CN117866810A

CN117866810A - 一株高效降解赭曲霉毒素的微杆菌及其应用

Info

Publication number: CN117866810A
Application number: CN202311763888.XA
Authority: CN
Inventors: 贾如; 刘文彬; 赵婧怡
Original assignee: Beijing Century Honbon Biological Technology Co ltd; Shanxi Lingde Biotechnology Co ltd; Shanxi University
Current assignee: Beijing Century Honbon Biological Technology Co ltd; Shanxi Lingde Biotechnology Co ltd; Shanxi University
Priority date: 2023-12-20
Filing date: 2023-12-20
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明提供了一株高效降解赭曲霉毒素的微杆菌及其应用，该微杆菌(Microbacteriumsp.)ASAG1016，保藏编号为CGMCC No.27247，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明从种植玉米的土壤中分离得到一株对赭曲霉毒素具有较高的降解能力的菌株微杆菌(Microbacterium sp.)ASAG1016，可以克服现阶段可降解OTA的微生物降解率较低不能抑制产毒真菌青霉菌生长的缺点，提高对OTA降解率，还具有对呕吐毒素与T‑2毒素降解的作用。

Description

一株高效降解赭曲霉毒素的微杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株高效降解赭曲霉毒素的微杆菌及其应用。

背景技术

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉属(Aspergillus spp.)和青霉属(Penicillium spp.)产毒菌株产生的次级代谢产物，主要存在于谷物及其副产品中。OTA具有多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害，被列为2B类致癌物。肾脏是对OTA最敏感的器官，肾毒性是最典型和最早发现的症状，还被发现有肝毒性、基因毒性、神经毒性、致畸性和免疫抑制。OTA会污染两类食品：谷物、香料、咖啡和pH值中性和含水量低的类似物品；以及含水量高、pH值低的水果及其加工产品。大多数物理化学方法对于降解OTA是不切实际的，因为它们在食品工业中的应用由于毒素降解不完全而受到限制，或者它们还导致二次污染。相比之下，生物方法不会降低食物的营养价值，并且对解毒OTA表现出很高的功效和特异性。

OTA的脱毒方法主要有三种，物理脱毒、化学脱毒和生物脱毒，其中物理脱毒和化学脱毒方法大部分脱毒效率低，不能广泛适用并且可能导致营养物质的损失和二次污染的问题。生物降解法则是利用微生物或生物酶通过生物代谢将真菌毒素转换成其他低毒或者无毒的化学物质，彻底破坏真菌毒素的化学结构，能实现安全、高效的脱毒目的。近几年筛选出的降解菌，一些菌株是生物吸附作用，这个过程一般是可逆的，真菌毒素可被再次释放出来。此外，影响微生物细胞壁对毒素吸附效果的因素有很多，鉴于以上两点原因，生物吸附法并不是生物脱毒的最佳方法。生物降解作用的菌株又存在孵育时间太长、降解率普遍不高的问题。所以通过筛选能够找到高效、易于应用、经济安全的赭曲霉毒素降解菌，对提高粮食及食品质量，保障国民食品安全具有重要意义。

总而言之，为解决农产品、饲料原料及饲料中OTA污染问题，急需从自然资源中分离筛选安全、高效降解OTA且抑制产生OTA青霉菌的菌株，并进一步研究其生物特性及降解产物毒性，研发适用于饲料行业的微生物菌制剂，减少养殖业的经济损失。

发明内容

本发明提供了一株高效降解赭曲霉毒素的微杆菌及其应用，从种植玉米的土壤中分离出一株对赭曲霉毒素A具有较高的降解能力的菌株微杆菌(Microbacterium sp.)ASAG1016，可以克服现阶段可降解OTA的微生物不适合实际生产且孵育时间长、降解率较低的缺点，提高对OTA降解率，还具有对呕吐毒素与T-2毒素降解的作用，和在抑制青霉菌生长中的应用。

具体技术方案如下：

微杆菌菌株，命名为微杆菌(Microbacterium sp.)ASAG1016，保藏编号为CGMCCNo.27247，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

