CN117867175A - 一种边界病病毒TaqMan荧光定量检测试剂和试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种边界病病毒TaqMan荧光定量检测试剂和试剂盒及检测方法，属于病原检测技术领域。本发明提供了一种特异性检测边界病病毒BDV的引物探针组，所述引物探针组可特异并灵敏检测BDV。本发明还基于所述引物探针组设计了一步法荧光定量RT‑PCR试剂盒，所述试剂盒检测结果特异性好，敏感性高，检测快速简便，反转录和PCR在一个反应管进行，减少污染机会；解决了现有BDV检测方法耗时费力、特异性敏感性差、成本高等的问题，可用于兽用生物制品及原辅材料中BDV的污染检测，对于BDV的检测、兽用生物制品质量控制等具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种边界病病毒TaqMan荧光定量检测试剂和试剂盒及检测方法。
背景技术
边界病(BorderDisease，BD)临床表现为母羊生殖障碍，羔羊畸形、震颤、多毛等。边界病通常水平传播和垂直传播，羔羊可能发生持续性感染，BDV还可感染牛、猪及其他种类的反刍动物，目前尚无有效的疫苗用于边界病的防控。BDV在绵羊、牛和猪的种间传播经常发生，对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的根除产生一定的影响，也给BD的诊断带来了困难。
BDV与牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)，猪瘟病毒(CSFV)同属于黄病毒科瘟病毒属成员。BDV是一种球形、有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约为12300bp，包括5’和3’末端2个UTR和1个ORF，编码4种结构蛋白(衣壳蛋白C和包膜糖蛋白Erns、E1和E2)及7种非结构蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中5’-UTR是BDV基因组中高度保守区域，常用于BDV分子生物学检测靶基因。
由于BDV和CSFV、BVDV有类似的临床症状、且瘟病毒属病毒之间又存在血清交叉反应，边界病的诊断通常采用多种检测技术相结合的方式。边界病的实验室诊断主要包括病毒分离鉴定、核酸检测(RT-PCR)和血清学检测技术(病毒中和试验、ELISA、交叉血清中和试验)。病毒分离鉴定方法是诊断该病的金标准，但费时耗力，不适合大规模流行病学调查；病毒中和试验操作复杂检测周期长，不适合大批量样品的检测；ELISA操作简单，适于大批量流行病学调查，但不能区分BVDV和BDV感染；交叉血清中和试验能区分BVDV和BDV的感染，但也存在费时耗力的缺点。目前常用的RT-PCR方法，可大批量检测血液或组织中的BDV，
但常规RT-PCR扩增只可对特定基因进行扩增，容易污染和存在假阳性，且不能进行定量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种边界病病毒TaqMan荧光定量检测试剂和试剂盒及检测方法，可特异、敏感、快速、简便、定性甚至定量检测BDV，可应用于BDV的检测和兽用生物制品的质量控制。
本发明提供了一种特异性检测边界病病毒BDV的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针。
优选的，所述探针的5’端还包含有荧光基团，3’端还包含有淬灭基团。
优选的，所述荧光基团包括FAM、CY3或TET；
所述淬灭基团包括MGB、TAMARA或BHQ。
本发明还提供了一种特异性检测边界病病毒BDV的试剂盒，包括上述引物探针组和荧光定量RT-PCR检测试剂。
优选的，所述荧光定量RT-PCR检测试剂包括：One Step PrimeScript III RT-PCRMix、阳性标准品、阳性对照品、阴性对照品和无酶水。
优选的，所述阳性标准品包括含核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物扩增的BDV 5’端UTR基因目的片段的重组载体；
所述阳性对照品为BDV的RNA提取物；
所述阴性对照品为无酶水的RNA提取物。
本发明还提供了一种非诊疗目的的定性检测边界病病毒BDV的方法，包括以下步骤：将样品RNA与上述试剂盒中One Step PrimeScript III RT-PCR Mix、引物探针组和无酶水构建荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，检测到荧光信号时表示存在边界病病毒BDV。
本发明还提供了一种非诊疗目的的定量检测边界病病毒BDV的方法，包括以下步骤：(1)将上述试剂盒中的阳性标准品倍比稀释后作为阳性模板，与所述试剂盒中的OneStep PrimeScript III RT-PCR Mix、引物探针组和无酶水配制荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，建立荧光定量RT-PCR检测方法的标准曲线；
(2)以样品RNA为模板，与所述试剂盒中的One Step PrimeScript III RT-PCRMix、引物探针组和无酶水配制荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，根据(1)中建立的标准曲线对待测样品中的病毒拷贝数进行定量。
优选的，荧光定量RT-PCR反应体系以25μL计，包含：One Step PrimeScript IIIRT-PCR Mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，10μmol/L探针0.5μL，病毒RNA2μL和余量的ddH2O。
优选的，所述荧光定量RT-PCR反应的程序包括：52℃5min，95℃10sec；95℃5sec，53.0℃30sec，40个循环；在53.0℃延伸时收集荧光信号。
有益效果：本发明提供了一种特异性检测边界病病毒BDV的引物探针组，所述引物探针组可特异并灵敏检测BDV。本发明还基于所述引物探针组设计了一步法荧光定量RT-PCR试剂盒，所述试剂盒检测结果特异性好，BDV扩增曲线良好，其他兽用病毒生物制品、毒株及原辅材料未出现特异性扩增曲线；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品和BDV病毒，检出限度分别为10copies、1TCID50；检测快速简便，反转录和PCR在一个反应管进行，减少污染机会；解决了现有BDV检测方法耗时费力、特异性敏感性差、成本高等的问题，可用于兽用生物制品及原辅材料中BDV的污染检测，对于BDV的检测、兽用生物制品质量控制等具有重要意义。
附图说明
图1为边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法敏感性检测结果图(A)及标准曲线(B)，其中A：1、2、3、4、5、6、7、8、9分别为1×109copies/μL到1×101copies/μL 10倍系列稀释阳性标准品的扩增曲线；
图2为边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性检测，图中：1代表BDV的扩增曲线；2代表其他兽用生物制品、毒株及原辅材料的扩增曲线；
图3为BDV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法敏感性检测结果图，图中：1、2、3、4分别代表1000、100、10、1TCID50 BDV毒株的扩增曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种特异性检测边界病病毒BDV的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针。
在本发明中，所述引物探针组的序列如下所示：
BDV-F(SEQ ID No.1)：5’-CCATACCCGTAGTAGGACTA-3’
BDV-R(SEQ ID No.2)：5’-GTGTCGAACTACTGACGACT-3’
BDV-probe(SEQ ID No.3)：5’-CCATCGTGGTGAGATCCC-3’
本发明所述探针的5’端还包含有荧光基团，3’端还包含有淬灭基团，所述荧光基团优选包括FAM、CY3或TET；所述淬灭基团优选包括MGB、TAMARA或BHQ。本发明实施例中以FAM和MGB为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了一种特异性检测边界病病毒BDV的试剂盒，包括上述引物探针组和荧光定量RT-PCR检测试剂。
本发明所述荧光定量RT-PCR检测试剂优选包括：One Step PrimeScript III RT-PCR Mix(2×)、阳性标准品、阳性对照品、阴性对照品和无酶水，所述阳性标准品优选包括含核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物扩增的BDV 5’端UTR基因目的片段的重组载体，实施例中优选以所述的引物扩增的BDV5’端UTR基因目的片段连接到pEASY-blunt Simple Cloning载体得到。扩增的BDV 5’端UTR基因目的片段序列如下(SEQ ID No.4)：CCATGCCCGTAGTAGGACTAGCAGACGGGAGGACTAGCCATCGTGGTGAG ATCCCTGAGCAGTCTAAATCCTGAGTACAGGATAGTCGTCAGTAGTTCAAC AC。
本发明所述阳性对照品优选为BDV的RNA提取物；所述阴性对照品优选为无酶水的RNA提取物。
本发明所述试剂盒优选为一步法荧光定量RT-PCR试剂盒，反转录和PCR在一个反应管进行，减少污染机会，且可完成定性检测，还可以根据标准曲线完成定量检测。
本发明还提供了一种非诊疗目的的定性检测边界病病毒BDV的方法，包括以下步骤：将样品RNA与上述试剂盒中One Step PrimeScript III RT-PCR Mix、引物探针组和无酶水构建荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，检测到荧光信号时表示存在边界病病毒BDV。
本发明在进行定性检测时，只需要以样品的RNA为模板，与试剂盒中的One StepPrimeScript III RT-PCR Mix(2×)、引物探针组和无酶水构建荧光定量RT-PCR反应体系，所述体系以25μL计，优选包括：One Step PrimeScript III RT-PCR Mix(2×)12.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，10μmol/L探针0.5μL，病毒RNA2μL和余量的ddH2O。本发明所述荧光定量RT-PCR反应的程序，优选包括：52℃5min，95℃10sec；95℃5sec，53.0℃30sec，40个循环；在53.0℃延伸时收集荧光信号。在本发明实施例中优选设置报告基因为FAM，当能检测到荧光时，认定样本中含有BDV。
本发明还提供了一种非诊疗目的的定量检测边界病病毒BDV的方法，包括以下步骤：(1)将上述试剂盒中的阳性标准品倍比稀释后作为阳性模板，与所述试剂盒中的OneStep PrimeScript III RT-PCR Mix、引物探针组和无酶水配制荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，建立荧光定量RT-PCR检测方法的标准曲线；
(2)以样品RNA为模板，与所述试剂盒中的One Step PrimeScript III RT-PCRMix、引物探针组和无酶水配制荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，根据(1)中建立的标准曲线对待测样品中的病毒拷贝数进行定量。
本发明在构建标准曲线时以及进行具体检测时所设置的反应体系和反应程序优选均与上述相同，在此不再赘述。本发明所述标准曲线以拷贝数为横坐标，以循环阈值为纵坐标构建标准曲线，所述标准曲线优选为Y＝-3.286X+37.9，R2＝0.998。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种边界病病毒TaqMan荧光定量检测试剂和试剂盒及检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、针对BDV 5’端UTR基因保守区设计特异性引物和探针
从GenBank上下载BDV毒株的参考序列，根据序列比对结果，针对BDV 5’端UTR基因的高度保守片段，设计一对特异性引物(BDV-F/BDV-R)和相应的TaqMan探针。将探针的5’端以报告荧光基团FAM标记，3’端以淬灭基因MGB标记。
BDV-F：5’-CCATACCCGTAGTAGGACTA-3’
BDV-R：5’-GTGTCGAACTACTGACGACT-3’
BDV-probe：5’-FAM-CCATCGTGGTGAGATCCC-MGB-3’
2、边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与条件优化
按照体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒(爱思进，货号AP-MN-BF-VNA-50G)说明书，提取BDV的基因组作为模板，固定模板浓度，综合考虑样品Ct值、荧光强度，采用棋盘法确定最佳引物浓度、探针浓度和反应条件。
25μL反应体系：One Step PrimeScript III RT-PCR Mix(2×)12.5μL、上游引物(10μM)0.5μL、下游引物(10μM)0.5μL、探针(10μM)0.5μL、模板2μL和无酶水9μL。
反应条件：52℃5min(反转录)，95℃10sec(预变性)；95℃5sec，53.0℃30sec，40个循环(PCR扩增)；在53.0℃延伸时收集荧光信号，报告基因设置为FAM。
3、边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线的建立
以BDV的基因组为模板，用本发明所述引物进行普通RT-PCR扩增目的片段，扩增体系及反应条件如下：
50μL扩增体系：One-Step Reaction mix(2×)25.0μL、酶2μL、上游引物(10μM)2μL、下游引物(10μM)2μL、模板5μL、无酶水14μL
反应条件：50℃30min(反转录)；94℃3min(预变性)；94℃30sec(变性)，52.9℃30sec(退火)，72℃30sec，35个循环(PCR扩增)；72℃终末延伸10min。
用快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(百泰克，货号DP1722)进行RT-PCR产物的回收和纯化，将回收产物连接至pEASY-blunt Simple Cloning载体(北京全式金生物技术有限公司，Cat#：CB111-02)，转化Trans-T1感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选、PCR鉴定和测序，获得阳性克隆，按照质粒小提试剂盒(天根生物，货号DP103)提取质粒作为阳性标准品。
根据公式N＝(质粒浓度ng/μL×10-9×6.02×1023)/(碱基数bp×660)，计算重组质粒的拷贝数。将重组质粒从1×109copies/μL到1×10copies/μL 10倍系列稀释后作为阳性标准品，建立荧光定量RT-PCR检测方法的标准曲线。标准曲线如图1所示：扩增效率E＝101.5％，R2＝0.998，标准曲线方程Y＝-3.286X+37.9。
3、边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性检测
(1)样品处理
1)样品类型：BDV/01株、猪瘟病毒活疫苗(兔源)、猪瘟活疫苗(细胞源)、高致病性猪繁殖与呼吸综合症活疫苗(TJM-F92株)、猪繁殖与呼吸综合症活疫苗(CH-1R株)、伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(SCJY-1株+SCSZ-1株)、山羊痘活疫苗(AV41株)、小反刍兽疫活疫苗(Clone9株)、鸡新城疫活疫苗(LaSota株)、鸡新城疫活疫苗(Clone30株)、鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)、鸡传染性法氏囊病活疫苗(NF8株)、鸡传染性法氏囊病活疫苗(D-22株)、鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗(FC-126株)、鸡传染性喉气管炎活疫苗(K317株)、鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗、鸭瘟活疫苗、牛病毒性腹泻病毒NADL株、牛病毒性腹泻病毒BA株、猪圆环2型病毒HB株、猪圆环2型病毒NJ株、猪流感病毒H1N1LN株、猪流感病毒H3N2 HLJ株、胰酶、牛血清白蛋白、蔗糖、脱脂牛奶、明胶、海藻酸钠。
表2毒株信息表
BDV/01株由中国兽医药品监察所鉴定和保存。
以上活疫苗来自商品化疫苗，购自广东永顺生物制药有限公司、江苏南农高科技股份有限公司、哈尔滨维科生物技术有限公司、普莱柯生物工程股份有限公司、青岛易邦生物工程有限公司等单位。无货号
以上病毒株来自中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心(请见中国兽医药品监察所、中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心编著，《中国兽医菌种目录》第一版，中英文合订本，1992年，中国科学技术出版社，139页)；猪圆环2型病毒HB株、猪圆环2型病毒NJ株来自中国兽医药品监察所(郎洪武,刘丹,陈晓春等，《猪圆环病毒2型田间分离株的全基因组克隆与基因亚型分析》，《中国兽药杂志》2014年11期1-4)；猪传染性胃肠炎SCJY-1株来自四川农业大学(颜其贵,欧洋,郭万柱等，《猪传染性胃肠炎病毒SC-1株的分离与基因7的克隆分析》，《中国兽医学报》2007年05期613-616)；猪流感病毒H1N1和H3N2来自青岛农业大学(王新,徐守振,刘均华等，《猪流感(H1N1+H3N2)二价油乳剂灭活疫苗的研制》，《畜牧与兽医》2013年11期11-16)；
2)样品处理：根据瓶签装量，非禽用活疫苗用灭菌PBS稀释为不低于10头份/ml，禽用活疫苗稀释为不低于100羽份/ml，病毒株直接用病毒液原液；新生牛血清、胎牛血清、DMEM培养基、MEM培养基、199培养基直接取原液，胰酶、牛血清白蛋白、蔗糖、脱脂牛奶均用灭菌PBS配制为10％(W/V)溶液，明胶和海藻酸钠均用灭菌PBS配制为5％(W/V)溶液。然后将上述溶液3000r/min4化离心10min，取上清备用。
(2)分别取200μL上述样品，按照体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒(爱思进，货号AP-MN-BF-VNA-50G)说明书提取病毒基因组作为模板，用建立的边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法进行检测，除BDV外，其他样品均未检测到特异性
扩增信号(图2)，所建立的检测方法具有良好的特异性。
4、边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法敏感性检测
(1)将阳性标准品做1×109copies/μL到1×101copies/μL 10倍系列稀释后作为模板，用建立的边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法进行检测，所建立的方法其敏感性可达到10copies/μL(图1中A)，敏感性良好。
(2)将测定好病毒含量的BDV/01株分别10倍系列稀释后作为模板，用建立的边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法进行检测，所建立的方法其敏感性可达到1TCID50(图3)，敏感性良好。
5、边界病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法重复性检测
以1×108copies/μL到106copies/μL稀释的阳性标准品为模板，每个浓度的样品做3次重复，计算变异系数。分析所建立的荧光定量RT-PCR检测方法的可重复性。结果如表1所示，不同模板浓度其变异系数均小于1.5％，表明所建立的荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的稳定性。
表1BDV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法重复性检测
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种特异性检测边界病病毒BDV的引物探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQID No.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物和核苷酸序列如SEQID No.3所示的探针。
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，所述探针的5’端还包含有荧光基团，3’端还包含有淬灭基团。
3.根据权利要求2所述引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、CY3或TET；所述淬灭基团包括MGB、TAMARA或BHQ。
4.一种特异性检测边界病病毒BDV的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述引物探针组和荧光定量RT-PCR检测试剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR检测试剂包括：OneStep PrimeScript III RT-PCR Mix、阳性标准品、阳性对照品、阴性对照品和无酶水。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品包括含核苷酸序列如SEQID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物扩增的BDV 5’端UTR基因目的片段的重组载体；
所述阳性对照品为BDV的RNA提取物；
所述阴性对照品为无酶水的RNA提取物。
7.一种非诊疗目的的定性检测边界病病毒BDV的方法，其特征在于，包括以下步骤：将样品RNA与权利要求5所述试剂盒中One Step PrimeScript III RT-PCR Mix、引物探针组和无酶水构建荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，检测到荧光信号时表示存在边界病病毒BDV。
8.一种非诊疗目的的定量检测边界病病毒BDV的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求5或6所述试剂盒中的阳性标准品倍比稀释后作为阳性模板，与所述试剂盒中的One Step PrimeScript III RT-PCR Mix、引物探针组和无酶水配制荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，建立荧光定量RT-PCR检测方法的标准曲线；
(2)以样品RNA为模板，与所述试剂盒中的One Step PrimeScript III RT-PCR Mix、引物探针组和无酶水配制荧光定量RT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应，根据(1)中建立的标准曲线对待测样品中的病毒拷贝数进行定量。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，荧光定量RT-PCR反应体系以25μL计，包含：One Step PrimeScript III RT-PCR Mix 12.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，10μmol/L探针0.5μL，病毒RNA2μL和余量的ddH2O。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR反应的程序包括：52℃5min，95℃10sec；95℃5sec，53.0℃30sec，40个循环；在53.0℃延伸时收集荧光信号。
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