CN117887592A - 米曲霉jaas-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用 - Google Patents
米曲霉jaas-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117887592A CN117887592A CN202410238451.2A CN202410238451A CN117887592A CN 117887592 A CN117887592 A CN 117887592A CN 202410238451 A CN202410238451 A CN 202410238451A CN 117887592 A CN117887592 A CN 117887592A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aspergillus oryzae
- hermetia illucens
- jaas
- fermentation
- protein peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000709785 Hermetia illucens Species 0.000 title claims abstract description 80
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 title claims abstract description 77
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 title claims abstract description 77
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 claims abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 13
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 15
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000010806 kitchen waste Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000709334 Hermetia Species 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101001012669 Homo sapiens Melanoma inhibitory activity protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100029778 Melanoma inhibitory activity protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- -1 and 36 h is dialyzed Chemical compound 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229940124644 immune regulator Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003614 protease activity assay Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了米曲霉JAAS‑32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用，米曲霉JAAS‑32已于2023年8月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类命名为Aspergillus oryzae，保藏编号为GDMCC No：63725。本发明提供的米曲霉JAAS‑32，对黑水虻虫浆进行酶解发酵处理20‑40 h，其蛋白肽（<10 kDa）含量是未处理组的1.53倍，游离氨基酸的含量是未处理组的1.41倍，总抗氧化活性是未处理组的1.35倍；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和溶藻弧菌的抑菌圈直径分别是未处理组的1.62倍，1.17倍和1.45倍。该菌株易培养、生长快、适应性强，基于该菌株，可建立一种低成本、操作简便、高效的提高黑水虻虫浆抗菌性能的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及米曲霉JAAS-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用。
背景技术
抗生素的滥用，导致病原菌抗药性增强，催生“超级耐药菌”，抗生素耐药性与安全性已被世界卫生组织列为全球公共卫生的威胁之一。因此，寻找绿色安全高效的抗生素替代品成为行业迫切所需。
抗菌肽通常是由多个氨基酸残基组成的小分子多肽，具有较强的热稳定性、水溶性以及广谱高效的抗菌活性。抗菌肽的抗菌机理与抗生素不同，不易产生耐药性菌株。其中，昆虫源抗菌肽因具有良好的抑菌活性、稳定性及安全性，被认为是潜在的抗生素替代品之一，已然成为热点。
黑水虻（Hermetia illucens），是一种双翅目水虻科扁角水虻属的昆虫，其幼虫可将餐厨垃圾、畜禽粪便、废弃农作物等有机固废转化成富含蛋白及脂肪。黑水虻幼虫是一种优质蛋白资源，富含多种动物所需的氨基酸，也是各种养殖动物及宠物的良好饲料添加剂；如中国专利CN112544783A等很多专利均有报道。黑水虻含有丰富的具有生物活性成分的天然物质，其中包括抗菌肽、抗氧化剂以及免疫调节因子等。
因此，如何提升黑水虻虫浆中抗菌肽的含量及其抑菌性能，是黑水虻幼虫成为抗生素替代品的核心竞争力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供米曲霉JAAS-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用，通过米曲霉JAAS-32发酵样品对黑水虻虫浆的处理，可提高黑水虻虫浆蛋白肽的含量及抑菌性能。
本发明为实现上述目的采取的技术方案为：
本发明的第一方面在于，提供米曲霉JAAS-32，所述米曲霉JAAS-32已于2023年8月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类命名为Aspergillus oryzae，保藏编号为GDMCC No：63725。
本发明的第二方面在于，提供一种采用米曲霉JAAS-32制备黑水虻虫浆蛋白肽的方法，包括如下步骤：（1）制备黑水虻虫浆；米曲霉JAAS-32发酵获得米曲霉发酵样品；（2）将所述的黑水虻虫浆与所述的米曲霉发酵样品混合均匀并进行酶解发酵，得到黑水虻虫浆酶解发酵液。
优选地，步骤（1）中，将黑水虻幼虫与水按照质量比5:4~15:4混合匀浆，制备得到黑水虻虫浆。
更优选地，将黑水虻幼虫与水按照质量比5:2混合匀浆，即称取黑水虻幼虫200.0g，加入80.0 mL去离子水，在匀浆机中匀浆。
更优选地，所述的黑水虻虫为黑水虻幼虫，更优选五日龄期的黑水虻幼虫。
优选地，步骤（1）中，挑取米曲霉JAAS-32单菌落接入PDA液体培养基，培养温度为30～40 ℃，搅拌转速100～200 rpm，培养时间为48～96 h，得到米曲霉种子液；将所述的米曲霉种子液以体积比5%～20%的接种量接种至装有PDA液体培养基的发酵罐，培养温度为30～40 ℃，搅拌转速100～400 rpm，空气通气量为0.2～2 vvm，培养时间为48～96 h，获得米曲霉发酵样品。此时米曲霉发酵样品中米曲霉的浓度为1×107~1×108 CFU/mL。
优选地，步骤（2）中，每100 g黑水虻虫浆中，加入3~10 mL的米曲霉发酵样品；和/或所述酶解发酵的发酵温度为25~35 ℃，发酵时间为20~40 h。
更优选地，每100 g黑水虻虫浆中，加入5 mL的米曲霉发酵样品。
本发明的第三方面在于，提供上述的方法制备得到的黑水虻虫浆蛋白肽。
优选地，所述的黑水虻虫浆蛋白肽的分子量＜10 kDa。
更优选地，所述的黑水虻虫浆蛋白肽的分子量在1~10 kDa范围，更优选3~10 kDa范围。
本发明的第四方面在于，提供上述的黑水虻虫浆蛋白肽在制备抗氧化和/或抑菌产品中的应用。
优选地，所述的抑菌包括对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和溶藻弧菌的抑制。
优选地，所述的抗氧化和/或抑菌产品包括但不限于饲料添加剂。
本发明的第五方面在于，提供上述米曲霉JAAS-32在提高黑水虻虫浆蛋白肽的含量及抑菌性能中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明筛选得到一株米曲霉JAAS-32，保藏编号为GDMCC No：63725。将米曲霉JAAS-32对黑水虻虫浆进行酶解发酵处理20~40 h，其蛋白多肽（<10 kDa）含量是未处理组的1.53倍，游离氨基酸的含量是未处理组的1.41倍，总抗氧化活性是未处理组的1.35倍；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和溶藻弧菌的抑菌圈直径分别是未处理组的1.62倍，1.17倍和1.45倍。该菌株易培养、生长快、适应性强，基于该菌株，可建立一种低成本、操作简便、高效的提高黑水虻虫浆抗菌性能的工艺。
附图说明
图1 为基于ITS序列构建的系统发育树。
图2为米曲霉JAAS-32的蛋白水解圈。
图3为黑水虻抗菌肽对病原菌抑菌圈直径测定：a，未处理组黑水虻抗菌肽；b，米曲霉发酵组黑水虻抗菌肽；c，阴性对照无菌水；d，阳性对照氯霉素水溶液。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明提供的菌株为米曲霉（Aspergillus oryzae）JAAS-32，已于2023年8月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC；地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编：510070），分类命名为Aspergillus oryzae，保藏编号为GDMCC No. 63725。米曲霉JAAS-32（Aspergillus oryzae JAAS-32）GDMCC No.63725，简称为米曲霉JAAS-32。
下列实施例中，所述的PDA液体培养基配方为：马铃薯浸出粉6.0 g/L，葡萄糖20.0g/L，氯霉素0.1 g/L，pH值5.4-5.8。
所述的PDA固体平板即为PDA液体培养基中加入15 g/L的琼脂。
金黄色葡萄球菌货号：CICC 10306、大肠杆菌货号：CICC 10372、溶藻弧菌货号：CICC 10484。
实施例1 米曲霉的筛选、鉴定与酶活检测
1、菌种的分离、纯化
（1）称取餐厨垃圾喂养的新鲜的黑水虻幼虫200.0 g匀浆。称取匀浆后的黑水虻幼虫200.0 g，加入80.0 mL去离子水，在30.0 ℃、200 rpm条件下震荡1 h，取出静置30 min。
（2）取上清液用无菌水进行梯度稀释至105 CFU/mL，将稀释后的菌悬液涂布在PDA固体平板。30 ℃倒置恒温培养24 h，从平板上选取单菌落，重复涂布在PDA固体平板上，获得纯培养的微生物菌种。
2、菌株的鉴定
对筛选出来的真菌进行ITS测序。采用柱式DNA方法（柱式DNA提取试剂盒购自于生工生物工程（上海）股份有限公司）提取真菌基因组的DNA，对提取得到的DNA采用ITS扩增引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。
所述的ITS1序列为：5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（SEQ ID No.1），ITS4序列为：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（SEQ ID No.2）。PCR扩增体系见表1，PCR扩增程序见表2。
表1 PCR扩增体系
| 试剂 | 剂量（μL） |
| 引物ITS1 | 1.5 |
| 引物ITS4 | 1.5 |
| ddH2O | 20.5 |
| Mastermix | 15 |
| DNA模板 | 1.5 |
表2 PCR扩增程序
| 步骤 | 条件 |
| 预变性 | 95 ℃，5 min |
| 变性 | 95 ℃，30 s |
| 退火 | 57 ℃，30 s |
| 延伸 | 72 ℃，1 min30 s |
| 终延伸 | 72 ℃，7 min |
| 保存 | 4 ℃ |
注：循环变性-退火-延伸三个过程，共30个循环。
将PCR扩增产物送至通用生物（安徽）股份有限公司进行测序，对测序后得到的ITS片段基因序列如SEQ ID No.3所示，与NCBI数据库进行同源性比对，并使用MGEA 11构建系统发育树，详细见图1。从图1可以看出，该菌株鉴定为米曲霉（Aspergillus oryzae）。
所述的ITS片段基因序列SEQ ID No.3如下：
GATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGGTAGCCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGC
3、米曲霉蛋白水解圈测定
（1）米曲霉JAAS-32菌液制备
从-80 ℃冰箱取出冻存的米曲霉JAAS-32菌株。将其涂布在PDA固体平板，30 ℃培养24 h。从PDA固体平板上取出1-2环米曲霉单菌落接种于100 mL PDA液体培养基中，恒温培养箱（30 ℃，200 rpm）培养24 h，即得米曲霉JAAS-32菌液。
（2）米曲霉蛋白水解圈
吸取适量米曲霉JAAS-32菌液，轻点在蛋白酶筛选平板（蛋白酶筛选平板配方：脱脂牛奶20 g/L，琼脂20 g/L）上，30 ℃倒置培养24h观察并测定米曲霉蛋白水解圈直径，如图2所示，结果显示：米曲霉蛋白水解圈直径25±0.2 mm。
4、米曲霉总蛋白酶活测定
对米曲霉JAAS-32菌液，使用南京建成生物工程研究所总蛋白酶酶活测定试剂盒，进行蛋白酶酶活测定，酶活性为1.104偶氮酪蛋白/h/mg。
实施例2 黑水虻虫浆的米曲霉酶解制备工艺
1、黑水虻虫浆的制备
称取餐厨垃圾喂养的新鲜黑水虻五日龄期幼虫200.0 g，加入80.0 mL无菌水至匀浆机中匀浆，获取黑水虻虫浆。
2、米曲霉JAAS-32发酵获得米曲霉发酵样品
米曲霉JAAS-32划线接种于PDA固体平板，30 ℃培养24 h得到活化的米曲霉JAAS-32单菌落。挑取米曲霉JAAS-32单菌落接入PDA液体培养基，培养温度为30 ℃，搅拌转速150rpm，培养时间为60 h，得到米曲霉种子液；将种子液以体积比10%的接种量接种至装有PDA液体培养基的发酵罐，培养温度为30 ℃，搅拌转速300 rpm，空气通气量为0.4 vvm，培养时间60 h，即得米曲霉JAAS-32发酵样品。
3、米曲霉发酵黑水虻虫浆
称取黑水虻虫浆100.0 g，加入5 mL米曲霉发酵样品混合均匀，放入恒温培养箱（30.0 ℃，200 rpm）发酵24 h，得到米曲霉发酵组黑水虻虫浆发酵液。
另，称取黑水虻虫浆100.0 g，放入恒温培养箱（30.0 ℃，200 rpm）发酵24 h，得到未处理组黑水虻虫浆发酵液。
4、透析袋透析黑水虻蛋白多肽（<10 kDa）
（1）透析袋预处理：
将截留分子量为10 kDa的透析袋剪成11 cm长的小段，使用前用EDTA（pH=8.0）煮沸洗去表面杂质，取出透析袋后，用蒸馏水进行彻底清洗，确保透析袋表面不残留任何清洗剂或杂质。
（2）透析及蛋白多肽（<10 kDa）含量测定：
取出步骤3得到的黑水虻虫浆发酵液，将发酵液装入透析袋，并使用透析夹或扎带夹好两端。将装有虫浆的透析袋放入烧杯中，加入50 mL蒸馏水，确保透析袋完全浸泡在蒸馏水中，透析36 h，每12 h换一次蒸馏水。透析结束后混合3次透析液，采用BCA法测定其中蛋白肽含量，采用游离氨基酸含量试剂盒（购自于苏州格锐思生物科技有限公司）测定游离氨基酸含量。
试验结果：
与未处理组黑水虻虫浆发酵液相比，本实施例的米曲霉发酵组蛋白多肽（<10kDa）含量和游离氨基酸含量均有所提升。如表3得知，米曲霉发酵组蛋白多肽（<10 kDa）含量是未处理组的1.53倍；游离氨基酸的含量是未处理组的1.41倍。表明，米曲霉分泌的蛋白酶，可以将大分子蛋白酶解为多肽及氨基酸。
表3 未处理组与米曲霉发酵组黑水虻虫浆蛋白肽及游离氨基酸含量
| 名称 | 蛋白多肽<10 kDa（mg/g） | 游离氨基酸（mg/g） |
| 未处理组 | 118.400 | 30.571 |
| 米曲霉发酵组 | 181.020 | 43.215 |
测试例1 黑水虻虫浆蛋白肽的总抗氧化活性检测
取出实施例2米曲霉酶解发酵组制备的黑水虻虫浆蛋白多肽（<10 kDa）冻干粉，用超纯水配制成浓度为10 mg/mL的系列溶液，按照总抗氧化能力测定试剂盒（购自于南京建成生物工程研究所）说明书方法，进行总抗氧化能力测定试验。
试验结果：未处理组和米曲霉发酵组制备的黑水虻蛋白肽均表现出抗氧化活性，当黑水虻蛋白多肽（<10 kDa）浓度为10 mg/g时，如表4所示，未处理组的总抗氧化能力为26.81 U/mg，米曲霉酶解发酵组的总抗氧化能力为36.18 U/mg，是未处理组的1.35倍。
