CN117887763A - 一种用于治疗膀胱肿瘤的tcr-t免疫细胞制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种用于杀伤膀胱肿瘤的TCR‑T免疫细胞制备方法，该制备方法是从膀胱肿瘤患者T细胞中分离出肿瘤抗原特异性识别的T细胞，从此T细胞中获取其TCR基因序列，将识别肿瘤抗原的TCR的核苷酸序列的一个或多个导入到T细胞中进行表达，构建所述TCR‑T细胞，再输入到患者体中进行肿瘤细胞免疫治疗。所述TCR‑T细胞为携带有识别膀胱肿瘤抗原的TCR T细胞，所述TCR‑T细胞中的TCR来源于在膀胱肿瘤有PSCA抗原，且表达有ENTPD1基因的CD4、CD8T细胞。经验证，PSCA抗原在膀胱癌(包括前列腺癌)中有高表达，是较好的膀胱肿瘤免疫疗法靶标。本申请制备的TCR‑T细胞经验证能够有效应用于治疗人体的肿瘤，特别是用于膀胱肿瘤的免疫治疗。其制备方法的重点包括：①、鉴定识别肿瘤抗原TCR的方法；②、鉴定识别肿瘤抗原TCR‑T免疫细胞的方法。

Description

一种用于治疗膀胱肿瘤的TCR-T免疫细胞制备方法

技术领域

本发明申请涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于治疗膀胱肿瘤的TCR-T免疫细胞制备方法。

背景技术

肿瘤是一种由异常细胞增生引起的疾病，肿瘤细胞是人体自身细胞的变异体，它们能够逃避免疫系统的攻击并在人体内不断增殖，对人体机能、人体器管造成伤害，甚至危及人的生命。传统的肿瘤治疗方法有手术切除、放疗和化疗这些治疗方法，但这些治疗方法都有其局限性，手术切除只适用于早期癌症，而化疗和放疗的治疗效果有限，且对于人体的健康细胞损伤也很大。

细胞免疫疗法是目前治疗肿瘤中除常规方法如切除、化疗、放疗之外的又一种新型治疗方法，也是目前全球最受关注且比较有效的肿瘤治疗方法，它利用人体自身免疫系统的机制来攻击肿瘤细胞。免疫系统是人体的防御系统，通过产生抗体和T细胞来攻击入侵的病原体。然而，许多情况下肿瘤细胞可以伪装成正常细胞，从而逃避免疫系统的攻击，这样就需要人为的制作并扩增出能够识别肿瘤抗原并杀死肿瘤细胞的免疫性T细胞。T细胞是人体中一种免疫细胞，它可以通过识别和攻击入侵的病原体和异常细胞来保护人体免受疾病的侵害。在免疫细胞疗法中，可以通过提取患者自身的T细胞并将其改造成能够攻击肿瘤细胞的T细胞。通过在实验室中应用高端生物技术对能够实施攻击杀伤肿瘤的免疫细胞进行大量的活化培养及增值，使其具有高效识别和灭杀肿瘤细胞的能力，再回输至患者体内用于杀伤攻击肿瘤细胞，以达到治疗肿瘤的目的。其中，免疫细胞制剂也需要具备安全、有效、毒副作用低的三大特点。

目前实施的肿瘤细胞免疫疗法主要包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法和T细胞受体工程T细胞(TCR-T)疗法两种方法，由于CAR-T疗法只对治疗B细胞恶性肿瘤方面有着显著疗效，但对实体肿瘤就缺乏应有的效果，而近来的实践证明TCR-T更适合治疗实体肿瘤的治疗，TCR-T疗法在血液病和实体肿瘤的治疗中均显示出较高的安全性和有效性。

TCR-T免疫细胞是一种携带有识别肿瘤抗原TCR的T细胞。TCR在T细胞表面表达，由两条不同的蛋白链组成，在大多数成熟T细胞中，TCR由α和β链组成。TCR-T细胞免疫疗法，主要是从患者T细胞中分离出肿瘤抗原特异性识别的T细胞，从此T细胞中获取其TCR基因序列，将识别肿瘤抗原的TCR的核苷酸序列的一个或多个导入到普通的T细胞中进行表达，赋予该T细胞肿瘤抗原的识别能力，构建所述TCR-T细胞。经体外活化增殖后再输送到肿瘤病人体内，对肿瘤进行治疗，发挥其抗肿瘤功效。

目前，TCR-T肿瘤细胞免疫治疗是肿瘤治疗的一个新的发展方向，但都均处于初始研发阶段，由于TCR-T免疫细胞的制备过程比较复杂，技术要求较高，整个制作过程也需要一定的时间，因而导致研发制作成本较高，所以至今没有形成统一高效的制备方法，这就使得免疫细胞制备方法的研究显得五花八门，同时治疗效果也不尽相同。

发明内容

本发明的目的是针对以上技术问题，提供一种用于治疗膀胱肿瘤的TCR-T免疫细胞制备方法，所述TCR-T细胞为携带有识别膀胱肿瘤抗原的TCR T细胞，其制备方法重点内容包括：①、鉴定识别肿瘤抗原TCR的方法；②、鉴定识别肿瘤抗原TCR-T免疫细胞的方法。

运用所述用于治疗膀胱肿瘤的TCR-T免疫细胞制备方法，能够准确并快速地分析T细胞的肿瘤抗原识别能力，并通过比较识别肿瘤抗原的T细胞和不识别肿瘤抗原的T细胞之间的基因表达差异，找到了肿瘤组织中识别肿瘤抗原的T细胞所特有的分子标志物，并通过这些分子标志物实现对识别肿瘤抗原T细胞的快速分离，从而快速获得识别肿瘤抗原的TCR，建立了个体化的识别肿瘤抗原的TCR-T细胞治疗技术。

本发明提供了一种用于杀伤膀胱肿瘤的TCR-T细胞，所述TCR-T细胞为携带有识别膀胱肿瘤抗原TCR的T细胞，TCR-T免疫细胞中的TCR来源于在膀胱肿瘤显示有PSCA抗原，且表达ENTPD1基因的一个或多个CD4T、CD8 T细胞。

所述用于治疗膀胱肿瘤的TCR-T免疫细胞的制备方法，是从膀胱肿瘤患者T细胞中分离出肿瘤抗原特异性识别的T细胞，从此T细胞中获取其TCR，将此识别膀胱肿瘤抗原的TCR的核苷酸序列的一个或多个导入到T细胞中进行表达，构建所述TCR-T细胞。

所述鉴定识别肿瘤抗原的TCR的方法是：通过流式分选、磁珠分离或肿瘤组织原位测序方法，由膀胱肿瘤组织获得表达了识别肿瘤抗原CD4、CD8 T细胞的标志物ENTPD1的一种或多种T细胞及其携带的TCR序列。

所述TCR-T免疫细胞中的TCR来源于在膀胱肿瘤中表达ENTPD1基因中的一个或多个CD4T、CD8 T细胞。

所述鉴定识别肿瘤抗原的TCR-T免疫细胞的方法，该方法是：通过克隆肿瘤组织中的高频TCR，建立表达TCR的TCR-T细胞，利用表达肿瘤抗原串联基因的抗原呈递细胞进行体外肿瘤抗原刺激，能够被刺激起来的TCR-T细胞所携带的TCR即为识别肿瘤抗原的TCR，携带该TCR的T细胞即为识别肿瘤抗原的T细胞。

本发明的TCR-T细胞能够有效应用于治疗人体肿瘤，特别是用于人体膀胱肿瘤的细胞免疫治疗。

附图说明

附图1：NSG小鼠肿瘤治疗效果比较图，其中，A:小鼠肿瘤自然生长状态曲线；B:用TCR-T免疫细胞治疗后的肿瘤生长曲线；Tumor-1、Tumor-2、Tumor-3是由三个不同的膀胱肿瘤患者的肿瘤标本在NSG小鼠构建的肿瘤PDX模型。

具体实施方式

为更好地说明本发明技术方案，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。值得注意的是，出于简要清楚的目的，以下实施例中对一些常规的技术操作步骤、试剂、仪器并未进行细致的描述，但应理解，如未特别说明，这些常规技术操作步骤、试剂、仪器对本领域普通技术人员而言是显而易见的。

下面将结合本发明专利实施例中的附图，对本发明专利实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明专利一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明专利中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明专利保护的范围。

要制备膀胱肿瘤的TCR-T免疫细胞，先要在膀胱肿瘤的患者中，提取患者新鲜的肿瘤组织。这里，我们在医院膀胱肿瘤患者中提取到三个不同膀胱肿瘤患者的肿瘤标本，分别标记为Tumor-1、Tumor-2、Tumor-3，并将每个病例的肿瘤取样标本再分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各三份，并做好相应的标记。利用其中肿瘤标本的第Ⅰ的份，用Qiagen的DNeasy Blood&Tissue试剂盒提取肿瘤组织的DNA，使用Qiagen的miRNeasy-Mini试剂盒提取肿瘤组织的RNA。然后将获得的DNA和RNA样本送测序服务公司进行外显子和RNA测序。同时，提取患者外周血白细胞的DNA送测序服务公司进行外显子测序，作为检测肿瘤中基因突变的参考基因序列。通过比较肿瘤组织和外周血白细胞的外显子序列，找到在肿瘤组织中发生了突变的位点和对应的基因。并根据每个突变基因在肿瘤组织中的RNA表达量，对突变基因在肿瘤中的表达丰度进行排序，选择在肿瘤组织中表达较高的突变作为肿瘤抗原。然后将以突变位点为中心的25氨基酸表位肽，以及移码突变产生的新的多肽，作为肿瘤抗原串联起来，合成串联了这些肿瘤突变抗原的基因，并表达在经过EBV病毒感染后获得永生化的患者B细胞中，从而建立可以在体外长期使用，并且覆盖大部分肿瘤突变抗原的抗原呈递细胞，解决传统方法中无法有效获得肿瘤抗原进行抗原呈递的难题。

再通过流式细胞分选技术，分选出肿瘤中的T细胞后，对每个T细胞进行RNA测序。首先用手术刀将肿瘤组织切成小于1mm³的碎块后，按10倍体积加入组织消化液(具体配方可用：150ml RIPA 1640培养基、3ml胎牛血清、27mg胶原酶、7.5mg DNA酶)，于37℃消化2小时。消化完成后，经70μm筛网过滤，用PBS洗涤并重悬，得到单细胞悬液。在样本中加入终浓度为1:200的荧光流式抗体(具体配色方案可选用：CD45-APC-Cy7、CD3-APC、CD19-PE)，于4℃染色30分钟后，用PBS洗涤两次，然后用流式细胞分选仪(型号：BD Bioscience ArialIII)分选出单个的T淋巴细胞(CD45+CD3+)到96孔板。然后在96孔板中进行单细胞RNA反转录和和cDNA扩增，构建文库，送测序服务公司进行测序。测序结果用Cel lRanger软件进行分析，获得每个T细胞中的基因表达量，以及其所携带的TCR序列。然后，合成每个TCR的基因序列，并分别构建到慢病毒表达载体中。然后使用293T细胞包装病毒，收集病毒上清，通过高速离心浓缩病毒。重悬病毒后，与经过CD3/CD28抗体激活了3天的外周血淋巴细胞混匀，并加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(Polybrene)，然后加入到24孔板中，于30℃2000转离心50分钟，进行T细胞感染。然后去除上清，加入含10％FBS和200ng/mlIL2的RPMI培养基进行培养。通过慢病毒离心感染法，为每个TCR建立了一个TCR-T细胞系，实现了在体外的长期使用，解决了传统鉴定方法中的肿瘤T细胞体外培养难题。

在完成了以上两个技术方法的建立后，对膀胱癌肿瘤多个肿瘤组织进行T细胞识别肿瘤抗原的鉴定与分析。

取新鲜的膀胱肿瘤组织即前述肿瘤组织取样标本三份中的第Ⅱ份后，并将其Tumor-1、Tumor-2、Tumor-3三位患者的肿瘤组织进行混合，混合后再将其分为三组，分别是T-NO1、T-NO2、T-NO3。

所述第一部分T-NO1用于在免疫缺陷的NSG小鼠中进行PDX(Patient-DerivedXenograft)肿瘤模型的构建。具体方法是：首先用无菌剪刀将肿瘤组织剪成约1mm³的碎块，用套针接种到免疫缺陷的NSG小鼠左侧腹股沟皮下，成瘤以后再剪成小块，继续接种到NSG小鼠，经过三次成瘤后，将肿瘤切成小块冻存于液氮，用于后续的肿瘤治疗实验。

所述第二部分T-NO2肿瘤组织在提取DNA和RNA后，送测序服务公司进行外显子和RNA测序。同时，提取外周血白细胞的DNA送测序服务公司进行外显子测序，作为检测肿瘤中基因突变的参考基因序列。

所述第三部分T-NO3肿瘤组织用上述的实验方案裂解成单细胞悬液后，通过流式分选，将其中单个的CD4和CD8 T细胞分选到96孔板中，然后对这些T细胞分别进行RNA测序，获得每个细胞的TCR序列和大部分基因的RNA表达水平。通过外显子和RNA测序结果，获得在每个肿瘤组织中发生了突变的基因，以及这些突变基因的表达水平。然后，将这些表达的基因突变序列按照抗原串联的方式进行基因合成，并导入到经过EBV病毒感染后获得永生化的患者B细胞中表达，建立呈递肿瘤突变抗原的B细胞系。

根据所选择的突变抗原与合成的串联抗原基因序列，通过分析每个CD4和CD8 T细胞所携带的TCR序列，从每个肿瘤的CD4和CD8 T细胞中分别挑选出频率最高的3个TCR，也就是扩增最多的TCR，将其克隆出来，构建到慢病毒表达载体中。然后通过慢病毒导入到相应的患者外周血T细胞中，制备出TCR-T细胞。

为了明确这些TCR是否识别肿瘤抗原，将表达了肿瘤抗原的B细胞与每个TCR-T细胞系混合培养，进行抗原刺激实验，同时以不表达肿瘤抗原的B细胞作为对照。

首先将上述B细胞与T细胞按体积比1:1混合，接种于96孔板，共同培养48小时后，通过ELISA检测上清中的IFNG水平。若B细胞所表达的肿瘤抗原能够被T细胞所表达的TCR所识别，那么T细胞则会被激活并分泌效应性细胞因子IFNG。激活程度越高，产生的IFNG越多。通过比较上清中的IFNG水平，来确定这些TCR-T细胞是否能够被肿瘤抗原所激活，从而明确这些TCR是否识别肿瘤抗原。利用现有的技术体系，将识别肿瘤抗原的TCR鉴定出来。鉴定结果表明，肿瘤中确实存在即能够识别肿瘤抗原的T细胞，也存在不识别肿瘤抗原的T细胞。

为了鉴定肿瘤抗原特异T细胞亚群的分子标志物，根据所鉴定的TCR是否识别肿瘤，将携带这些TCR的CD4和CD8 T细胞分别分为两组：肿瘤抗原识别阳性和肿瘤抗原识别阴性。然后利用每个细胞的RNA测序结果，比较每个基因在将这两组T细胞之间的RNA表达丰度，找到具有明显表达差异的基因，结果发现了一批在肿瘤抗原识别阳性的T细胞中特异表达的基因。其中CD4肿瘤抗原识别T细胞特异表达有ENTPD1，在CD8肿瘤抗原识别T细胞中也同样表达有：ENTPD1并且在CD4和CD8肿瘤抗原识别T细胞中都高表达。这种特异表达的基因，能够显著区分识别肿瘤抗原的T细胞和不识别肿瘤抗原的T细胞。同时，这些特异表达的基因在不同肿瘤类型中均能够显著区分识别肿瘤抗原的T细胞和不识别肿瘤抗原的T细胞，具有广谱性。因此可以通过这些基因作为分子标志物从肿瘤中分离和鉴定出识别肿瘤抗原的T细胞，获得其携带的TCR，用于肿瘤治疗。

为了进一步验证通过这些分子标志物是否能够鉴定和分离出识别肿瘤抗原的T细胞，选择在T细胞表面表达的分子标志物作为流式分选的分子标记，其中肿瘤抗原识别CD4T、CD8 T细胞中选择了用ENTPD1，先按照上述的肿瘤组织消化方法，将3个肺癌组织处理成单细胞悬液后，然后取一部分单细胞悬液离心后，重悬到含有10％FBS的RPMI培养基中，密度为1x10⁶/ml，然后冻存到-80℃，作为肿瘤抗原用于后续的抗原刺激实验。其他的单细胞悬液分成数个组分，分别进行流式抗体染色。然后将肿瘤组织中的CD4和CD8T细胞根据这些分子标志物抗体的染色，分选出分子标志物阳性与阴性的两组细胞，共获得一组CD4 T细胞和一组CD8 T细胞。

将分选获得的各组T细胞重悬在含有10％FBS和200ng/ml IL2的RPMI培养基中，接种到包被了CD3/CD28抗体的U型底96孔板中，进行非特异性激活。培养一周后，将各组T细胞取出，经过两次PBS洗涤后，重悬到含有10％FBS的RPMI培养基中，密度为2x10⁶/ml，取接种到U型底的96孔板中，每组细胞3个重复。同时将冻存的肿瘤组织单细胞悬液通过水浴复苏到37度后，取50ul加入到接种的T细胞中，作为肿瘤抗原进行特异性激活。20小时后，通过ELISA检测培养基中的IFNG含量来检测各组T细胞对肿瘤抗原刺激的反应。结果是：在CD4 T细胞中，ENTPD1的T细胞，能够被肿瘤抗原激活起来，而相应分子标记阴性的T细胞则表现出了很低的刺激效果，同样，在CD8 T细胞中ENTPD1的T细胞，能够被肿瘤抗原激活起来，而相应分子标记阴性的T细胞则不能够被激活。

以上结果说明，这些分子标志物能够用于分离肿瘤中识别肿瘤抗原的T细胞。通过这些分子标志物分离出来的T细胞以及其携带TCR，这样的TCR-T细胞能够用于患者的肿瘤治疗。

为验证分离出的TCR-T细胞对治疗膀胱肿瘤效果如何，我们仍要进行实际治疗验证，首先，在NSG小鼠身上进行实际治疗验证，用识别肿瘤抗原的TCR-T细胞，对相同来源的肿瘤PDX模型进行治疗。

具体验证方法是：分别取前述三个膀胱肿瘤患者的肿瘤组织标本中的一份，也就是前述中的第Ⅲ份，用来对NSG小鼠再进行PDX肿瘤模型的构建。构建过程是：选6只NSG小鼠，将两个编为一组，共分为三组，其中每一组两只NSG小鼠接种同一个肿瘤病人的肿瘤，这样，用每个肿瘤患者的肿瘤标本，对应地接种了两只NSG小鼠。具体接种方法是：先用无菌剪刀将肿瘤组织剪成约1mm³的碎块，用套针接种到有免疫缺陷的NSG小鼠左侧腹股沟皮下，让其生长成瘤，并将这三组小鼠分别进行对应的编号，也就是与肿瘤患者的肿瘤标本的编号相对应，即：Tumor-1、Tumor-2、Tumor-3。

从前述已经验证了能够识别肿瘤抗原的TCR中，选择2个在CD4 T细胞中出现频率最高的TCR和2个在CD8 T细胞中出现频率最高的TCR，将这四个TCR-T细胞进行1:1:1:1体积比例混合，制备成综合型TCR-T免疫细胞进行肿瘤治疗。当移植到NSG小鼠皮下的PDX肿瘤生长到表面积大小约为50mm²时，就通过尾静脉给小鼠注射6x10⁶TCR-T细胞，对NSG小鼠进行肿瘤治疗，每组两只NSG小鼠中只对其中一只的NSG小鼠的延长，将每只NSG小鼠肿瘤生长变化情况做好记录，如附图1。

经过对比各组治疗与不治疗的NSG小鼠肿瘤变化情况显示，在对NSG小鼠肿瘤PDX的治疗中，TCR混合后制备成的TCR-T免疫细胞，对NSG小鼠肿瘤PDX的治疗效果显著，针对来自三个Tumor-1、Tumor-2、Tumor-3不同的肿瘤患者肿瘤标本移植到NSG小鼠皮下的PDX肿瘤，在进行肿瘤治疗，另一只做为治疗与不治疗肿瘤生长情况的参考。随着治疗时间治疗方法、制剂用量相同的情况下，每组均表现出了非常明显的治疗效果。而对比三组治疗变化曲线B，也显示出针对不同的肿瘤患者，肿瘤治疗效果还是略有所差别。

这些结果表明，通过本方法所鉴定出来的识别肿瘤抗原的TCR所制作的TCR-T免疫细胞制剂，不仅能够识别肿瘤抗原，还体现出很好的治疗效果。

Claims (5)

1.一种用于治疗膀胱肿瘤的TCR-T免疫细胞制备方法，其特征在于：所述TCR-T细胞为携带有识别膀胱肿瘤抗原的TCR T细胞，其制备方法的重点包括：①、鉴定识别肿瘤抗原TCR的方法；②、鉴定识别肿瘤抗原TCR-T免疫细胞的方法。

2.根据权利要求1所述的用于治疗膀胱肿瘤TCR-T免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述TCR-T免疫细胞中的TCR来源于在膀胱肿瘤显示有PSCA抗原，且表达ENTPD1基因的一个或多个CD4T、CD8 T细胞。

3.根据权利要求1所述的用于治疗膀胱肿瘤TCR-T免疫细胞的制备方法，其特征在于：是从膀胱肿瘤患者T细胞中分离出肿瘤抗原特异性识别的T细胞，从此T细胞中获取其TCR基因序列，将识别肿瘤抗原的TCR的核苷酸序列的一个或多个导入到T细胞中进行表达，构建所述TCR-T细胞。

4.根据权利要求1所述鉴定识别膀胱肿瘤抗原TCR的方法，其特征在于：通过流式分选、磁珠分离或肿瘤组织原位测序方法，由膀胱肿瘤组织获得表达了识别肿瘤抗原CD4、CD8 T细胞的标志物ENTPD1的一种或多种T细胞及其携带的TCR序列。

5.根据权利要求1所述鉴定识别肿瘤抗原的TCR-T细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：通过克隆肿瘤组织中的高频TCR，建立表达TCR的TCR-T细胞，利用表达肿瘤抗原串联基因的抗原呈递细胞进行体外肿瘤抗原刺激，能够被刺激起来的TCR-T细胞所携带的TCR即为识别肿瘤抗原的TCR，携带该TCR的T细胞即为识别肿瘤抗原的T细胞。