CN117867160A - 与不结球白菜叶片紫色基因相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子育种技术领域，涉及一种与不结球白菜叶片紫色基因相关的分子标记。本发明基于BSA群体定位的方法获得与不结球白菜叶片紫色紧密连锁的03染色体末端区域，并利用PARMS技术对定位区间内的SNP差异位点设计引物，开发位于3号染色体的31209409\31304070\31409624\31521617\31632032处的分子标记，以实现对分离群体单株的基因型进行精准鉴定的目的。本发明的分子标记及引物可简便、快速、高通量地应用于不结球白菜叶片紫色性状鉴定，加速不结球白菜叶色性状的改良进程。
Description
技术领域
本发明涉及生物遗传学领域，具体涉及分子育种技术领域，尤其涉及与不结球白菜叶片紫色基因相关的分子标记及其应用。
背景技术
不结球白菜(Brassica campestris ssp.Chinensis)是重要的十字花科叶菜类蔬菜作物，因其种质资源丰富、生长周期短、单位面积产量高、易栽培等特点，在我国大部分地区均可以周年栽培种植，占据蔬菜市场重要份额。作为不结球白菜的主要品种类型，紫色不结球白菜富含花青素，兼具观赏和食用保健功能，在设施栽培中运用越来越广泛。花青素是目前已知最强的自由基清除剂，清除自由基的能力是维生素C的20倍，维生素E的50倍。另外，花青素也可作为天然食用色素。因此，培育和推广紫色白菜具有十分重要的实用意义。
然而在紫色不结球白菜的杂交选育工作过程中，由于紫色为显性，绿色为隐形，杂合的植株呈现出紫色，这就导致单纯从颜色上很难分辨出紫色纯合与紫色杂合植株。例如：孙日飞等(2006)采用大白菜和紫红色芥菜种间杂交，获得了紫色白菜新种质，但是研究表明，大白菜紫红色性状遗传不符合孟德尔遗传规律。在群体分离选种时入选的杂合的植株，在子代将继续发生颜色的分离，导致育种年限拉长和选择效率降低。本申请在基因定位区间内开发的标记能高效鉴定杂交后代群体中紫色纯合和紫色杂合子代，成功运用于紫色不结球白菜分子辅助选择，缩短育种年限，提高了选择效率，为紫色不结球白菜乃至芸薹属紫色蔬菜的品种快速改良，提供了理论和数据支撑。目前关于大白菜紫色性状控制基因及遗传规律尚没有清晰的认识。
五引物扩增阻遏突变系统PARMS(Penta-primer amplification refractorymutation system)是一种结合突变扩增系统ARMS(Amplification refractory mutationsystem)的基因分型技术，在ARM-PCR基础上增加了两条由6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，FAM)和六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro fluorescein，HEX)标记的引物，通过不同的荧光信号来检测基因的多态性。PARMS具有准确性高、高通量等优点，是一种高效的SNP分型的方法。利用PARMS技术开发与控制叶片紫色性状的基因紧密连锁的分子标记具有重要的应用价值。
相较于在继代选育过程中通过育种人员的主观判断选择，采用先留后选的原则这一选育方法，随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择方法(Marker assistedselection，MAS)被越来越多地应用于育种环节，也因此，探究不结球白菜叶片颜色的分子标记所获得的结果成为白菜的分子育种筛选过程中重要的依据。
公开号为CN116004901A的中国专利申请公开了一种与普通白菜叶片紫色相关的KASP分子标记及其应用，通过QTL-seq技术以及遗传图谱定位发现了位于普通白菜3号染色体上与叶片紫色相关的主效QTL位点，开发了与位点紧密连锁的分子标记，通过对颜色未知普通白菜材料的种子或者苗期叶片提取DNA，结合本发明的KASP引物进行KASP分子标记分型试验，通过标记的分型结果就可以预测普通白菜的颜色。
根据现有的研究可知，白菜类作物紫色基因广泛分布在A02、A03、A07以及A09号染色体上。由于这类基因之间存在复杂的基因连锁机制，且在芸薹属蔬菜中的变种、亚种乃至不同材料间遗传机制也存在差别，属于芸薹属蔬菜的白菜类作物的紫色显色调控机制(或者说白菜类作物中花青素合成和调控的机制)复杂多样。目前，对于白菜类作物的紫色显色调控机制的相关报道较少，使得与表征显色调控机制的分子标记无法快速应用于育种环节中。
此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。
发明内容
为了改善紫色不结球白菜在选种时的技术不足(白菜叶片颜色的选育)，本发明提出一种能高效鉴定不结球白菜紫色叶片基因型的分子标记与应用。该分子标记及分子标记扩增引物可以高效鉴定杂交后代群体中紫色纯合和紫色杂合子代，加速紫色不结球白菜的育种年限，提高选择效率，为芸薹属紫色蔬菜的品种快速改良提供理论和数据支撑。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本申请第一方面涉及一种与白菜叶片紫色基因相关的分子标记。分子标记包含：位于3号染色体的31209409处，多态性为A或G；位于3号染色体的31304070处，多态性为G或A；位于3号染色体的31409624处，多态性为T或C；位于3号染色体的31521617处，多态性为T或A；位于3号染色体的31632032处，多态性为T或C。具体地，本申请涉及的分子标记为一种能高效鉴定不结球白菜杂交后代群体中紫色纯合和紫色杂合子代的SNP位点。
本申请第二方面涉及与白菜叶片紫色基因相关的分子标记在如下(1)或(2)中的应用：
(1)培育或者辅助培育叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜叶片品种；
(2)鉴定或筛选叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜叶片品种。
本申请第三方面涉及一种培育或者辅助培育叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜的方法。该方法包含以下步骤：
检测待测白菜位于白菜3号染色体的31209409处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AG杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31304070处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31409624处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31521617处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31632032处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色。
本申请第四方面涉及一种鉴定或筛选叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜叶片的方法。该方法包含以下步骤：
检测待测白菜位于白菜3号染色体的31209409处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AG杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31304070处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31409624处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31521617处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31632032处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色。
本申请第五方面涉及一种检测白菜叶片颜色的引物组合。引物组合包括以下(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中的一组或多组：
(1)反向引物Rt：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCATACCTCACTGAACGATTCCT；
反向引物Rc：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATACCTCACTGAACGATTCCC；
正向引物F：
CAATAACACTTACCCAAGCCCT；
(2)反向引物Rg：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGACGAAATGCTGGAAGAAGG；
反向引物Ra：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGACGAAATGCTGGAAGAAGA；
正向引物F：
TAATTTGATACTACGGTGCAACCC；
(3)反向引物Ra：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTCTTCTCATAGCAGCGACAA；
反向引物Rg：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCTTCTCATAGCAGCGACAG；
正向引物F：
AAGCTAATAAGCAAATGGATGAGAC；
(4)正向引物Ft：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGTCCACTAGACATTCTTTTCTCT；
正向引物Fa：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGTCCACTAGACATTCTTTTCTCA；
反向引物R：
ACTATCAACAGAGTGAATGGGAGAA；
(5)正向引物Ft：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCATACCAGGTAAATGATAATAGTGTTT T；
正向引物Fc：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCATACCAGGTAAATGATAATAGTGTTT C；
反向引物R：
GGAAATTTTGCAGCAAGCG。
根据一种优选实施方式，引物的5′端连接有荧光分子FAM或HEX。
优选地，荧光分子FAM或HEX的接头序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
本申请第六方面涉及包含上述检测白菜叶片颜色的引物的物质在如下(1)或(2)中的应用：
(1)培育或者辅助培育叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜叶片品种；
(2)鉴定或筛选叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜叶片品种。
根据一种优选实施方式，所述白菜为不结球白菜。
本申请第七方面涉及一种用于鉴定白菜叶片颜色的试剂盒。优选地，该试剂盒包含检测位于3号染色体的31304070处的分子标记的试剂。优选地，该试剂盒包含上述用于检测白菜叶片颜色的引物。
本申请第八方面涉及用于扩增第一方面中的分子标记在紫色白菜叶片基因型选育中的应用。
本申请第九方面涉及一种基因检测方法。该方法包含以下步骤：
用能够扩增出位于3号染色体的31304070处的位点的引物对白菜植株DNA进行PCR扩增；
对PCR产物的荧光信号进行读取，其中，
当PCR扩增产物仅检测到HEX信号时，判定为叶片紫色表型的纯合植株；
当PCR扩增产物仅检测到FAM信号时，判定为叶片绿色表型的纯合植株；
当PCR扩增产物同时检测到FAM和HEX荧光信号，判定为叶片浅紫色表型的杂合植株。
本申请第十方面涉及一种鉴定白菜叶片的方法。该方法包含以下步骤：
提取待测样DNA；使用上述引物组合扩增待测样DNA；测序，以检测PCR扩增产物中的位于3号染色体的31304070处的分子标记。
本申请第十一方面涉及一种选育方法。该选育方法包含以下步骤：
用能够扩增出位于3号染色体的31304070处位点的引物对白菜植株DNA进行PCR扩增；
对PCR产物的荧光信号进行读取，其中，当PCR扩增产物仅检测到HEX信号时，判定为叶片紫色表型的纯合植株；当PCR扩增产物仅检测到FAM信号时，判定为叶片绿色表型的纯合植株；当PCR扩增产物同时检测到FAM和HEX荧光信号，判定为叶片浅紫色表型的杂合植株。
本申请第十二方面涉及一种系统。该系统包含分子鉴定模块和数据处理模块。基于分子鉴定模块获取白菜植株DNA的3号染色体第31209409处、31304070处、31409624处、31521617处和/或31632032处的核苷酸的鉴定结果，数据处理模块至少生成白菜植株为叶片浅紫色、紫色或绿色中的一种判定结果。优选地，该系统包含微流控芯片。本申请基于3号染色体末端第31304070位的SNP位点的引物利用微流控SNP芯片系统进行白菜叶片颜色的鉴定，并建立了鉴定白菜叶片颜色的方法。优选地，微流控SNP芯片系统所使用的反应体系以及引物能够与本申请所涉及的实施例2中的反应体系和引物相同。优选地，白菜能够为不结球白菜。
进一步地，两个反向引物分别连接不同的荧光接头序列。反向引物Rg的5＇端连接FAM荧光接头序列，反向引物Ra的5＇端连接HEX荧光接头序列。
本发明第十三方面还提供了上述分子标记的应用，有利于鉴定不结球白菜杂交后代群体中紫色纯合子后代和紫色杂合子后代。
具体的选育方法步骤如下：
(1)用本申请涉及的PARMS基因分型引物对白菜植株DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)利用酶标仪对PCR产物的荧光信号进行读取，如果PCR扩增产物仅检测到HEX信号，则该植株的叶片基因型为A，A基因型判定为叶片紫色表型的纯合植株；若仅检测到FAM信号，则该植株的叶片基因型为B，B基因型判定为叶片绿色表型的纯合植株；若同时检测到FAM和HEX荧光信号，则该植株叶片基因型为H，H基因型判定为叶片紫色表型的杂合植株。
以上涉及的PCR反应体系采用10μL PCR反应体系：2×PARMS主混合物5μL，10μM浓度的正向引物1 0.15μL，10μM浓度的正向引物2 0.15μL，10μM浓度的反向引物0.4μL，50ngDNA模板1μL和3.3μL ddH2O。
优选地，引物组应用于扩增反应中。
本发明第十四方面还提供了一种特异性检测白菜叶片颜色的方法。方法是利用以下(1)或(2)的引物组扩增白菜基因组：
(1)反向引物Rg和反向引物Ra；
(2)反向引物F。
优选地，引物组应用于扩增反应中。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
根据实施例1可知，本发明利用BSA-seq基因定位方法定位到与控制不结球白菜紫色叶片相关的基因在A03染色体的末端，该突变位点位于3号染色体的31304070处，开发了与不结球白菜紫色叶片基因相关的SNP分子标记。同时，实施例2中所涉及的反向验证实验证明了本申请所涉及的分子标记具有通用性和准确性。根据分子标记和/或扩增该分子标记的PARMS基因分型引物可以直接用于紫色不结球白菜基因型的鉴定，进而利用该分子标记进行辅助育种，缩短育种年限，提高选择效率，同时为克隆控制不结球白菜叶片紫色性状基因及其功能研究奠定了良好的基础。
与公开号为CN116004901A的中国专利申请公开的与普通白菜叶片紫色相关的KASP分子标记及其应用相比，本申请是基于紫色不结球白菜‘PQC’为母本、绿色不结球白菜‘HYYTC’为父本杂交后的后代获取得到的与不结球白菜叶片颜色相关的SNP位点。本申请通过对不结球白菜不同品种的杂交后代群体与叶片颜色相关的SNP位点的探究，丰富了与不结球白菜叶片颜色相关的SNP位点的数量，增加了精细化至品种间的叶片颜色区分的准确度。尤其地，在相关验证实验(实施例2)中，本申请的SNP位点的叶片颜色区分度能够达到100％。因此，本申请所涉及的SNP位点或联合如上述对比文件中涉及的SNP位点形成的组合式SNP位点能够提高预测不结球白菜叶片颜色的准确度及应用范围。
附图说明
图1是P1、P2和F1的叶片颜色的示意图；
图2是△SNP-index在染色体上的分布和鉴定紫叶基因的候选区域的示意图，其中，a表示△SNP-index在10条染色体上的分布，红箭头为定位区间；b表示△SNP-index在A03染色体上的分布，红色虚线为95％置信区间的阈值线，红框代表△SNP-index大于阈值区域，即候选基因区域；
图3是6个标记在P1、P2、F1和F2群体的基因分型图；
图4是位于03号染色体第31304070位的分子标记在F2和F3群体的基因分型图，其中，A为F2群体的基因分型图，B为F3-1紫色杂合群体的基因分型图，C为F3-2紫色纯合群体的基因分型图。
具体实施方式
下面结合附图进行详细说明。
除非另有定义，本发明所使用的所有科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。对于本领域的普通技术人员而言，其可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明所用原料及试剂均有市售，且任何生物种质材料均可对外作为科研研究加以提供。
本申请中的A(或AA)代表紫色叶片的不结球白菜所对应的纯合位点。本申请中的B(或BB)代表绿色叶片的不结球白菜所对应的纯合位点。本申请中的H(或HH)代表紫色叶片的不结球白菜所对应的杂合位点。A\B\H的碱基种类由其所处位点确认，例如：位于3号染色体的31521617处的A的碱基为AA，B的碱基为TT，H的碱基为TA。
本发明基于BSA-Seq方法在具有紫色和绿色叶片的不结球白菜的F2群体中查找SNP变异位点，并从中发现位于3号染色体的31209409处的SNP位点与不结球白菜叶片颜色相关，该处的碱基为A或G；位于3号染色体的31304070处的SNP位点与不结球白菜叶片颜色相关，该处的碱基为G或A；位于3号染色体的31409624处的SNP位点与不结球白菜叶片颜色相关，该处的碱基为T或C；位于3号染色体的31521617处的SNP位点与不结球白菜叶片颜色相关，该处的碱基为T或A；位于3号染色体的31632032处的SNP位点与不结球白菜叶片颜色相关，该处的碱基为T或C。
实施例1
本实施例涉及不结球白菜叶片颜色相关的分子标记的定位及与之相关的引物的开发。
1、分离群体的构建
以紫色不结球白菜‘PQC’为母本、绿色不结球白菜‘HYYTC’为父本进行杂交获得F1种子。F1自交获得F2群体，F1分别与‘PQC’和‘HYYTC’回交构建BC1P1和BC1P2群体。
2、遗传分析
以紫色的有无作为分类标准，在5472株F2群体中，紫叶3998株，绿叶1474株，结果符合3：1的分离比例(χ2值分别为1.81)；在705株BC1P2中，紫叶373株，绿叶332株，符合1：1的分离比例(χ2值为1.61)；BC1P1中所有的单株全为紫叶。结果表明，叶片紫色性状是由单基因控制的质量性状，紫色对于绿色是显性性状，如图1所示。
3、BSA技术定位紫色基因候选区域
利用GATK3.3软件将两个亲本序列比对到白菜参考基因组(参考白菜基因组V1.5)上，总共鉴定到2776536个SNPs，并用于两个池(G-bulk和P-bulk)中SNP-index计算，Δ(SNP-index)值的计算和Δ(SNP-index)绘制的图是通过结合G-bulk和P-bulk的SNP-index信息。当SNP-index等于0.5时，等位基因来自两个亲本的贡献相同，说明候选基因不在该位置。当基因组区域具有候选基因时，Δ(SNP-index)的值显著大于0。根据基因组区域绘制Δ(SNP-index)图，95％置信水平下，在A03染色体鉴定到一个控制叶片紫色基因的候选区间，区间为23.88-31.68Mb，大小约为7.8Mb，如图2所示。
4、精细定位
在初定位区间里共设计6对引物，在双亲、F1以及F2(44个绿色单株和44个紫色单株)中进行扩增。结果显示：基因分型结果良好，该定位区间的标记与紫色连锁，说明BSA定位的区间结果是可信的，如图3所示。
接着在该区间内再设计13个标记，引物序列见附表1(PARMS引物序列信息)，利用3600株F2(800株绿色单株和2800株紫色单株)群体进一步筛选重组单株。
本申请的基因分型采用基于荧光标记的SNP分型技术(PARMS，方法可参考文献1：《Penta-Primer Amplification Refractory Mutation System(PARMS)with Direct PCR-Based SNP Marker-Assisted Selection》)，利用FAM和HEX作为报告荧光，并借助酶标仪扫描荧光信号，从而进行白菜叶片颜色基因SNP等位基因型检测。
本申请用于扩增变异位点的引物包含两种，一条反向引物和两条正向引物，或两条反向引物和一条正向引物。两条正向引物或两条反向引物前分别添加了FAM荧光标签序列和HEX荧光标签序列。FAM荧光标签序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。HEX荧光标签序列为GAAGGTCGGAGT CAACGGATT。
根据重组单株标记的基因型与重组单株的表型的对比结果，将候选基因最终定位在31.18-31.65Mb区间里，区间大小470kb，其中，31209409\31304070\31409624\31521617\31632032这几个标记坐落在该精细定位的区间里。该标记鉴定的重组单株基因型与表型完全吻合，即对含有3600个单株的F2分离群体的鉴定准确率为100％，如表2所示。表2示出了F2群体中重组单株基因分型结果，结果显示，以白菜03号染色体第31209409\31304070\31409624\31521617\31632032位的SNP位点进行基因分型，以母本(P1)、父本(P2)和两者杂交后代F1代为基准，当白菜03号染色体第31209409位的SNP位点为纯合GG时(用A来表示)，叶片为紫色；当白菜03号染色体第31209409位的SNP位点为纯合AA时(用B来表示)，叶片为绿色；当白菜03号染色体第31209409位的SNP位点为杂合AG时(用H来表示)，叶片为紫色(或者说浅紫色)，同时，F2群体所检测的白菜03号染色体第31209409位的SNP位点与其叶片颜色能够对应。
以白菜03号染色体第31304070位的SNP位点进行基因分型，以母本(P1)、父本(P2)和两者杂交后代F1代为基准，当白菜03号染色体第31304070位的SNP位点为纯合AA时(用A来表示)，叶片为紫色；当白菜03号染色体第31304070位的SNP位点为纯合GG时(用B来表示)，叶片为绿色；当白菜03号染色体第31304070位的SNP位点为杂合GA时(用H来表示)，叶片为紫色(或者说浅紫色)，同时，F2群体所检测的白菜03号染色体第31304070位的SNP位点与其叶片颜色能够对应。
以白菜03号染色体第31409624位的SNP位点进行基因分型，以母本(P1)、父本(P2)和两者杂交后代F1代为基准，当白菜03号染色体第3140962位的SNP位点为纯合CC时(用A来表示)，叶片为紫色；当白菜03号染色体第3140962位的SNP位点为纯合TT时(用B来表示)，叶片为绿色；当白菜03号染色体第3140962位的SNP位点为杂合TC时(用H来表示)，叶片为紫色(或者说浅紫色)，同时，F2群体所检测的白菜03号染色体第3140962位的SNP位点与其叶片颜色能够对应。
以白菜03号染色体第31521617位的SNP位点进行基因分型，以母本(P1)、父本(P2)和两者杂交后代F1代为基准，当白菜03号染色体第31304070位的SNP位点为纯合AA时(用A来表示)，叶片为紫色；当白菜03号染色体第31521617位的SNP位点为纯合TT时(用B来表示)，叶片为绿色；当白菜03号染色体第31521617位的SNP位点为杂合AT时(用H来表示)，叶片为紫色(或者说浅紫色)，同时，F2群体所检测的白菜03号染色体第31521617位的SNP位点与其叶片颜色能够对应。
以白菜03号染色体第31632032位的SNP位点进行基因分型，以母本(P1)、父本(P2)和两者杂交后代F1代为基准，当白菜03号染色体第31632032位的SNP位点为纯合CC时(用A来表示)，叶片为紫色；当白菜03号染色体第31632032位的SNP位点为纯合TT时(用B来表示)，叶片为绿色；当白菜03号染色体第31632032位的SNP位点为杂合CT时(用H来表示)，叶片为紫色(或者说浅紫色)，同时，F2群体所检测的白菜03号染色体第31632032位的SNP位点与其叶片颜色能够对应。
上述结果说明，不结球白菜叶片颜色紧密连锁白菜03号染色体第31209409\31304070\31409624\31521617\31632032位的SNP位点。
实施例2
本实施例涉及白菜03号染色体第31209409\31304070\31409624\31521617\31632032位的SNP位点的开发及应用。在本申请中，分子标记包含白菜03号染色体第31209409\31304070\31409624\31521617\31632032位的SNP位点。
随机选取90个F2单株，利用白菜03号染色体第31304070位的SNP位点进行基因型鉴定，如图4A所示，选择鉴定出来的紫色杂合(红点)和紫色纯合基因型(绿点)的F2单株，并将2种基因型的F2单株进行自交留种获得的2个F3群体。如图4B所示，F3-1是紫色杂合基因型自交留种获得的后代，根据叶片颜色观察，发现含有66个单株的F3群体里，绿色单株有17株，紫色单株49株，叶色分离仍然严重；如图4C所示，F3-2群体是来源于紫色纯合基因型自交的后代，50个F3单株经表型观察，全部为紫色，说明F3-2中叶色性状不再发生紫绿两种颜色的分离。
选取白菜03号染色体第31209409\31304070\31409624\31521617\31632032位的SNP位点对两个F3基因群体进行分型，发现表型和基因型完全吻合，说明白菜03号染色体第31209409\31304070\31409624\31521617\31632032位的SNP位点可用于分子标记辅助育种。
具体地，SNP等位基因型检测方法包含以下步骤：
以待测样品基因组DNA为模板，设计PARMS基因分型引物进行扩增，获得扩增产物；
PCR反应体系采用10μL PCR反应体系(2×PARMS主混合物5μL、10μM浓度的正向引物Rg 0.15μL、10μM浓度的正向引物Ra 0.15μL、10μM浓度的反向引物F 0.4μL、50ng DNA模板1μL、3.3μL ddH2O)，
采用降落PCR扩增程序：94℃15min，1个循环；94℃20s，65℃降到57℃(每循环降低0.8℃)1min，10个循环；94℃20s，57℃1min，30个循环。
对扩增产物进行检测和分析：
(1)31209409位点
(1)反向引物Rt：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCATACCTCACTGAACGATTCCT；
反向引物Rc：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATACCTCACTGAACGATTCCC；
正向引物F：
CAATAACACTTACCCAAGCCCT。
利用酶标仪对PCR产物的荧光信号进行读取，其中，如果PCR扩增产物仅检测到HEX信号，则该植株的叶片基因型为GG，判定为叶片紫色表型的纯合植株；若仅检测到FAM信号，则该植株的叶片基因型为AA，判定为叶片绿色表型的纯合植株；若同时检测到FAM和HEX荧光信号，则该植株叶片基因型为AG，判定为叶片紫色表型的杂合植株。采用本发明的分子标记对待测样本叶片的基因型进行检测，对其表型进行统计，结果表明表型和基因型完全吻合(表3)。
(2)31304070位点
反向引物Rg：
5＇-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGACGAAATGCTGGAAGAAGG-3＇，
反向引物Ra：
5＇-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGACGAAATGCTGGAAGAAGA-3＇，
正向引物F：
5＇-TAATTTGATACTACGGTGCAACCC-3＇。
利用酶标仪对PCR产物的荧光信号进行读取，其中，如果PCR扩增产物仅检测到HEX信号，则该植株的叶片基因型为AA，判定为叶片紫色表型的纯合植株；若仅检测到FAM信号，则该植株的叶片基因型为GG，判定为叶片绿色表型的纯合植株；若同时检测到FAM和HEX荧光信号，则该植株叶片基因型为GA，判定为叶片紫色表型的杂合植株。采用本发明的分子标记对待测样本叶片的基因型进行检测，对其表型进行统计，结果表明表型和基因型完全吻合(表4)。
(3)31409624位点
(3)反向引物Ra：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTCTTCTCATAGCAGCGACAA；
反向引物Rg：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCTTCTCATAGCAGCGACAG；
正向引物F：
AAGCTAATAAGCAAATGGATGAGAC。
利用酶标仪对PCR产物的荧光信号进行读取，其中，如果PCR扩增产物仅检测到HEX信号，则该植株的叶片基因型为CC，判定为叶片紫色表型的纯合植株；若仅检测到FAM信号，则该植株的叶片基因型为TT，判定为叶片绿色表型的纯合植株；若同时检测到FAM和HEX荧光信号，则该植株叶片基因型为TC，判定为叶片紫色表型的杂合植株。采用本发明的分子标记对待测样本叶片的基因型进行检测，对其表型进行统计，结果表明表型和基因型完全吻合(表5)。
(4)31521617位点
正向引物Ft：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGTCCACTAGACATTCTTTTCTCT；
正向引物Fa：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGTCCACTAGACATTCTTTTCTCA；
反向引物R：
ACTATCAACAGAGTGAATGGGAGAA。
利用酶标仪对PCR产物的荧光信号进行读取，其中，如果PCR扩增产物仅检测到HEX信号，则该植株的叶片基因型为AA，判定为叶片紫色表型的纯合植株；若仅检测到FAM信号，则该植株的叶片基因型为TT，判定为叶片绿色表型的纯合植株；若同时检测到FAM和HEX荧光信号，则该植株叶片基因型为TA，判定为叶片紫色表型的杂合植株。采用本发明的分子标记对待测样本叶片的基因型进行检测，对其表型进行统计，结果表明表型和基因型完全吻合(表6)。
(5)31632032位点
正向引物Ft：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCATACCAGGTAAATGATAATAGTGTTT T；
正向引物Fc：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCATACCAGGTAAATGATAATAGTGTTT C；
反向引物R：
GGAAATTTTGCAGCAAGCG。
利用酶标仪对PCR产物的荧光信号进行读取，其中，如果PCR扩增产物仅检测到HEX信号，则该植株的叶片基因型为CC，判定为叶片紫色表型的纯合植株；若仅检测到FAM信号，则该植株的叶片基因型为TT，判定为叶片绿色表型的纯合植株；若同时检测到FAM和HEX荧光信号，则该植株叶片基因型为TC，判定为叶片紫色表型的杂合植株。采用本发明的分子标记对待测样本叶片的基因型进行检测，对其表型进行统计，结果表明表型和基因型完全吻合(表7)。
表1
表2
表3
注：A代表基因型GG；B代表基因型AA；H代表基因型AG
表4
注：A代表基因型AA；B代表基因型GG；H代表基因型AG表5
注：A代表基因型CC；B代表基因型TT；H代表基因型TC
表6
注：A代表基因型AA；B代表基因型TT；H代表基因型TA
表7
注：A代表基因型CC；B代表基因型TT；H代表基因型TC
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。
Claims (10)
1.一种与白菜叶片紫色基因相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记包含：
位于3号染色体的31209409处，多态性为A或G；
位于3号染色体的31304070处，多态性为G或A；
位于3号染色体的31409624处，多态性为T或C；
位于3号染色体的31521617处，多态性为T或A；
位于3号染色体的31632032处，多态性为T或C。
2.如权利要求1所述与白菜叶片紫色基因相关的分子标记在如下(1)或(2)中的应用：
(1)培育或者辅助培育叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜叶片品种；
(2)鉴定或筛选叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜叶片品种。
3.一种用于鉴定白菜叶片颜色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1所示的分子标记的试剂。
4.一种培育或者辅助培育叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜的方法，其特征在于，检测待测白菜位于白菜3号染色体的31209409处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AG杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31304070处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31409624处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31521617处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31632032处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色。
5.一种鉴定或筛选叶片颜色为紫色、浅紫色或绿色的白菜的方法，其特征在于，检测待测白菜位于白菜3号染色体的31209409处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AG杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31304070处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GG纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为GA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31409624处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31521617处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为AA纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TA杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色，或检测待测白菜位于白菜3号染色体的31632032处的SNP位点的基因型，并进行如下判断：
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为CC纯合型，则所述待测白菜的叶片为紫色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TT纯合型，则所述待测白菜的叶片为绿色；
待测白菜基因组中SNP位点的基因型为TC杂合型，则所述待测白菜的叶片为浅紫色。
6.一种检测白菜叶片颜色的引物，其特征在于，所述引物组合包括以下(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中的一组或多组：
(1)反向引物Rt：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCATACCTCACTGAACGATTCCT；
反向引物Rc：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATACCTCACTGAACGATTCCC；
正向引物F：
CAATAACACTTACCCAAGCCCT；
(2)反向引物Rg：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGACGAAATGCTGGAAGAAGG；
反向引物Ra：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGACGAAATGCTGGAAGAAGA；
正向引物F：
TAATTTGATACTACGGTGCAACCC；
(3)反向引物Ra：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTCTTCTCATAGCAGCGACAA；
反向引物Rg：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCTTCTCATAGCAGCGACAG；
正向引物F：
AAGCTAATAAGCAAATGGATGAGAC；
(4)正向引物Ft：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGTCCACTAGACATTCTTTTCTCT；
正向引物Fa：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGTCCACTAGACATTCTTTTCTCA；
反向引物R：
ACTATCAACAGAGTGAATGGGAGAA；
(5)正向引物Ft：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCATACCAGGTAAATGATAATAGTGTTT T；
正向引物Fc：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCATACCAGGTAAATGATAATAGTGTTT C；
反向引物R：
GGAAATTTTGCAGCAAGCG。
7.根据权利要求6所述的检测白菜叶片颜色的引物，其特征在于，所述引物的5′端连接有荧光分子FAM或HEX。
8.包含权利要求6或7所述检测白菜叶片颜色的引物的物质在如下(1)或(2)中的应用：
(1)培育或者辅助培育叶片颜色为紫叶、浅紫色或绿叶的白菜叶片品种；
(2)鉴定或筛选叶片颜色为紫叶、浅紫色或绿叶的白菜叶片品种。
9.一种用于鉴定白菜叶片颜色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：权利要求6或7所述的检测白菜叶片颜色的引物。
10.一种白菜鉴定系统，其特征在于，包含分子鉴定模块和数据处理模块，其中，
基于所述分子鉴定模块获取白菜植株DNA的3号染色体第31209409处、31304070处、31409624处、31521617处和/或31632032处的核苷酸的鉴定结果，所述数据处理模块至少生成白菜植株为叶片浅紫色、紫色或绿色中的一种判定结果。
Applications Claiming Priority (2)
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