表4 黑水虻蛋白肽总抗氧化活性
测试例2 黑水虻虫浆蛋白肽的抑菌活性检测
1、黑水虻虫浆抗菌肽的提取
（1）配制抗菌肽提取液（10%乙酸、0.01 moL/L Na2EDTA）。
（2）实施例2未处理组和米曲霉发酵组黑水虻虫浆发酵液分别与抗菌肽提取液混合均匀（v:v=1:10），200 rpm，37 ℃浸提半小时，转移至离心机（3500 rpm，25 min）收集上清液，作为抗菌肽粗提取液。将其进一步冷冻干燥，获得黑水虻抗菌肽。
2、黑水虻抗菌肽抑菌活性测定
阴性对照为无菌水；抗生素氯霉素作为阳性对照，浓度配制成0.5 mg/mL的氯霉素水溶液。确定金黄色葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液浓度为1.0×109 CFU/mL以及溶藻弧菌菌液浓度为1.0×107 CFU/mL，吸取适量金黄色葡萄球菌菌液和大肠杆菌菌液，均匀的涂布在LB培养基上，溶藻弧菌菌液均匀的涂布在TCBS平板上。将直径为7.5 mm的牛津杯轻轻的放置在LB平板上，在牛津杯中加入等量黑水虻抗菌肽，在37 ℃恒温培养箱内培养10 h，观察并测量抑菌圈直径。
试验结果：对黑水虻抗菌肽进行体外抑菌测试。抑菌效果如下：从表5可以看出，未处理组和米曲霉发酵组均有抑菌圈出现，未处理组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和溶藻弧菌的抑菌圈分别为16±0.1 mm，24±0.1 mm和20±0.2 mm，米曲霉酶解发酵组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和溶藻弧菌的抑菌圈分别为26±0.2 mm，28±0.1 mm和29±0.2 mm；抑菌圈直径分别是未处理组的1.62倍，1.17倍和1.45倍。试验结果表明，经米曲霉酶解发酵后黑水虻虫浆的抗菌性能，得到显著提高。
表5 黑水虻抗菌肽抑菌活性
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.米曲霉JAAS-32，所述米曲霉JAAS-32已于2023年8月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类命名为Aspergillus oryzae，保藏编号为GDMCC No：63725。
2.一种采用权利要求1所述的米曲霉JAAS-32制备黑水虻虫浆蛋白肽的方法，包括如下步骤：（1）制备黑水虻虫浆；米曲霉JAAS-32发酵获得米曲霉发酵样品；（2）将所述的黑水虻虫浆与所述的米曲霉发酵样品混合均匀并进行酶解发酵，得到黑水虻虫浆酶解发酵液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，将黑水虻幼虫与水按照质量比5:4~15:4混合匀浆，制备得到黑水虻虫浆。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，挑取米曲霉JAAS-32单菌落接入PDA液体培养基，培养温度为30～40 ℃，搅拌转速100～200 rpm，培养时间为48～96 h，得到米曲霉种子液；将所述的米曲霉种子液以体积比5%～20%的接种量接种至装有PDA液体培养基的发酵罐，培养温度为30～40 ℃，搅拌转速100～400 rpm，空气通气量为0.2～2vvm，培养时间为48～96 h，获得米曲霉发酵样品。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，每100 g黑水虻虫浆中，加入3~10 mL的米曲霉发酵样品；和/或所述酶解发酵的发酵温度为25~35 ℃，发酵时间为20~40h。
6.权利要求2~5任意一项所述的方法制备得到的黑水虻虫浆蛋白肽。
7.根据权利要求6所述的黑水虻虫浆蛋白肽，其特征在于，所述黑水虻虫浆蛋白肽的分子量＜10 kDa。
8.权利要求6所述的黑水虻虫浆蛋白肽在制备抗氧化和/或抑菌产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抑菌包括对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和溶藻弧菌的抑制。
10.权利要求1所述的米曲霉JAAS-32在提高黑水虻虫浆蛋白肽的含量及抑菌性能中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410238451.2A CN117887592B (zh) | 2024-03-04 | 2024-03-04 | 米曲霉jaas-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410238451.2A CN117887592B (zh) | 2024-03-04 | 2024-03-04 | 米曲霉jaas-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117887592A true CN117887592A (zh) | 2024-04-16 |
| CN117887592B CN117887592B (zh) | 2024-05-17 |
Family
ID=90646980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410238451.2A Active CN117887592B (zh) | 2024-03-04 | 2024-03-04 | 米曲霉jaas-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117887592B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107986830A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-04 | 广东惜福环保科技有限公司 | 餐厨垃圾的处理方法及其制备的有机肥 |
| CN111876456A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-11-03 | 刘德江 | 一种黑水虻抗菌肽的提取方法 |
| US20220312797A1 (en) * | 2017-04-07 | 2022-10-06 | Entomics Biosystems Limited | Process for Converting Invertebrates into Feedstock |
-
2024
- 2024-03-04 CN CN202410238451.2A patent/CN117887592B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220312797A1 (en) * | 2017-04-07 | 2022-10-06 | Entomics Biosystems Limited | Process for Converting Invertebrates into Feedstock |
| CN107986830A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-04 | 广东惜福环保科技有限公司 | 餐厨垃圾的处理方法及其制备的有机肥 |
| CN111876456A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-11-03 | 刘德江 | 一种黑水虻抗菌肽的提取方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李冬宝;: "胡文锋:利用微生物及黑水虻处理畜禽粪便可不断提高其利用利润", 北方牧业, no. 20, 20 October 2016 (2016-10-20) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117887592B (zh) | 2024-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108795814B (zh) | 一种可降解废弃羽毛的菌株、筛选方法及其应用 | |
| CN107058156B (zh) | 四环素类抗生素降解菌株、含有该菌株的菌剂及其应用 | |
| CN110564640B (zh) | 一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌wf2019菌株及其应用 | |
| CN112574924B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株及其微生态制剂和应用 | |
| CN103525724A (zh) | 一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法 | |
| CN110484467B (zh) | 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用 | |
| CN110093295B (zh) | 一株抗鱼类病原菌的黄三素链霉菌及其应用 | |
| CN114561363B (zh) | 一种具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体PC-Liy1、制备方法及应用 | |
| CN108546663B (zh) | 一种猪源卷曲乳杆菌及其应用 | |
| CN105779346B (zh) | 一种产细菌素的屎肠球菌及其应用 | |
| CN109022318B (zh) | 枯草芽孢杆菌l1及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的应用 | |
| CN110195027A (zh) | 烟草节杆菌zl-1及其堆肥低温发酵菌剂的制备方法与应用 | |
| KR20140004457A (ko) | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| CN117887592B (zh) | 米曲霉jaas-32及其在制备黑水虻虫浆蛋白肽中的应用 | |
| CN116064332B (zh) | 一株降解黄曲霉毒素b1的菌株及其应用 | |
| CN110150457B (zh) | 一种抑菌型酵母培养物及其应用 | |
| CN109266570B (zh) | 一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂及应用 | |
| CN108315266B (zh) | 蝉拟青霉及应用 | |
| CN105861390B (zh) | 一株荚膜红细菌菌株及其筛选方法与应用 | |
| CN105861389B (zh) | 用于提高水产动物生长性能的芽孢杆菌菌株及其筛选方法与应用 | |
| CN111676160B (zh) | 牛大力内生菌rh5在促进牛大力生长中的应用 | |
| CN114933974A (zh) | 一种拟康氏木霉c5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用 | |
| CN1279159C (zh) | 白耙齿菌cz－81菌株及其人工培养方法 | |
| CN114657082A (zh) | 一种乳酸乳球菌及其应用 | |
| CN108004181B (zh) | 一株甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |