSD第13型(HSD17B13)表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法
JP2022515503A (ja) 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
AU2022203361A1 (en) Compositions and methods for modulating RNA
CN118217305A (zh) 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
TW202202153A (zh) 用於抑制ＰＮＰＬＡ３表現之ＲＮＡｉ劑、其醫藥組成物及使用方法
WO2024027518A1 (zh) 用于抑制angptl3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
CN113614230B (zh) 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CN118272372A (zh) 用于抑制凝血因子xi基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
WO2024008114A1 (zh) 用于抑制补体因子B表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及其用途
CN117904108A (zh) 用于抑制pnpla3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
JP2000514095A (ja) 生物学的利用能を向上するためのオリゴヌクレオチド
JP2024520522A (ja) ムチン５ＡＣ（ＭＵＣ５ＡＣ）の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤、その組成物、及び使用方法
WO2023208109A1 (zh) 用于抑制HSD17B13表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及其用途
CN118813613A (zh) 抑制黄嘌呤脱氢酶基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
CN118421622A (zh) 抑制血管生成素样蛋白8基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
CN118853663A (zh) 用于抑制marc1基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
WO2023116764A1 (zh) 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及其用途
WO2024104416A1 (zh) 抑制SCAP基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
CN117645995A (zh) 抑制去唾液酸糖蛋白受体基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
CN118308353A (zh) 用于抑制fxii基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
CN117384902A (zh) 用于抑制cyp27a1基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
WO2023245061A2 (en) Lipid conjugates for the delivery of therapeutic agents to cns tissue
CN116497027A (zh) 核酸、药物组合物与缀合物及用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination