CN117883421A - 柠檬醛在制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂中的医药用途 - Google Patents
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Abstract
产气荚膜梭菌IV型菌毛是研发抗产气荚膜梭菌感染药物的重要潜在靶标，研究发现产气荚膜梭菌菌毛抑制剂的制备对于产气荚膜梭菌的防控有广泛的研究前景。本发明涉及柠檬醛在制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂中的医药用途，并通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、最小抑菌浓度测定试验、生物被膜形成抑制试验、实时荧光定量PCR、细胞粘附抑制试验等验证柠檬醛能够在不抑制细菌生长的情况下，有效抑制细菌菌毛介导的滑动，进而针对性地抑制产气荚膜梭菌IV型菌毛的生物学功能，减弱细菌与宿主细胞的黏附、定植能力，从而降低产气荚膜梭菌的感染能力。这一策略有望成为治疗产气荚膜梭菌感染的有效方法。柠檬醛是从山苍子油中分离得到的一类单萜化合物，表现出多种药理活性并且具有低成本、无耐药性的特点，为防治产气荚膜梭菌感染提供了潜在的天然化合物选择，并为开发产气荚膜梭菌抗感染药物提供了新的医用途径，有广阔的应用前景，对于新药开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及柠檬醛在制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂中的医药用途，属于医学制药技术领域。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是革兰氏阳性、产芽胞的厌氧性杆菌，是一种广泛分布于人类和动物肠道的菌种，具有在机体组织内分解产生糖类物质的能力，并产生大量气体，从而导致组织损伤，并引起人类和动物多种疾病的发生，主要引起人类患上气性坏疽和食物中毒等疾病。近年来，产气荚膜梭菌已成为危害我国家禽业发展的主要病原菌，能引起禽类坏死性肠炎，继而导致家禽产业经济损失严重。产气荚膜梭菌借助于IV型菌毛系统(Type IV Pili，TFP)功能直接附着在宿主肠道细胞上，在机体致病环节中起重要作用。菌体利用细菌细胞膜上的IV型菌毛(TFP)作为运动器官，在宿主细胞的定植和入侵、生物膜形成以及滑动运动等过程中发挥致病力，引发产气荚膜梭菌感染。因此，可将IV型菌毛系统视为抗产气荚膜梭菌感染药物的潜在研究和开发靶点，探究开发产气荚膜梭菌菌毛抑制剂对于预防和控制产气荚膜梭菌感染有重要意义。本项发现首次揭示了柠檬醛作为产气荚膜梭菌菌毛抑制剂的潜能，可成为有效对抗产气荚膜梭菌引起的疾病的潜在药物。
柠檬醛是一种单萜化合物，具有易挥发的特性，当与空气接触时，会迅速氧化呈现黄色。在水中不溶解，可溶解于乙醇，作为山苍子油的重要成分，含量约达65-80％，具有多种现代药理作用，包括但不限于平喘、抗过敏、抗血栓、抗心律失常以及抗菌作用，且广泛应用于香料制品、食品添加剂和医药制药等多个领域。近年来，大量文献对柠檬醛的药理活性进行了报道。迄今为止，无论是国内还是国外，尚未发现有关于柠檬醛在抑制产气荚膜梭菌滑动运动功能以及制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂的相关研究。
发明内容
本发明首次探索了柠檬醛在制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂方面的医药应用潜力，为预防和治疗产气荚膜梭菌感染提供了新的研究思路并发现了一种潜在的天然化合物。
本发明通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、测定最小抑菌浓度、生长曲线测定试验、生物被膜形成抑制试验、实时荧光定量PCR、产气荚膜梭菌粘附至Caco-2细胞试验等验证柠檬醛能够抑制细菌菌毛介导的滑动运动和粘附定植过程，从而降低产气荚膜梭菌的感染能力，试验所用产气荚膜梭菌为ATCC13124。
本发明所述柠檬醛分子式为C10H16O7，分子量为152.23，密度为0.889g/cm3。柠檬醛的分子结构如下：
本发明的积极效果在于：
在柠檬醛的医用用途上，为制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂方面提供了创新性，公开了其抑制菌毛介导的滑动能力，从而降低产气荚膜梭菌的感染能力。这为治疗产气荚膜梭菌感染的药物研发提供了新的选择。
附图说明
图1：柠檬醛抑制产气荚膜梭菌ATCC13124在半固体BHI平板上的滑动运动；
图2：柠檬醛对产气荚膜梭菌ATCC13124滑动运动直径的测量结果；
图3：柠檬醛在有效浓度范围内不抑制产气荚膜梭菌ATCC13124的生长；
图4：柠檬醛对产气荚膜梭菌ATCC13124的MIC值大于256μg/mL；
图5：柠檬醛抑制产气荚膜梭菌ATCC13124生物被膜的形成；
图6：柠檬醛在有效浓度范围内抑制产气荚膜梭菌ATCC13124菌毛基因的转录；
图7：柠檬醛能有效抑制产气荚膜梭菌对Caco-2细胞的粘附定植。
具体实施方式
通过下面的实例，通过具体举例对本发明进行描述，并强调本发明不受任何方式限制。在不违背本发明技术解决方案的基础上，对本发明进行的任何改动或修改，只要是本领域普通技术人员容易实现的，都将落入本发明权利要求的范围内。
实施例1
柠檬醛可以被用作产气荚膜梭菌菌毛抑制剂开展应用于药学上可接受的任何形式的药物载体。
实施例2
柠檬醛可用作制备治疗感染性疾病的药物的成分，作为产气荚膜梭菌菌毛抑制剂的一种选择，具有开发针对产气荚膜梭菌感染的新药物的潜力。
实施例3
柠檬醛作为制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂的选择，为研究针对产气荚膜梭菌感染的药物提供了新参考，可作为治疗产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的新型药物。
试验例1
产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验
配制含有0.4％琼脂的BHI固体培养基，121℃高压灭菌降温后，准确量取10mL培养基，倒入细菌培养皿内，添加不同浓度的柠檬醛，使终浓度为8、16、32和64μg/mL，凝固后制成软琼脂平板。同时设置阳性对照组，其中加入相同体积的DMSO溶剂。将过夜培养的产气荚膜梭菌ATCC13124离心后弃去上清，使用无菌的PBS缓冲液进行稀释，将其光密度(OD600nm)调整至0.5。取5μL的菌液滴加到已经添加柠檬醛的BHI软琼脂平板中央。将平板放置在恒温培养箱(37℃)中厌氧培养24h。之后进行拍照观察，测量细菌向四周运动的菌落范围大小。菌落扩展的范围越大，说明产气荚膜梭菌的滑动能力越强；相反，菌落扩展范围越小，则意味着滑动能力越弱。
结果表明：与未加入柠檬醛处理的对照组相比，不同浓度的柠檬醛(8、16、32、64μg/mL)处理后显著地抑制了产气荚膜梭菌在0.4％ BHI软琼脂固体平板上的滑动能力。(见附图1-附图2)。
试验例2
产气荚膜梭菌ATCC13124生长曲线
从固体培养基平板上挑取单个菌落，将其转移到BHI培养基中进行过夜培养。第二天，将菌液转移到100mL的BHI肉汤液体培养基中，继续培养直至光密度(OD600nm)达到0.3。培养后的菌液等量分装到5个无菌锥形瓶中，并加入柠檬醛，使终浓度为0、8、16、32、64μg/mL的5个不同浓度。加入药物后充分混匀培养液，37℃静置厌氧培养，每隔1h测定菌液在OD600nm处的吸光值，直至细菌生长达到平台期，记录各处理组在相应时间点的吸光值，绘制出生长曲线。
结果表明：有效浓度范围内(8-64μg/mL)的柠檬醛对产气荚膜梭菌ATCC13124的生长没有影响(见附图3)。
试验例3
柠檬醛对产气荚膜梭菌ATCC13124最小抑菌浓度(Minimal inhibitionconcentration,MIC)值测定
使用美国临床和实验室标准协会(Clinical And Laboratory StandardsInstitute，CLSI)公布的标准琼脂稀释法，测定柠檬醛对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度(Minimal inhibit concentration，MIC)，这是一种厌氧菌的测定方法，用于确定柠檬醛在抑制产气荚膜梭菌生长中的最小有效浓度。制备含有柠檬醛的布氏血琼脂平板，精确称量布鲁氏琼脂固体粉末，加入蒸馏水溶解，添加5μg/mL血红素和1μg/mL维生素K1。培养基在121℃高压灭菌15min后，冷却至40℃，添加5％v/v的脱纤维羊血，混合均匀后倒入细菌培养皿，加入柠檬醛使终浓度为4、8、16、32、64、128、256μg/mL。过夜培养的产气荚膜梭菌ATCC13124调节OD600nm为0.1，确定菌体接种量为1×105CFU后，将5μL重悬的产气荚膜梭菌菌液垂直于平板滴至平板中央。另选择含0μg/mL柠檬醛的布氏血琼脂平板，分别接种5μL菌液和5μL高压灭菌的BHI液体培养基作为阳性对照组和阴性对照组。将全部布氏血琼脂平板水平置于厌氧培养罐中，37℃静置培养48h。
结果表明：256μg/mL的柠檬醛不会对ATCC13124在血琼脂平板上的生长产生影响，且柠檬醛对产气荚膜梭菌ATCC13124的MIC值大于256μg/mL。(见附图4)
试验例4
柠檬醛对产气荚膜梭菌ATCC13124生物被膜形成的抑制
将产气荚膜梭菌接种于2mL BHI液体培养基中，37℃温箱内厌氧培养过夜，8000rpm离心5min弃取上清，用高压灭菌后的PBS缓冲液洗涤3次，用TSB液体培养基重悬菌体并调节菌悬液的OD600nm为0.1，吸取每孔400μL菌悬液于24孔板内，加入柠檬醛并使其终浓度分别为8、16、32、64μg/mL，混合均匀，另设DMSO对照组和TSB培养基对照组，每组3个重复，将24孔板放于30℃温箱内厌氧培养72h。培养结束后弃掉培养基上清，用高压灭菌后的PBS缓冲液洗涤2次，37℃烘干1h，每孔加入400μL 1％结晶紫染液，室温静置染色30min，弃去结晶紫染液，用PBS洗两次。每孔加入33％乙酸，吹打混匀后每孔取100μL分别加入96孔板，使用酶标仪测定570nm处的吸光值，将未加柠檬醛组设为100％，根据结晶紫吸光值计算生物被膜形成率。
结果表明：柠檬醛在有效浓度范围内(8-64μg/mL)，能显著抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成(见附图5)。
试验例5
柠檬醛对产气荚膜梭菌ATCC13124菌毛调控基因的影响
产气荚膜梭菌ATCC13124接种于2mL液体BHI培养基中培养过夜，第二天，按照1:20的比例将菌液转移至新鲜BHI培养基，与此同时加入柠檬醛使药物终浓度变为16、32μg/mL。于37℃温箱厌氧培养菌液5h后12000rpm离心5min收集菌体，使用Trizol法进行细菌RNA的提取，并采用一步法合成cDNA，具体步骤按照相关试剂盒的使用说明进行cDNA合成。通过实时荧光定量PCR试剂盒对菌毛基因pilM、pilN进行实时定量分析，试验过程中选择产气荚膜梭菌16S rRNA作为内参，采用2-△△Ct法来计算结果。
结果表明：柠檬醛在有效浓度范围内(16、32μg/ml)，对产气荚膜梭菌菌毛基因的合成有显著的抑制作用(见附图6)。
试验例6
柠檬醛对产气荚膜梭菌粘附至Caco-2细胞的抑制作用
用0.25％胰酶将Caco-2细胞消化后，用不含血清及抗生素的DMEM培养基将细胞浓度调整到3×105cells/mL，接种Caco-2细胞于24孔板，每孔加入1mL细胞悬液，在37℃和5％CO2培养箱内对细胞进行过夜培养。2mL液体BHI培养基内接种产气荚膜梭菌后，37℃厌氧培养12h，分别加入不同浓度柠檬醛(8、16、32和64_μg/mL)，继续厌氧培养5h，并设置等体积DMSO对照组，培养完毕后离心菌液弃去上清，用不含血清及抗生素的DMEM培养基调整菌悬液浓度至6×107CFUs/mL，移去24孔板中的细胞培养基，加入DMEM混合菌悬液，以MOI＝200感染细胞。在37℃和5％CO2培养箱内培养1h后吸去孔内液体，用高压灭菌的PBS洗去未粘附至细胞的细菌，每孔洗3次，加入1mL含0.2％的TritonX-100，反复吹打20次使细胞裂解，并置于水平摇床震荡5min，将裂解液转移至离心管，倍比稀释涂布于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂平板(用于产气荚膜梭菌的平板计数)，将平板37℃过夜厌氧培养，次日计数菌落。
结果表明：不同浓度柠檬醛(8-64μg/mL)处理后能够显著抑制产气荚膜梭菌ATCC13124对Caco-2细胞的粘附能力(见附图7)。
Claims (4)
1.柠檬醛在制备产气荚膜梭菌菌毛抑制剂中的医药用途。
2.如权利要求1所述的应用，所述的医药用途具有以下特征，即柠檬醛在生物学上抑制了产气荚膜梭菌菌毛介导的细菌滑动运动。
3.如权利要求1所述的应用，所述的产气荚膜梭菌菌毛抑制剂具有以下特征，即能够有效抑制产气荚膜梭菌菌毛介导的细菌运动性，减弱细菌与宿主细胞黏附、附着的能力，从而降低产气荚膜梭菌的感染能力。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产气荚膜梭菌菌毛抑制剂柠檬醛在制备治疗产气荚膜梭菌感染的药物中具有应用价值。
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