CN117887833A - 一种综合征致病基因nsf突变位点的应用及突变型nsf转基因果蝇模型的构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因诊断技术领域，公开了一种综合征致病基因NSF突变位点的应用及突变型NSF转基因果蝇模型的构建和应用。本发明通过全外显子测序技术，发现LGS患者的NSF基因c.1205位置发生C碱基被G碱基替换的突变。本发明提供的具有新的突变位点的NSF基因作为LGS的生物标志物可以用于评估人体发育之初样本是否发展为癫痫性脑病；或可作为孕前预警，判断NSF基因该突变型携带者的后代是否具有患有癫痫的风险，以指导患者治疗和帮助优生优育；通过构建果蝇发育性癫痫性脑病模型，为探究NSF突变或表达改变相关的癫痫的具体治疗方案、筛选癫痫相关药物提供一个可靠的动物模型，为NSF突变相关的癫痫发生机理研究提供实验材料。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及NSF基因c.1205C>G突变及其在Lennox-Gastaut综合征辅助诊断中的应用，和一种利用CRISPR-Cas9技术构建NSF点突变敲入的果蝇模型的方法及应用。
背景技术
Lennox-Gastaut综合征(Lennox-Gastaut syndrome，LGS)是一种儿童期发病的严重发育性癫痫性脑病，LGS发病率为0.1～0.28/100000，严重影响患者及其家人的生活质量。LGS的主要特征为多种癫痫发作类型、脑电图(Electroencep-halogram，EEG)广泛性慢的棘-慢复合波(1.5～2.5Hz)和智力障碍/发育迟缓(Intellectual disability/developmental delay，ID/DD)。超过90％的LGS患儿为药物难治性癫痫，预后差，很难达到癫痫无发作。随着二代测序等基因组技术的普及和发展，目前可以通过癫痫家系的三人组全外显子测序有效地鉴定癫痫相关致病基因及其突变位点。突变位点的存在不仅是导致个体表型差异的重要原因，也是引发不同药物反应的关键因素之一。将疾病相关的突变位点应用于临床辅助诊断具有广泛的应用前景。近年来，已经出现了多种疾病相关突变位点，这些位点不仅用于临床诊断，还作为靶向治疗的分子基础，为精准医学的发展提供了坚实的基础。
SNARE复合物(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachmentprotein receptor)是一种在膜融合过程中发挥关键作用的蛋白质复合物，特别是在神经递质释放、内分泌和细胞吞噬等过程，其中涉及到SNARE复合物的识别、组装和解离。NSF基因(N-ethylmaleimide-sensitive factor)编码N-乙基马来酰亚胺敏感因子，是一种介导细胞内囊泡运输和膜融合的ATP酶。NSF蛋白通过水解三磷酸腺苷(ATP)释放能量，将SNARE复合物从膜上解离，分离后的SNARE被回收并用于下一次的膜融合。目前已经发现的与发育性癫痫性脑病相关的NSF突变仅两例新生错义突变，NSF基因c.1205C>G突变并未被报道。
研究癫痫疾病的挑战在于需要有效的动物模型来模拟疾病的特征，以便深入研究其发病机制和寻找潜在的治疗方法。果蝇(Drosophila melanogaster)作为一种模型生物具有许多研究优势，包括短繁殖周期、相对低成本、基因组信息已知以及易于基因敲除和过表达。
因此，开发一种果蝇模型来研究发育性癫痫性脑病与NSF基因之间的关系，以及寻找潜在的药物治疗方法，将有助于推动发育性癫痫性脑病，尤其是LGS研究领域的进展。
发明内容
为解决现有技术中LGS诊疗领域存在的技术问题，本发明提供了一种综合征致病基因NSF突变位点的应用及突变型NSF转基因果蝇模型的构建和应用，基于综合征致病基因NSF突变位点构建突变型NSF转基因果蝇模型以及通过构建的果蝇模型来研究发育性癫痫性脑病与NSF基因之间的关系，为寻找发育性癫痫性脑病潜在的药物治疗方法提供新的技术支持。
本发明的第一个目的在于提供一种具有新的突变位点的NSF突变基因作为发育性癫痫性脑病LGS的生物标志物，所述NSF正常基因的Gene ID：4905，所述NSF基因序列突变位点为c.1205C>G。
进一步，所述NSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，NSF蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的在于提供一种用于检测发育性癫痫性脑病LGS的致病基因NSF突变位点的试剂，所述试剂是扩增致病基因NSF突变位点c.1205C>G的引物对。