OTA为赭曲霉毒素A；DON为呕吐毒素；T-2为T-2毒素。

根据Takara细菌基因组DNA提取试剂盒步骤和PCR方法提取并扩增该菌株的基因组DNA，通过测定16S rRNA基因序列的全长约为1500bp，测序后在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中对相关序列进行系统发育分析，结合生理生化特征，鉴定为微杆菌。

进一步地，所述微杆菌菌株菌落圆形，黄色，有光泽，边缘完整，无芽孢，为革兰氏阳性菌，16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了微杆菌菌株在降解饲料中的赭曲霉毒素、呕吐毒素、T-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。

本发明还提供了一种降解饲料中赭曲霉毒素的菌剂，所述菌剂的活性成分包括如上述所述的微杆菌菌株(Microbacterium sp.)ASAG1016；或所述微杆菌菌株的液体发酵上清液，或所述微杆菌菌株液体发酵上清液中的胞外酶。

取微杆菌ASAG1016的发酵液、菌体细胞、上清液、上清液+蛋白酶k、胞体、胞体高温处理、上清高温处理运用于降解OTA；结果表明：发酵上清液对OTA的降解率显著高于其它组别，证明微杆菌ASAG1016降解OTA活性组分存在于发酵上清液中。

进一步地，所述菌剂中微杆菌菌株的浓度为OD₆₀₀值为1.0～1.2。

本发明还提供了一种降解饲料中的赭曲霉毒素的菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取上述所述的微杆菌菌株(Microbacterium sp.)ASAG1016，在固体培养基上活化培养；

(2)将步骤(1)中活化培养后的菌株接种于液体培养基中，进行种子培养，得到种子液；

(3)将培养后的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，将培养完成的菌液制成液态菌剂或/和固态菌剂。

进一步地，步骤(1)～(3)中，所述微杆菌菌株的培养最适温度为30～45℃，最适pH值为6.5～8.5。

进一步地，步骤(1)中，所述固体培养基为LB固体培养基，所述活化培养的条件为：pH值为7.2～7.6；步骤(2)中，所述液体培养基为LB液体培养基；所述种子培养的条件为：pH值为7.2～7.6；种子培养至OD₆₀₀值为0.7～0.8，达到对数生长期，得到种子液；步骤(3)中，发酵培养至OD₆₀₀值为1.0～1.2。

固体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；液体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。

本发明还提供了上述所述的菌剂，或上述所述的制备方法制得的菌剂，在降解饲料中的赭曲霉毒素、呕吐毒素、T-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。

微杆菌ASAG1016对OTA降解步骤为：

将菌剂中微杆菌ASAG1016的初始浓度控制为10⁸CFU/mL，将250μL菌剂加入250μL浓度为100ng/mL的赭曲霉毒素标准品溶液中，调节反应体系的pH值为7.2～7.6，培养温度为37～45℃，反应时间为2h，反应结束后赭曲霉毒素降解率为100％。

本发明还提供了上述所述的菌剂，或上述所述的制备方法制得的菌剂，在抑制青霉菌生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的微杆菌ASAG1016，从种植玉米的土壤中分离得到，可以克服现阶段可降解OTA的微生物不适合实际生产且降解率较低的缺点，提高对OTA降解率，还具有对呕吐毒素与T-2毒素降解的作用和在抑制青霉菌生长中的应用。

(2)本发明提供的微杆菌ASAG1016，能高效快速的降解OTA。当OTA初始浓度为100ng/mL时，2h后微杆菌对其降解率达100％。

(3)经研究可确定微杆菌ASAG1016可通过生物酶降解作用使得OTA降解为无毒的代谢产物。降解过程无毒副作用，无耐药性，无污染，具有一定的应用价值。

附图说明

图1为实施例1微杆菌ASAG1016的菌落形态图。

图2为实施例1微杆菌ASAG1016在扫描电镜下的菌落形态图。

图3为实施例1微杆菌ASAG1016系统进化树。

图4为实施例2微杆菌ASAG1016降解OTA组液相色谱图(出峰时间20.589min)；空白对照组液相色谱图(出峰时间20.667min)。

图5为实施例3微杆菌ASAG1016在不同温度下对OTA的降解率条形图。

图6为实施例4微杆菌ASAG1016在不同pH下对OTA的降解率条形图。

图7为实施例5微杆菌ASAG1016和清水对葡萄发霉情况的对比图。

图8为实施例5微杆菌ASAG1016对自然霉变葡萄中OTA的脱毒效果柱状图。

图9为实施例5、实施例6微杆菌ASAG1016对自然霉变葡萄中OTA、DON、T-2毒素降解率柱状图。

图10为实施例7微杆菌ASAG1016对青霉菌生长有抑制作用的对比图，左边为微杆菌ASAG1016与青霉菌对峙培养72h图，其中圆圈内为微杆菌；右边为青霉菌培养72h图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此；案例中OTA为赭曲霉毒素A；DON为呕吐毒素；T-2为T-2毒素。

实施例1

1.菌的分离

(1)从山西省晋城地区种植玉米的土壤中采集多份自然界土壤于-80℃中保存，并注明采集名称、地点、时间等信息；取5g土壤样品于100mL灭菌的0.9％NaCl，以200rpm振荡1h以完全溶解细菌，并静置1h以分离土壤和溶液，取1mL上层溶液，将其接种到LB液体培养基中，并在37℃培养24h，200rpm，制备土壤菌悬液，用浓度梯度法逐级稀释10、100、1000和1000倍。

(2)将不同浓度稀释的土壤菌悬液涂布在LB固体平板上，37℃培养24h，挑取平板上形态特征、颜色、大小不同的菌株进行平板划线纯化，接纯化后的菌株进行OTA降解试验，分析得到降解效率最高的一株菌，该菌编号为ASAG1016。

2.菌的鉴定

(1)菌株ASAG1016在LB固体培养基上为圆形、黄色、有光泽、边缘完整；革兰氏阳性；无芽孢；菌落形态图见附图1；在扫描电镜下的菌落形态图见附图2；

(2)对菌株进行扫描电镜观察：量取一定量的2.5％戊二醛固定液于烧杯中，用镊子将材料(材料表面有菌)从培养皿中取下并放入2.5％戊二醛固定液中，并放入4℃冰箱中固定2h。然后用胶头滴管轻轻吸走固定液至废液缸中，把固定液吸干之后，往样品中缓慢加入PBS(1X)直至把样品完全浸泡，然后静置10min，轻轻吸走PBS，重复三遍；分别加入30％、50％、70％、90％乙醇水溶液直至把样品完全浸泡，然后静置10min，再加入无水乙醇直至把样品完全浸泡，然后静置10min，重复两次；把样品取出，干燥。

(3)经PCR扩增得到16S rRNA基因序列，全长约1500bp；测序后，在NCBI上使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列并进行系统发育分析，测序结果见SEQ IDNO:1。构建系统进化树如附图3所示。结果表明，菌株ASAG1016为微杆菌；

SEQ ID NO:1序列：

GAGGGGGGGGGTGCTTACCATGCAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATATGTCCCATCACCGCATGGTGTGTGGGTGGAAAGATTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGCTTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCTTTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTGAACAGGTGGTGCATGGAACAGCAGTCGAGCACAGCACTCTACAACCCAATTCAGGGCGTTGCTCGCGTTGGGAGCAAGATACAACGGTCGTGCATTACCACCCTTGAGTACCCTATGACGGCCCCAGTTGAGCCTCCTTCCACCCCTACTGCAGTTTAGTAGTACGGGGAATACAGAACCCGAAGTGCGTACGATGTTACCGGCCATGTTACCCGACGCTATGGCATTCCACCTCGCTTAGGGTTTTTCGGCCAGGGTCAAGCCTAACTCCAGACGTTGAGCTGGAGTACTTCAGCCTCAGCGATCATTAGCGTCTAGTCGTTGCGACGCCACTTATGCAAGGGCCCAGAACATGTGTGGCGGGCAGTTCAGTACTTTCAGCCATTGTGGACTTCGGCCACCGGATTGGGAACACCTCCCTCGGCAGCTTCCACGTGAT。

实施例2

本实施例探究微杆菌ASAG1016对OTA的降解作用

1.OTA测定方法

采用高效液相色谱法检测OTA，条件如下：迪马C18柱(4.6mm×250mm×5μm)；流动相：乙腈：水：乙酸(69：29：2)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；荧光探测器的激发波长为330nm，发射波长为460nm；进样量：10μL。

2.微杆菌ASAG1016对OTA的降解

(1)将1mL保藏的微杆菌ASAG1016接种到装有50mL灭菌LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH为6.5～8.5)中，在37～45℃，180～200rpm条件下培养8～24h后，取900μL发酵培养液与100μL OTA标准品(浓度为100ng/mL)混合；以900μLLB培养基与100μL OTA标准品(浓度为100ng/mL)作为对照，反应2h后测定OTA浓度，计算降解率。

(2)OTA降解率(％)＝(初始OTA峰面积-取样后测得的OTA峰面积)/初始OTA峰面积×100％。

(3)结果发现：如附图4所示，微杆菌ASAG1016与100ng/mL OTA标准品作用2h，对OTA的降解率可达到100％。

3.微杆菌ASAG1016降解OTA活性组分的确定

(1)取微杆菌ASAG1016发酵液，在4℃的冷冻离心机中，10000g离心10min，将上清液取出备用(置于冰中)，将菌体细胞沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗三次后，复溶于缓冲液并置于冰中备用。取微杆菌ASAG1016发酵液121℃高温处理20min，重复上述操作。

取未经高温处理的上清液加入蛋白酶K，50℃作用30min。(所有上清液均需要用灭菌的0.22μm的纤维素膜过滤，得到菌体的胞内提取物，置于冰中备用)

(2)分别取900μL发酵液(上清液、清液+蛋白酶k、胞体、胞体高温处理、上清高温处理高温细胞悬浮液)与100μL OTA标准品稀释液(浓度为100ng/mL)混合；同时以900μL LB培养基与100μL OTA标准品稀释液(浓度为100ng/mL)作为对照，反应2h后测定OTA浓度，计算降解率。

(3)结果分析：发酵上清液对OTA的降解率显著高于菌体细胞和胞内提取物，发酵液、上清液对OTA的降解率均为90％左右，而其余组分对OTA的降解率降低至60％左右，证明微杆菌ASAG1016降解OTA活性组分存在于发酵上清液中，是一种胞外酶。

实施例3

1.菌种活化：将在40％浓度甘油中(菌液：甘油＝1：1)保藏的ASAG1016接种于LB固体培养基上，于37℃下培养24h。其中：LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2～7.6；

2.样品处理：取900μL菌液于2mL离心管，加入100μL OTA稀释液(OTA终浓度：10ng/mL)，放在不同温度(15℃、20℃、30℃、37℃、45℃、60℃)的水浴锅内温育30min。取900μL无菌培养基于2mL离心管，加入100μL毒素稀释液，室温放置30min作为空白对照。温育结束后，取100μL上述样品加入100μL样品稀释液进行稀释。

3.毒素含量检测：

4.降解率计算公式：OTA降解率(％)＝(初始OTA峰面积-取样后测得的OTA峰面积)/初始OTA峰面积×100％。

5.结果分析：由附图5可知微杆菌ASAG1016对OTA的降解最适温度为37℃，因此在培养微杆菌ASAG1016或培养利用微杆菌ASAG1016制备降解OTA的菌剂时，培养的最适温度为37℃。

实施例4

1.菌种活化：将在40％浓度甘油中(菌液：甘油＝1：1)保藏的ASAG1016接种于LB固体培养基上，于37℃下培养24h。其中：LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.2～7.6；

2.样品处理：取900μL菌液于2mL离心管，加入100μL OTA稀释液(OTA终浓度：10ng/mL)，放在不同pH(2、6.5、7、7.5、8、8.5、9)的LB培养基重悬菌体沉淀。取900μL无菌培养基于2mL离心管，加入100μL毒素稀释液，室温放置30min作为空白对照。温育结束后，取100μL上述样品加入100μL样品稀释液进行稀释。

3.毒素含量检测：

5.结果分析：由附图6可知微杆菌ASAG1016对OTA的降解最适pH为6.5～8.5℃，因此在培养微杆菌ASAG1016或培养利用微杆菌ASAG1016制备降解OTA的菌剂时，培养的最适pH为6.5～8.5℃。

实施例5

本实施例利用微杆菌ASAG1016降解自然发霉葡萄中OTA，探究对其降解效果。

2.样品处理：称取5.0g磨碎葡萄于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液70％甲醇，置于多功能旋转混合器上振荡10min(或使用高速均质器均质了分钟，或摇床上振荡40分钟)。将提取液用普通滤纸过滤，吸取100μL滤液置于1.5mL离心管中，加入400μL OTA稀释缓沖液，用涡旋混合器混匀。

3.毒素含量检测：

5.结果分析：微杆菌ASAG1016对自然霉变葡萄中的OTA的降解率为98.86％；具体见附图9；

喷洒微杆菌ASAG1016和喷洒清水对葡萄发霉情况的对比图见附图7；喷洒微杆菌ASAG1016葡萄和自然霉变葡萄中OTA的脱毒效果柱状图见附图8。

实施例6

本实施例利用微杆菌ASAG1016降解自然发霉葡萄中其他毒素，探究对其他毒素降解效果。

2.样品处理：称取5.0g磨碎葡萄于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液70％甲醇或水，置于多功能旋转混合器上振荡10分钟(或使用高速均质器均质了分钟，或摇床上振荡40min)。将提取液用普通滤纸过滤，吸取滤液置于1.5mL离心管中，分别加入DON、T-2、OTA稀释缓沖液，用涡旋混合器混匀。

3.毒素含量检测：

5.结果分析：结合实施例5微杆菌ASAG1016对自然霉变葡萄中的OTA、DON、T-2的降解率分别为98.86％、35.05％、48.59％。对于其他有效降解OTA的菌株，并未阐述对其他毒素能够有效降解，或对于其他毒素的降解率很低(Ery4 laccase对OTA、DON、T-2的降解率分别为27％、0、40％)；而对于可以高效降解DON或T-2的菌株，未阐明对OTA是否存在降解效果；具体见附图9。

实施例7

本实施例利用微杆菌ASAG1016抑制产生OTA的青霉菌的生长；

采用琼脂柱法：将微杆菌ASAG1016的发酵上清液按照1∶10(V/V)的比例添加到PDA培养基中，用6mm的打孔器取青霉菌菌块放置在PDA培养基中央，28℃恒温培养，每24h采用十字交叉法测量菌体直径，至空白对照培养皿中的菌体长满为止，抑菌率计算公式如下：

抑菌率＝(对照组菌饼面积-样品组菌饼面积)/对照组菌柄面积×100

结果分析：微杆菌ASAG1016对产生OTA真菌(青霉菌)的抑制率高达88.47％，具有在源头上控制产OTA真菌生长的作用。

Claims

1.微杆菌菌株，其特征在于，命名为微杆菌(Microbacterium sp.)ASAG1016，保藏编号为CGMCC No.27247，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.如权利要求1所述的微杆菌菌株，其特征在于，所述微杆菌菌株菌落圆形，黄色，有光泽，边缘完整，无芽孢，为革兰氏阳性菌；16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的微杆菌菌株在降解饲料中赭曲霉毒素、呕吐毒素、T-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。

4.一种降解饲料中赭曲霉毒素的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括如权利要求1所述的微杆菌菌株，或所述微杆菌菌株的液体发酵上清液，或所述微杆菌菌株液体发酵上清液中的胞外酶。

5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中微杆菌菌株的浓度为OD₆₀₀值为1.0～1.2。

6.一种降解饲料中赭曲霉毒素的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取权利要求1中所述的微杆菌菌株，在固体培养基上活化培养；

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中，所述微杆菌菌株的培养最适温度为30～45℃，最适pH值为6.5～8.5。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固体培养基为LB固体培养基，所述活化培养的条件为：pH值为7.2～7.6；步骤(2)中，所述液体培养基为LB液体培养基；所述种子培养的条件为：pH值为7.2～7.6；种子培养至OD₆₀₀值为0.7～0.8，达到对数生长期，得到种子液；步骤(3)中，发酵培养至OD₆₀₀值为1.0～1.2。

9.如权利要求4～5任一项所述的菌剂，或如权利要求6所述的制备方法制得的菌剂，在降解饲料中的赭曲霉毒素、呕吐毒素、T-2毒素任意一种或多种真菌中的应用。

10.如权利要求4～5任一项所述的菌剂，或如权利要求6所述的制备方法制得的菌剂，在抑制青霉菌生长中的应用。