CN117883597A - 复合纳米粒子及其制备方法和应用、包含复合纳米粒子的试剂盒、利用复合纳米粒子进行胰岛素示踪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种复合纳米粒子、胰岛素示踪方法及其应用。本发明构建了一种能够特异性结合胰岛素的纳米材料以及利用该纳米材料进行胰岛素示踪的方法，该纳米材料由上转换纳米粒子、猝灭剂和抗体组成。具体内容为合成能特异性结合胰岛素的纳米材料，将合成后的纳米材料与分离纯化、过夜培养后的小鼠胰岛细胞进行共孵育，将共孵育后的小鼠胰岛细胞移植入小鼠体内，以实现体内胰岛素浓度的实时监测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种复合纳米粒子、胰岛素示踪方法及其应用，具体来说，本发明构建了一种能够特异性结合胰岛素的纳米材料以及利用该纳米材料进行胰岛素示踪的方法，并涉及小鼠胰岛细胞的分离，体外培养及高效的体内移植技术。利用该示踪技术能实时监测小鼠体内胰岛素浓度。
背景技术
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。胰岛素分泌过多时，血糖下降迅速，脑组织受影响最大，可出现惊厥、昏迷，甚至胰岛素休克。相反，胰岛素分泌不足或胰岛素受体缺乏常导致血糖升高，若超过肾糖阈，则糖从尿中排出，引起糖尿，同时，血液成份含有过量的葡萄糖，亦会导致高血压、冠心病和视网膜血管病等病变。糖尿病患者血糖升高的主要原因是胰岛素的绝对或相对不足，因此实时监测体内胰岛素浓度变化，可进一步了解胰岛β细胞的功能，对糖尿病的诊断、治疗及预后都有着重要的意义。
胰岛细胞移植技术是目前备受关注的治疗糖尿病的手段之一，但移植后的胰岛细胞常常因细胞凋亡或坏死而丧失分泌胰岛素的功能，目前医学上监测胰岛素浓度最为常用的方法是放射免疫分析(R1A)，但是，放射免疫分析存在以下问题：（1）测定过程会使用生物试剂，其稳定性受多种因素影响，需要有一整套质量控制措施来确保结果的可靠性；（2）方法本身的工作原理限制了检测胰岛素的灵敏度，即不能测定特别低含量的胰岛素；（3）放射免疫分析是竞争性反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量；（4）存在放射线辐射和污染等问题。
因此迫切需要一种受周围环境影响小、稳定性高、可以实时进行胰岛素监测，并能用于体内胰岛素浓度的检测的方法。
发明内容
近年来，上转换纳米粒子（UCNPs）在生物传感领域展现出广阔的前景，UCNPs具有粒径小、形状可调、稳定性高、发射带宽窄、荧光寿命长、发射范围广、生物相容性好、表面易修饰等优点。小粒径、强荧光发射的UCNPs经过表面修饰后，可以作为一类多功能的复合纳米粒子，在生物医学等领域发挥着重要作用。本发明提供了一种监测体内胰岛素的复合纳米材料及其在胰岛素示踪方面的应用，该复合纳米材料由上转换纳米粒子、猝灭剂和抗体组成。具体为合成能特异性结合胰岛素的复合纳米材料，将复合纳米材料与分离纯化、过夜培养后的小鼠胰岛细胞进行共孵育，随后将共孵育后的小鼠胰岛细胞移植入小鼠体内，进入小鼠体内的复合纳米材料能与小鼠分泌的胰岛素相结合，实现体内胰岛素浓度的实时监测。
为此，本发明第一方面提供一种复合纳米粒子，包括：上转换纳米粒子、胰岛素抗体和猝灭剂，其中，所述胰岛素抗体搭载于所述上转换纳米粒子与所述猝灭剂之间。
本发明的复合纳米粒子能够特异性结合胰岛素，可以有效地对不同液体环境中存在的胰岛素进行有效检测，且在双光子显微镜的激光照射下，在培养具有胰岛素分泌功能的类器官中，可以实现类器官明亮的荧光成像，对类器官细胞内的胰岛素进行动态的可视化监测。
根据本发明的具体实施方案，当体内含有胰岛素时，胰岛素能与UCNPs-Ab通过抗原抗体相互作用结合在一起，导致UCNPs-Ab与猝灭剂距离被拉长，受激光激发的UCNPs不能将能量传递给猝灭剂，使得上转换纳米粒子本身的红色荧光强度恢复，在含有不同浓度的胰岛素的环境中，上转换纳米粒子恢复的荧光强度不同。
根据本发明的具体实施方案，本发明的复合纳米粒子与胰岛细胞共孵育后，可以进入到胰岛细胞中，在胰岛细胞移植技术中，可以实时监测胰岛细胞分泌胰岛素的状态、检测分泌的胰岛素的浓度，可以作为胰岛细胞移植的伴随诊断方法，在短时间内预测胰岛细胞移植技术治疗糖尿病的效果。
根据本发明的具体实施方案，所述复合纳米粒子进一步包括聚乙烯亚胺。
根据本发明的具体实施方案，所述聚乙烯亚胺附着于所述上转换纳米粒子的外表面，所述胰岛素抗体通过与所述聚乙烯亚胺共价相连搭载于所述上转换纳米粒子的外表面，所述聚乙酰亚胺为述胰岛素抗体搭载于所述上转换纳米粒子提供连接位点。
根据本发明的具体实施方案，所述猝灭剂通过共价键与所述胰岛素抗体连接。
根据本发明的具体实施方案，所述猝灭剂能猝灭所述上转换纳米粒子发出的光。
根据本发明的具体实施方案，所述猝灭剂包括孟加拉红溴己酸、黑洞猝灭剂-2、TQ3琥珀酰亚胺酯中的任意一种。
需要说明的是，只要是吸收波长在550 nm左右的的淬灭剂均适用于本发明，比如黑洞猝灭剂-2（BHQ-2），一种黑洞猝灭荧光染料，它的吸收波长在579nm和550-650nm之间，常与在可见光557-617nm范围内发出橘黄色荧光的染料配合使用，可以有效地抑制该染料发光；TQ3琥珀酰亚胺酯（Tide Quencher 3），一种被设计用于TAMRA、TF3和Cy3的荧光淬灭剂。它的吸收波长为576nm，发射波长为N/A，分子量为550.59。
根据本发明的具体实施方案，所述孟加拉红溴己酸（RBHA）由孟加拉红与溴己酸反应获得的。
根据本发明的具体实施方案，所述上转换纳米粒子包括核层、壳层，所述壳层包裹所述核层。
根据本发明的具体实施方案，所述核层包括NaYF4:Yb3+/Er3+，所述壳层包括NaYF4。
根据本发明的具体实施方案，所述上转换纳米粒子在可见光照射下可发出红色荧光，当所述可见光波长为645nm~665nm出时现红色荧光发射峰，其中荧光强度灵敏度较高，减少周围环境的影响后，可显著提高检测胰岛素的灵敏度，稳定、有效的利用荧光强度获得胰岛素浓度。
根据本发明的实施例，上述上转换纳米粒子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的具体实施方案，所述核层的粒径为22-28nm，优选为25nm。
根据本发明的具体实施方案，所述壳层的粒径为32-38nm，优选为35nm。
根据本发明的具体实施方案，所述Y3+是以YCl3·6H2O的形式提供的，所述Yb3+是以YbCl3·6H2O的形式提供的，所述Er3+是以ErCl3·6H2O的形式提供的。根据本发明实施例的形式提供Y3+、Yb3+和Er3+制备得到的上转换纳米粒子具有很好的发光效果。
根据本发明的具体实施方案，所述核层中Y3+、Yb3+、Er3+的摩尔比为（78-82）：（16-20）：（1-2）。
根据本发明的具体实施方案，所述核层中Y3+、Yb3+、Er3+的摩尔比为40：9：1。
本发明第二方面提供一种制备第一方面所述复合纳米粒子的方法，包括：
1）将所述上转换纳米粒子与所述聚乙烯亚胺在溶液1中混合，获得上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺；
2）将所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺与活化后的胰岛素抗体共孵育，获得上转换纳米粒子-抗体；
3）将所述上转换纳米粒子-抗体与活化后的猝灭剂共孵育，获得结构为上转换纳米粒子-抗体-猝灭剂的复合纳米粒子，
其中，
所述溶液1包括选自环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、四氟硼酸亚硝中的至少之一。
利用本发明制备方法制备的复合纳米粒子，能够特异性结合胰岛素，可以有效地对不同液体环境中存在的胰岛素进行有效检测，且在双光子显微镜的激光照射下，在培养具有胰岛素分泌功能的类器官中，可以实现类器官明亮的荧光成像，对类器官细胞内的胰岛素进行动态的可视化监测。
根据本发明的具体实施方案，当体内含有胰岛素时，胰岛素能与UCNPs-Ab通过抗原抗体相互作用结合在一起，导致UCNPs-Ab与猝灭剂距离被拉长，受激光激发的UCNPs不能将能量传递给猝灭剂，使得上转换纳米粒子本身的红色荧光强度恢复，在含有不同浓度的胰岛素的环境中，上转换纳米粒子恢复的荧光强度不同。
根据本发明的具体实施方案，本发明制备的复合纳米粒子与胰岛细胞共孵育后，可以进入胰岛细胞中，在胰岛细胞移植技术中，可以实时监测胰岛细胞分泌胰岛素的状态、检测分泌的胰岛素的浓度，可以作为胰岛细胞移植的伴随诊断方法，在短时间内预测胰岛细胞移植治疗糖尿病的效果。
根据本发明的具体实施方案，步骤2）中，活化所述胰岛素抗体的方法包括：将所述胰岛素抗体与交联剂1混合孵育。
根据本发明的具体实施方案，步骤3）中，活化所述猝灭剂的方法包括：将所述猝灭剂与交联剂2混合孵育。
根据本发明的具体实施方案，所述交联剂1、交联剂2各自独立地选自1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的至少之一。
根据本发明的具体实施方案，步骤2）中，所述胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺在所述共孵育的体系中的摩尔比为（5-8）：（400-600）。
根据本发明的具体实施方案，步骤2）中，所述胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺在所述共孵育的体系中的摩尔比为（6.5-7.5）：（450-550）。
根据本发明的具体实施方案，步骤3）中，所述猝灭剂与加载有抗体的上转化纳米粒子上转换纳米粒子的摩尔比为1：（7-20）。
根据本发明的具体实施方案，所述猝灭剂与所述上转换纳米粒子-抗体在共孵育体系中的摩尔比为1：（10-18）。
根据本发明更具体的实施例，制备第一方面所述复合纳米粒子的方法包括：①将上转换纳米粒子与环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、四氟硼酸亚硝（NOBF4）进行第一混合和第一离心处理，获得沉淀物；②将所述沉淀物与含有聚乙烯亚胺的DMF进行第二混合和第二离心处理，以获得上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺（UCNPs-PEI）；③将胰岛素抗体与EDC、NHS进行第三混合处理，以获得活化的胰岛素抗体；④将所述活化的胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺进行第四混合和第三离心处理，以获得上转换纳米粒子-抗体（UCNPs-Ab）；⑤将孟加拉红溴己酸与EDC、NHS进行第五混合处理，以获得活化的孟加拉红溴己酸；⑥将活化的孟加拉红溴己酸与所述上转换纳米粒子-抗体按照1：（7-20）的摩尔比进行第六混合和第四离心处理，以获得所述复合纳米粒子（上转换纳米粒子-抗体-孟加拉红溴己酸，UCNPs-Ab-RBHA）。根据本发明实施例的方法制备的所述复合纳米粒子可以有效的对不同液体环境中存在的胰岛素进行有效检测，且在双光子显微镜的激光照射下，可以实现类器官明亮的荧光成像，对类器官细胞内的胰岛素进行动态的可视化监测。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述孟加拉红溴己酸吸收峰为555nm。
根据本发明的实施例，所述孟加拉红溴己酸与所述上转换纳米粒子-抗体按照1：16的摩尔比进行混合处理。
根据本发明的实施方案，所述第六混合进行180-210min。
本发明第三方面提供第一方面所述的复合纳米粒子在检测胰岛素和/或监测胰岛素分泌状况的试剂盒中的应用。
本发明第四方面提供一种试剂盒，含有第一方面所述的复合纳米粒子，所述试剂盒用于检测胰岛素和/或监测胰岛素分泌状况。
本发明第五方面提供第一方面所述的复合纳米粒子在检测和/或监测具有胰岛素分泌功能的类器官中的应用。
根据本发明的具体实施方案，所述复合纳米粒子一方面可以检测具有胰岛素分泌功能的类器官分泌胰岛素能力的强弱，或者检测培养的类器官是否真的具备分泌胰岛素的功能；另一方面可以对类器官细胞内的胰岛素进行动态的可视化监测。
本发明第六方面提供一种检测胰岛素的方法，包括：
a.将待测样本与第一方面所述的复合纳米粒子混合，获得混合待测样本；
b.用激发光激发所述混合待测样本。
根据本发明的具体实施方案，所述待测样本包括具有胰岛素分泌功能的类器官样本、组织样本或细胞样本。
根据本发明的实施方案，所述激发光的波长为950-1000nm，例如951nm、955nm、960nm、965nm、970nm、980nm、985nm、990nm、1000nm，优选为980nm。
本发明第七方面提供一种监测胰岛素分泌状况的方法，包括：
A.将第一方面所述的复合纳米粒子与体外胰岛细胞共孵育；
B.将步骤A中获得的共孵育后的胰岛细胞移植进受施体中；
C.饥饿处理受施体后，对受施体补充营养物质；
D.用激发光激发所述受施体移植胰岛细胞的移植部位；
E.基于红色荧光的发光强度，确定所述受施体的胰岛素浓度。
根据本发明的实施方案，步骤A中，所述共孵育之前，用链脲佐菌素处理所述体外胰岛细胞。
根据本发明的实施方案，所述体外胰岛细胞源自鼠源胰岛细胞或灵长目源胰岛细胞中的任意之一。
根据本发明的实施方案，步骤C中，所述受施体包括小鼠、羊、骆驼、马、猴中的任意之一。
根据本发明的实施方案，步骤C中，所述补充营养物质包括通过注射葡萄糖、喂食可代谢为糖类的食品。
根据本发明的实施方案，步骤D中，所述移植部位包括眼部、腹部中的任意之一。
根据本发明的实施方案，步骤D中，所述激发光的波长为950-1000nm，例如951nm、955nm、960nm、965nm、970nm、980nm、985nm、990nm、1000nm，优选为980nm。
根据本发明的具体实施方案，在本发明中，将小鼠的胰岛细胞植入小鼠内的方法为使用胰岛素针头将细胞植入小鼠眼房内，需说明的是，本领域已知的任何能进行胰岛细胞移植的方法都适用于本发明。
根据本发明的具体实施方案，检测所述红色荧光的发光强度的方法包括，借助双光子显微镜对复合纳米粒子标记的胰岛素的发光情况进行拍照观察。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明实施例1中的制备得到的UCNPs-PEI示意图；
图2显示了本发明实施例1中的复合纳米粒子检测胰岛素时的检测原理图；
图3显示了本发明实施例2中通过双光子显微镜观察的复合纳米材料与体外胰岛细胞的结合结果图；
图4显示了本发明实施例3中通过双光子显微镜观察的包含复合纳米粒子的胰岛细胞移植进小鼠体内，检测到的胰岛素浓度结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“上转换纳米粒子”(UCNP)是具有光子上转换功能的纳米级颗粒（直径1-100 nm）。在光子上转换中，两个或多个相对低能量的入射光子被吸收并转换成一个较高能量的发射光子。一般来说，吸收发生在电磁波谱的红外线区域，发射发生在可见光或紫外线区域。UCNP通常由掺杂有稀土基镧系元素或锕系元素的过渡金属组成，具有高细胞摄取效率和高光学穿透能力，使其成为体内生物成像、生物传感和纳米医学应用的理想选择。
本文中，所述NaYF4:Yb3+/Er3+@NaYF4是指Yb3+和Er3+共掺杂NaYF4的核壳结构上转换纳米粒子。在一些实施方案中，本发明提出了一种上转换纳米粒子，包括：核层，所述核层包括NaYF4:Yb3+/Er3+；以及壳层，所述壳层设置在所述核层的外表面，所述壳层包括NaYF4:Yb3 +/Er3+@NaYF4。六方相NaYF4具有良好的热稳定性和化学稳定性。其中稀土离子Yb3+/Er3+是通过取代NaYF4中Y3+的位置，从而进入基质主晶格。因此，在XRD衍射图样中是纯的NaYF4六方相，而没有其他杂峰出现。另外，六方相NaYF4具有较低的声子能量，因而具有较高的上转换效率，在980nm近红外光照射下可发出红色荧光，当所述可见光波长为535nm~550nm时出现红色荧光发射峰，所述上转换纳米粒子在红光区域的发射峰为541 nm；其中荧光强度比、测温灵敏度较高，能减少周围环境的影响、提高检测灵敏度，且能稳定、有效的利用荧光强度得到胰岛素浓度。
在一些具体实施方案中，所述核层的粒径为25nm。
在一些具体实施方案中，所述核层的粒径为35nm。
在一些具体实施方案中，所述Y3+是以YCl3·6H2O的形式提供的，所述Yb3+是以YbCl3·6H2O的形式提供的，所述Er3+是以ErCl3·6H2O的形式提供的。
在一些具体实施方案中，所述核层中Y3+、Yb3+、Er3+的摩尔比为（78-82）：（16-20）：（1-2）。
在一些具体实施方案中，所述核层中Y3+、Yb3+、Er3+的摩尔比为40：9：1。所述核层中Yb3+、Er3+的掺杂浓度分别为16%~20%（摩尔浓度），1%~2%（摩尔浓度），所述核层中Yb3+、Er3+的掺杂浓度分别为18%和2%时，发光效果更好；所述壳层中不掺杂激活剂离子，包裹惰性壳层可以有效避免核中激活剂离子与溶剂的接触，从而降低纳米粒子的表面猝灭效应。
在一些实施方案中，本发明提供了一种制备所述复合纳米粒子的方法，包括：1）将所述上转换纳米粒子与环己烷、N，N-二甲基甲酰胺、四氟硼酸亚硝进行第一混合和第一离心处理，获得沉淀物；2）将所述沉淀物与含有聚乙烯亚胺的DMF进行第二混合和第二离心处理，以获得物质上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺；3）将胰岛素抗体与EDC、NHS进行第三混合处理，以获得活化的胰岛素抗体；4）将所述活化的胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺进行进行第四混合和第三离心处理，以获得上转换纳米粒子-抗体；5）将孟加拉红溴己酸与EDC、NHS进行第五混合处理，以获得活化的孟加拉红溴己酸；6）将孟加拉红溴己酸与所述上转换纳米粒子-抗体按照1:(7-20)的摩尔比进行第六混合和第四离心处理，以获得所述复合纳米粒子。本发明采用溶剂热制备纳米粒子的核壳结构，再通过配体交换加载PEI表面修饰剂，利用胺基羧基脱水缩合加载抗体Ab和猝灭剂孟加拉红溴己酸，在合适的距离内，孟加拉红溴己酸可有效猝灭上转换纳米粒子的荧光。
在一些具体实施方案中，所述孟加拉红溴己酸吸收峰为555nm。
在一些具体实施方案中，包括加载孟加拉红溴己酸的步骤：取250μg/mL的孟加拉红溴己酸 200μL，加入0.5mg/mL的EDC 200μL，0.5mg/mL的NHS 100μL，活化2h。将上述溶液超声1min，加入0.3mg/mL的BSA 200μL，孵育0.5h。将活化后的孟加拉红溴己酸加入上转换纳米粒子-Ab，孵育2h，离心得到UCNPs-Ab-RBHA并分散于100μL PBS。
在一些具体实施方案中，孟加拉红溴己酸由以下反应得到：取孟加拉红与溴己酸加入到丙酮和水的混合溶液加热到反应后，去除丙酮，然后在水和乙酸乙酯的混合溶液中萃取，即得孟加拉红溴己酸。需注意的是，根据本发明的技术启示，本领域技术人员能够在此基础上进行用量的筛选、温度等的选择，以期获得更高孟加拉红溴己酸的收率或者采用进一步纯化或其他处理方式以获得纯度更好的孟加拉红溴己酸。
在一些具体的实施方案中，所述孟加拉红溴己酸通过以下方法制备：取100mg孟加拉红与19.6mg 溴己酸加入到50mL丙酮和水的混合溶液（V丙酮：V水=7:3）加热到75℃，反应24h后，通过旋蒸去除丙酮，然后在水和乙酸乙酯的40mL混合溶液（V乙酸乙酯：V水=1:1）中萃取，再冻干得到孟加拉红溴己酸。
本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 复合纳米粒子的制备
本实施例展示了复合纳米粒子的制备方法，具体实验操作如下：
1、UCNPs（上转换纳米粒子）加载PEI（聚乙烯亚胺）制备UCNPs-PEI
在50mL离心管中加入3mL环己烷、5mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），称量四氟硼酸亚硝（NOBF4）100mg加入此离心管，取7.5mL分散有NaYF4:Yb3+/Er3+@ NaYF4的环己烷溶液加入并搅拌0.5h，离心去除上清，将沉淀分散于5mL溶有100mg PEI的DMF并搅拌24h，离心并水洗2次得到UCNPs-PEI(具体结构参见图1)，将其分散于20mL PBS溶液备用。
2、UCNPs-PEI加载Ab制备UCNPs-Ab
（1）在离心管中加入200μL EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺），100μLNHS（N-羟基琥珀酰亚胺）、56μL Ab（抗胰岛素抗体），搅拌2h以活化Ab。
（2）步骤（1）所得活化Ab后的溶液中再加入浓度为20mmol/L的UCNPs-PEI 200μL，即胰岛素抗体与加载有聚乙烯亚胺的上转换纳米粒子的质量比为7：500，共同孵育过夜。
（3）将步骤（2）所得溶液超声1min后，加入200μL 0.3mg/mL的BSA（牛血清白蛋白），孵育0.5h，得到UCNPs-Ab。
3、UCNPs-Ab加载猝灭剂
a.取一只离心管，加入200μL 0.5mg/mL的EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺），100μL 0.5mg/mL的NHS（N-羟基丁二酰亚胺），200μL 0.25mg/mL的RBHA（孟加拉红溴己酸），搅拌2h，活化孟加拉红溴己酸。
b.将活化的孟加拉红溴己酸加入离心管A，孵育2h，于10000r/min转速下离心10min，用PBS洗涤沉淀1次后，超声1min以获得复合纳米粒子UCNPs-Ab-RBHA，将得到的UCNPs-Ab-RBHA分散于100μL PBS溶液备用。
胰岛素的检测原理如2所示。
实施例2 纳米材料与胰岛素的体外结合
1.胰岛细胞的分离纯化和过夜培养
（1）WT小鼠为6-8周龄，雄性，C57/BL6。
（2）胰岛细胞的分离纯化：小鼠脊椎脱臼处死后，打开腹腔，结扎胆总管，用32G针头注射器从肝胰壶腹部进针，将胶原酶P注入到胰管，灌注成功摘除胰腺后，37℃消化17min。用10%的FBS+Hanks溶液终止消化，洗涤三次。采用1077梯度液（Sigma，10771-100ML）对胰腺组织梯度离心(25℃，2400rpm，22min)。离心完后，在显微镜下手工挑选胰岛细胞。
（3）胰岛细胞过夜培养：挑选后的胰岛细胞，在24孔板，在37℃恒温培养箱下进行过夜培养（不超过24h），过夜培养基成分为：RPMI1640（Sigma R8758）、10%FBS（BI 04-001-1ACS）及1%P/S（Thermo 15140122）。
2.胰岛细胞的STZ（链脲佐菌素）处理
分离挑选后的胰岛细胞在STZ（0.5mM），37℃下处理30min，离心，去上清，用Hanks（Thermo 13150016）溶液洗涤离心去上清，再用过夜培养基进行过夜培养。
3.纳米材料标记胰岛细胞中的胰岛素
首先将100μL的实施例1制备的复合纳米粒子（超声震荡3s）混匀，留400μL的过夜培养的胰岛细胞+100μL的复合纳米粒子在常温避光的条件下，摇床板上摇晃2小时进行共孵育。中途每半小时吹打混匀一次，枪头需用1%的BSA润洗。去上清，随后将洗涤后的胰岛分为两组，一组置于含2mM葡萄糖溶液的缓冲液中；另一组置于含20mM葡萄糖溶液的缓冲液中。两组均孵育10min后，固定，封片，观察。
4.双光子显微镜下观察
加入Triton PBS（100μL）透化5-10min；PBS洗两遍，放置5min，去上清；加DAPI（100μL）染10min避光；加500μL的PBS洗两遍，（不用去DAPI），去上清；PBS再洗两次，去上清（上清留20μL）。准备载玻片和盖玻片；用BSA润洗枪头，20μL的枪将孔板中剩余的液体吸到载玻片上，将多余的液体往外拉，去掉液体，使类器官在载玻片上分散但稍集中；滴加封片剂（20μL）；盖上盖玻片，避光4℃下过夜；第二天在双光子显微镜下观察拍照。
双光子显微镜观察结果如图3所示，其中，红色代表分泌的胰岛素、蓝色代表胰岛细胞核，结果表明胰岛细胞在高浓度（20mM）葡萄糖溶液刺激下，分泌了更多的胰岛素，可观察到更多红光标记的胰岛素。
实施例3纳米材料体内示踪
（1）将所述纳米材料与体外培养的小鼠胰岛细胞共孵育，实现纳米材料与胰岛素的体外特异性结合，纳米材料进入小鼠胰岛细胞；
（2）将与胰岛素纳米材料共孵育后的胰岛细胞收集在注射器内，用腹腔注射麻醉药物的方式将小鼠麻醉，将小鼠眼球暴露在显微镜下，随后用胰岛素针头在角膜处戳开一个窗口，玻璃管沿着窗口进入到眼前房，并迅速按压活塞将胰岛注入到小鼠眼前房中。在胰岛前的气泡被冲出玻璃管之前停止。移植后给小鼠擦拭红霉素软膏，防止感染；
（3）小鼠禁食16小时后，按照与体重比为20%的比例腹腔注射葡萄糖溶液；
（4）将小鼠放在制作好的鼠架上，使其眼球以合适的角度进行充分的暴露，在双光子下观察小鼠眼球的纳米材料发光情况。
双光子显微镜观察结果如图4所示，注射葡萄糖溶液10min后，即可观察到眼球中的胰岛细胞开始分泌胰岛素，明场图表明小鼠胰岛细胞成功移植到眼球内并成功响应葡萄糖分泌胰岛素，因此可根据红光的标准强度测定胰岛素浓度。
本发明的复合纳米粒子能够特异性结合胰岛素，可以有效地对不同液体环境中存在的胰岛素进行有效检测，且在双光子显微镜的激光照射下，在培养具有胰岛素分泌功能的类器官中，可以实现类器官明亮的荧光成像，对类器官细胞内的胰岛素进行动态的可视化检测。利用本发明的方法，可以提前预知同批次的胰岛细胞移植技术成功的概率，可以作为胰岛细胞移植的伴随诊断法。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (34)
1.一种复合纳米粒子，其特征在于，包括：上转换纳米粒子、胰岛素抗体和猝灭剂，
其中，所述胰岛素抗体搭载于所述上转换纳米粒子与所述猝灭剂之间。
2.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述复合纳米粒子进一步包括聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求2所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述聚乙烯亚胺附着于所述上转换纳米粒子的外表面，所述胰岛素抗体与所述聚乙烯亚胺共价相连。
4.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂通过共价键与所述胰岛素抗体连接。
5.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂能猝灭所述上转换纳米粒子发出的光。
6.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述猝灭剂包括孟加拉红溴己酸、黑洞猝灭剂-2、TQ3琥珀酰亚胺酯中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述上转换纳米粒子包括核层、壳层，所述壳层包裹所述核层。
8.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层包括NaYF4:Yb3+/Er3+，所述壳层包括NaYF4。
9.根据权利要求8所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层中Y3+、Yb3+、Er3+的摩尔比为（78-82）：（16-20）：（1-2）。
10.根据权利要求8所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层中Y3+、Yb3+、Er3+的摩尔比为40：9：1。
11.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述核层的粒径为22-28nm。
12.根据权利要求7所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述壳层的粒径为32-38nm。
13.一种制备权利要求1-12任一项所述复合纳米粒子的方法，其特征在于，所述方法包括：
1）将所述上转换纳米粒子与权利要求2所述聚乙烯亚胺在溶液1中混合，获得上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺；
2）将所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺与活化后的胰岛素抗体共孵育，获得上转换纳米粒子-抗体；
3）将所述上转换纳米粒子-抗体与活化后的猝灭剂共孵育，获得结构为上转换纳米粒子-抗体-猝灭剂的复合纳米粒子，
其中，
所述溶液1包括选自环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、四氟硼酸亚硝中的至少之一。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤2）中，活化所述胰岛素抗体的方法包括：将所述胰岛素抗体与交联剂1混合孵育。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述交联剂1选自1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的至少之一。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3）中，活化所述猝灭剂的方法包括：将所述猝灭剂与交联剂2混合孵育。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述交联剂2选自1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺中的至少之一。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺在所述共孵育的体系中的摩尔比为（5-8）：（400-600）。
19.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述胰岛素抗体与所述上转换纳米粒子-聚乙烯亚胺在所述共孵育的体系中的摩尔比为（6.5-7.5）：（450-550）。
20.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述猝灭剂与所述上转换纳米粒子-抗体在共孵育体系中的摩尔比为1：（7-20）。
21.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述猝灭剂与所述上转换纳米粒子-抗体在共孵育体系中的摩尔比为1：（10-18）。
22.权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子在检测胰岛素和/或监测胰岛素分泌状况的试剂盒中的应用。
23.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子，所述试剂盒用于检测胰岛素和/或监测胰岛素分泌状况。
24.权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子在检测和/或监测具有胰岛素分泌功能的类器官中的应用。
25.一种检测胰岛素的方法，其特征在于，包括：
a.将待测样本与权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子混合，获得混合待测样本；
b.用激发光激发所述混合待测样本。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括具有胰岛素分泌功能的类器官样本、组织样本或细胞样本。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述激发光的波长为950-1000nm。
28.一种监测胰岛素分泌状况的方法，其特征在于，包括：
A.将权利要求1-12任一项所述的复合纳米粒子与体外胰岛细胞共孵育；
B.将步骤A中获得的共孵育后的胰岛细胞移植进受施体中；
C.饥饿处理受施体后，对受施体补充营养物质；
D.用激发光激发所述受施体移植胰岛细胞的移植部位；
E.基于红色荧光的发光强度，确定所述受施体的胰岛素浓度。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤A中，共孵育之前，用链脲佐菌素处理所述体外胰岛细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述体外胰岛细胞源自鼠源胰岛细胞或灵长目源胰岛细胞。
31.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述受施体包括小鼠、羊、骆驼、马、猴中的任意之一。
32.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述补充营养物质的方法包括注射葡萄糖、喂食可代谢为糖类的食品。
33.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤D中，所述移植部位包括眼部、腹部中的任意之一。
34.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤D中，所述激发光的波长为950-1000nm。
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| HANIE KAVAND ET AL.: "3D-Printed Biohybrid Microstructures Enable Transplantation and Vascularization of Microtissues in the Anterior Chamber of the Eye", ADVANCED MATERIALS, vol. 36, no. 1, 10 October 2023 (2023-10-10), pages 1, XP072562439, DOI: 10.1002/adma.202306686 * |
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