进一步，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的NSF-Seq F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的NSF-Seq R。
本发明的第三个目的在于提供一种发育性癫痫性脑病LGS辅助诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括所述的试剂。
本发明第四个目的在于提供一种NSF突变基因敲入果蝇发育性癫痫性脑病LGS模型的构建方法，所述构建方法为：利用CRISPR-Cas9技术在果蝇体内实现人类NSF基因同源基因c.1205C>G点突变敲入，得到所述的果蝇发育性癫痫性脑病LGS模型。
进一步，所述CRISPR-Cas9基因编辑技术中gRNA设计的靶向序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明第五个目的在于提供所述的果蝇基因敲入模型在发育性癫痫性脑病发生机理研究中的应用。
进一步，将所述果蝇基因敲入癫痫模型经过震荡刺激(Bang-sensitiveparalytics)确定NSF基因点突变c.1205C>G，能够诱导果蝇癫痫易感性增加，再利用背地趋向实验(negative geotaxis assay)测试该果蝇的运动能力变化，用于发育性癫痫性脑病的发生机理研究。
以下为本发明方案涉及的序列：
SEQ ID NO.1：
ATGGCGGGCCGGAGCATGCAAGCGGCAAGATGTCCTACAGATGAATTATCTTTAACCAATTGTGCAGTTGTGAATGAAAAGGATTTCCAGTCTGGCCAGCATGTGATTGTGAGGACCTCTCCCAATCACAGGTACACATTTACACTGAAGACACATCCATCGGTGGTTCCAGGGAGCATTGCATTCAGTTTACCTCAGAGAAAATGGGCTGGGCTTTCTATTGGGCAAGAAATAGAAGTCTCCTTATATACATTTGACAAAGCCAAACAGTGTATTGGCACAATGACCATCGAGATTGATTTCCTGCAGAAAAAAAGCATTGACTCCAACCCTTATGACACCGACAAGATGGCAGCAGAATTTATTCAGCAATTCAACAACCAGGCCTTCTCAGTGGGACAACAGCTTGTCTTTAGCTTCAATGAAAAGCTTTTTGGCTTACTGGTGAAGGACATTGAAGCCATGGATCCTAGCATCCTGAAGGGAGAGCCTGCGACAGGGAAAAGGCAGAAGATTGAAGTAGGACTGGTTGTTGGAAACAGTCAAGTTGCATTTGAAAAAGCAGAAAATTCGTCACTTAATCTTATTGGCAAAGCTAAAACCAAGGAAAATCGCCAATCAATTATCAATCCTGACTGGAACTTTGAAAAAATGGGAATAGGAGGTCTAGACAAGGAATTTTCAGATATTTTCCGACGAGCATTTGCTTCCCGAGTATTTCCTCCAGAGATTGTGGAGCAGATGGGTTGTAAACATGTTAAAGGCATCCTGTTATATGGACCCCCAGGTTGTGGTAAGACTCTCTTGGCTCGACAGATTGGCAAGATGTTGAATGCAAGAGAGCCCAAAGTGGTCAATGGGCCAGAAATCCTTAACAAATATGTGGGAGAATCAGAGGCTAACATTCGCAAACTTTTTGCTGATGCTGAAGAGGAGCAAAGGAGGCTTGGTGCTAACAGTGGTTTGCACATCATCATCTTTGATGAAATTGATGCCATCTGCAAGCAGAGAGGGAGCATGGCTGGTAGCACGGGAGTTCATGACACTGTTGTCAACCAGTTGCTGTCCAAAATTGATGGCGTGGAGCAGCTAAACAACATCCTAGTCATTGGAATGACCAATAGACCAGATCTGATAGATGAGGCTCTTCTTAGACCTGGAAGACTGGAAGTTAAAATGGAGATAGGCTTGCCAGATGAGAAAGGCCGACTACAGATTCTTCACATCCACACAGCAAGAATGAGAGGGCATCAGTTACTCTCTGCTGATGTAGACATTAAAGAACTGGCCGTGGAGACCAAGAATTTCAGTGGTGCTGAATTGGAGGGTCTGGTGCGAGCAGCCCAGTCCACTGCTATGAATAGACACATAAAGGCCAGTACTAAAGTGGAAGTGGACATGGAGAAAGCAGAAAGCCTGCAAGTGACGAGAGGAGACTTCCTTGCTTCTTTGGAGAATGATATCAAACCAGCCTTTGGCACAAACCAAGAAGATTATGCAAGTTACATTATGAACGGTATCATCAAATGGGGTGACCCAGTTACTCGAGTTCTAGATGATGGGGAGCTGCTGGTGCAGCAGACTAAGAACAGTGACCGCACACCATTGGTCAGCGTGCTTCTGGAAGGCCCTCCTCACAGTGGGAAGACTGCTTTAGCTGCAAAAATTGCAGAGGAATCCAACTTCCCGTTCATCAAGATCTGTTCTCCTGATAAAATGATTGGCTTTTCTGAAACAGCCAAATGTCAGGCCATGAAGAAGATCTTTGATGATGCGTACAAATCCCAGCTCAGTTGTGTGGTTGTGGATGACATTGAGAGATTGCTTGATTACGTCCCTATTGGCCCTCGATTTTCAAATCTTGTATTACAGGCTCTTCTCGTTTTACTGAAAAAGGCACCTCCTCAGGGCCGCAAGCTTCTTATCATTGGGACCACTAGCCGCAAAGATGTCCTTCAGGAGATGGAAATGCTTAACGCTTTCAGCACCACCATCCACGTGCCCAACATTGCCACAGGAGAGCAGCTGTTGGAAGCTTTGGAGCTTTTGGGCAACTTCAAGGATAAGGAACGCACCACAATTGCACAGCAAGTCAAAGGGAAGAAGGTCTGGATAGGAATCAAGAAGTTACTAATGCTGATCGAGATGTCCCTACAGATGGATCCTGAATACCGTGTGAGAAAATTCTTGGCCCTCTTAAGAGAAGAAGGAGCTAGCCCCCTTGATTTTGATTGA
SEQ ID NO.2：
MAGRSMQAARCPTDELSLTNCAVVNEKDFQSGQHVIVRTSPNHRYTFTLKTHPSVVPGSIAFSLPQRKWAGLSIGQEIEVSLYTFDKAKQCIGTMTIEIDFLQKKSIDSNPYDTDKMAAEFIQQFNNQAFSVGQQLVFSFNEKLFGLLVKDIEAMDPSILKGEPATGKRQKIEVGLVVGNSQVAFEKAENSSLNLIGKAKTKENRQSIINPDWNFEKMGIGGLDKEFSDIFRRAFASRVFPPEIVEQMGCKHVKGILLYGPPGCGKTLLARQIGKMLNAREPKVVNGPEILNKYVGESEANIRKLFADAEEEQRRLGANSGLHIIIFDEIDAICKQRGSMAGSTGVHDTVVNQLLSKIDGVEQLNNILVIGMTNRPDLIDEALLRPGRLEVKMEIGLPDEKGRLQILHIHTARMRGHQLLSADVDIKELAVETKNFSGAELEGLVRAAQSTAMNRHIKASTKVEVDMEKAESLQVTRGDFLASLENDIKPAFGTNQEDYASYIMNGIIKWGDPVTRVLDDGELLVQQTKNSDRTPLVSVLLEGPPHSGKTALAAKIAEESNFPFIKICSPDKMIGFSETAKCQAMKKIFDDAYKSQLSCVVVDDIERLLDYVPIGPRFSNLVLQALLVLLKKAPPQGRKLLIIGTTSRKDVLQEMEMLNAFSTTIHVPNIATGEQLLEALELLGNFKDKERTTIAQQVKGKKVWIGIKKLLMLIEMSLQMDPEYRVRKFLALLREEGASPLDF
SEQ ID NO.3：
5'-CTGTAGTCGGCCTTTCTCATC-3'
SEQ ID NO.4：
5'-GATGAGAAAGGCCGACTACAG-3'
SEQ ID NO.5：
5'-GTAACTCAATAGTTGTTTTGTGGG-3'。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过研究发现NSF基因上存在1种与LGS紧密相关的NSF罕见变异，c.1205C>G，上述变异一方面有助于解释癫痫患者的病因，另一方面可作为癫痫的生物标志物，利用该生物标志物可以在在发育性癫痫性脑病发病之初评估样本是否为癫痫患者样本；或作为孕前诊断预警，判断该突变型NSF基因携带者的后代是否具有患有癫痫的风险，并且利用本发明提供的生物标志物可以研发治疗或预防的药物，为治疗或预防LGS提供了一种全新的思路和手段,解决了目前发育性癫痫性脑病，尤其是LGS研究领域中不能在发病前进行诊断的技术问题。
(2)本发明通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲入NSF突变基因，构建果蝇发育性癫痫性脑病模型，通过杂交和CyO平衡处理后可检测行为表型改变。本发明为探究NSF突变或表达改变相关的癫痫的具体治疗方案、筛选癫痫相关药物提供一个可靠的动物模型。为NSF突变相关的癫痫发生机理研究提供实验材料。
附图说明
图1为脑电图，睡眠期可见全面性多棘波、多棘慢波发放，且呈爆发-抑制，多见于左后头部及双额区；
图2为携带NSF c.1205C>G变异患者的家系图；
图3为对携带NSF c.1205C>G基因变异患者及其父母的Sanger测序结果；
图4为NSF蛋白G402位点与其他生物NSF蛋白的部分同源对比分析结果；
图5为CRISPR-Cas9基因编辑技术构建果蝇点突变敲入模型示意图；
具体实施方式
本发明提供了一种具有新的突变位点的NSF突变基因作为发育性癫痫性脑病LGS的生物标志物，所述NSF正常基因的Gene ID：4905，所述NSF基因序列突变位点为c.1205C>G，所述NSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，NSF蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
通过研究发现NSF基因上存在1种与LGS紧密相关的NSF罕见变异，c.1205C>G，上述变异一方面有助于解释癫痫患者的病因，另一方面可作为癫痫的生物标志物，利用该生物标志物可以在在发育性癫痫性脑病发病之初评估样本是否为癫痫患者样本；或作为孕前诊断预警，判断该突变型NSF基因携带者的后代是否具有患有癫痫的风险，并且利用本发明提供的生物标志物可以研发治疗或预防的药物，为治疗或预防LGS提供了一种全新的思路和手段，解决了目前发育性癫痫性脑病，尤其是LGS研究领域中不能在发病前进行诊断的技术问题。
本发明提供了一种用于检测发育性癫痫性脑病LGS的致病基因NSF突变位点的试剂，所述试剂是扩增致病基因NSF突变位点c.1205C>G的引物对。所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的NSF-Seq F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的NSF-Seq R。利用本发明提供的试剂制备发育性癫痫性脑病LGS辅助诊断试剂盒。
本发明提供了一种NSF突变基因敲入果蝇发育性癫痫性脑病LGS模型的构建方法，所述构建方法为：利用CRISPR-Cas9技术在果蝇体内实现人类NSF基因同源基因c.1205C>G点突变敲入，得到所述的果蝇发育性癫痫性脑病LGS模型。所述CRISPR-Cas9基因编辑技术中gRNA设计的靶向序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供了所述的果蝇基因敲入模型在发育性癫痫性脑病发生机理研究中的应用。将所述果蝇基因敲入癫痫模型经过震荡刺激(Bang-sensitive paralytics)确定NSF基因点突变c.1205C>G，能够诱导果蝇癫痫易感性增加，再利用背地趋向实验(negativegeotaxis assay)测试该果蝇的运动能力变化，用于发育性癫痫性脑病的发生机理研究。
通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲入NSF突变基因，构建果蝇发育性癫痫性脑病模型，通过杂交和CyO平衡处理后可检测行为表型改变。此外，还为探究NSF突变或表达改变相关的癫痫的具体治疗方案、筛选癫痫相关药物提供一个可靠的动物模型，为NSF突变相关的癫痫发生机理研究提供实验材料。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
本文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。术语“突变”当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时，“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、全外显子测序及sanger测序验证
以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的临床资料，采用全外显子测序技术对LGS患者(脑电图如图1)及其父母进行三人组测序，通过筛选与发育性癫痫性脑病相关的突变位点，发现患者存在NSF基因的c.1205C>G新生错义突变有可能是引起LGS的重要遗传因素，其父母均未见突变(家系图如图2)。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
(1)研究样本的选择:经临床确诊的癫痫患者及其非患病父母。
(2)酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，得到100ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.8-2.0。
(3)全基因组外显子测序技术筛选突变位点。
(4)单个突变位点Sanger测序：取患者及其父母与296名健康对照的DNA样本，采用Primer 3软件在线设计引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，采用sanger测序法对NSF基因进行测序，测试结果发现患者存在突变，健康对照均无突变(测序结果如图3)。
二、序列比对及氨基酸残基保守性分析
结合GenTree数据库和Uniprot数据库对不同进化程度生物的NSF蛋白序列进行同源性比对，发现在不同进化程度生物体内，对应人类NSF蛋白的第402位甘氨酸(Gly)残基高度保守(图4)。并通过氨基酸序列比对，确定人类NSF基因在果蝇上的同源基因为comt(CG1618)。
三、果蝇模型的建立
使用CRISPR-Cas9基因编辑技术在野生型果蝇上构建NSF点突变(G402A)敲入模型，模型的构建方法步骤如下：
(1)通过在线工具设计gRNA序列，然后从目标果蝇品系提取基因组DNA(gDNA)。
(2)使用质粒MLM3613(Addgene质粒42251)制备Cas9 mRNA。
(3)使用注射品系的gDNA，通过Gibson Assembly Kit将突变位点序列克隆到pBluescript SK(-)质粒中。
(4)将Cas9 mRNA和gRNA混合并进行胚胎注射。
(5)使用PCR技术验证点突变是否成功，并通过杂交和CyO平衡处理，获得所需的果蝇品系。
四、行为学及运动能力测定
(1)运用Bang-sensitive paralytics试验确定NSF基因新生错义突变是否能诱导果蝇出现癫痫行为：在果蝇羽化后的3-5天使用CO2麻醉并转移至空管，然后进行震荡刺激，记录癫痫样行为发作的百分比和持续时间。
(2)由于LGS通常伴随有发育障碍，再利用背地趋向试验(negative geotaxisassay)测试果蝇模型的运动能力变化：将10只同基因型果蝇放在20厘米高容器内，记录它们在10秒内成功爬升到8厘米以上标记线的比例，进行10次实验并计算平均成功率，同时测试雄性和雌性果蝇，与Canton-S果蝇进行对照。
以上所述仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (9)
1.NSF突变基因作为生物标志物在辅助诊断LGS中的应用，其特征在于，所述NSF正常基因的GeneID：4905，所述NSF基因序列突变位点为c.1205C>G。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，NSF蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
3.一种用于检测发育性癫痫性脑病LGS的致病基因NSF突变位点的试剂，其特征在于，所述试剂是扩增致病基因NSF突变位点c.1205C>G的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的NSF-Seq F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的NSF-Seq R。
5.一种发育性癫痫性脑病LGS辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括权利要求3或4所述的试剂。
6.一种NSF突变基因敲入果蝇发育性癫痫性脑病LGS模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：利用CRISPR-Cas9技术在果蝇体内实现人类NSF基因同源基因c.1205C>G点突变敲入，得到所述的果蝇发育性癫痫性脑病LGS模型。
7.根据权利要求6所述的NSF突变基因敲入果蝇发育性癫痫性脑病LGS模型的构建方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas9基因编辑技术中gRNA设计的靶向序列如SEQ ID NO.5所示。
8.权利要求6或7所述的果蝇基因敲入模型在发育性癫痫性脑病发生机理研究中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述果蝇基因敲入癫痫模型经过震荡刺激确定NSF基因点突变c.1205C>G，能够诱导果蝇癫痫易感性增加，再利用背地趋向实验测试该果蝇的运动能力变化，用于发育性癫痫性脑病的发生机理研究。
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