CN117858734A - 含有可缓慢吸收聚合物的透明质酸组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了透明质酸组合物，其包含透明质酸或改性透明质酸或交联透明质酸以及可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子。还提供了利用所述组合物充填软组织的方法。

Description

含有可缓慢吸收聚合物的透明质酸组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年5月13日提交的美国临时申请号63/188,295的优先权，其通过引用全部纳入本文，用于所有目的。

技术领域

本发明描述了用于充填软组织的组合物，所述组合物使用可注射的透明质酸或改性透明质酸的制剂，所述制剂包含由聚丙交酯(PLA)和聚乙交酯(PLG)聚合物和共聚物(PLGA)组成的生物可吸收生物球或颗粒或聚ε-己内酯(PCL)球或聚对二氧环己酮(PDO)或聚乙醇酸(PGA)球或交联透明质酸微球或由其他聚合物组成的粒子(granule)，所述其他聚合物例如L-丙交酯/三甲基碳酸酯

补充的透明质酸组合物提供不同程度的体内耐久性(longevity)，这取决于球形颗粒、粒子或纳米颗粒的稳定性。

背景技术

生物可吸收材料在面部软组织充填中的应用可追溯至20世纪80年代初，其时牛胶原被引入到纹路、皱纹和体积缺陷的处理中。自此以后，已批准了多种非永久性、可吸收性皮肤填充物和面部植入物，且它们在世界范围内被使用(例如透明质酸、胶原和猪小肠黏膜下层)。也已开发了半永久和永久皮肤填充物。半永久材料包括羟基磷灰石(Radiesse)和聚L-乳酸(Sculptra)。也已采用不可吸收性材料，例如PMMA微球(Bellafill)和PTFE面部植入线来矫正面部缺陷。

目前皮肤填充物或软组织充填产品市场上以透明质酸组成的产品为主导。欧洲市场上市的透明质酸填充物有110多种(Miinews)。这些HA填充物是交联的，区别主要在于浓度和HA粒径。然而，目前的HA产品均不含增强临床耐久性的补充物。

透明质酸是Meyer和Palmer在1934年发现的。Karl Meyer从玻璃体中分离出了该多糖。由于其包含糖醛酸，Meyer结合了“hyalos”(指玻璃状、透明质的)和“uronic acid”(糖醛酸)将该物质命名为透明质酸(hyaluronic acid)。在生理pH下，糖醛酸残基上的所有羧基解离，当抗衡离子为钠时，该多糖被称作透明质酸钠。1986年，Balazs提议命名玻尿酸。这是目前被接受的术语。HA是线性多糖(长链生物聚合物)，其由通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键连接的重复二糖单元形成，这些单元由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺组成。HA与其他糖胺聚糖的区别在于其与蛋白质和含硫基团之间没有共价连接。然而，其为复杂蛋白聚糖的整体组成成分。HA是细胞间基质的重要成分，该基质为填充各种组织(诸如皮肤、肌腱、肌肉和软骨)的细胞之间空隙的材料。

HA具有粘性流动、弹性和假塑性特性。这些特性是HA独有的。其他糖胺聚糖(GAG)仅能在显著高于HA的浓度下形成粘性溶液，而且并不能形成粘弹性聚合物网络。已证明HA在不同活动中的重要性，这些活性包括例如组织水合、润滑、溶质运输、细胞迁移、细胞功能、细胞分化和细胞增殖。

如下所讨论，有数种可用于使透明质酸与其他多糖交联的方法。此外，已有公开文献和专利描述了胶原与透明质酸的化学交联，包括：Rehakova等(1996)，其中采用了淀粉二醛；和Lin等(2007)，其中采用了1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺(EDC)；以及美国专利第8,607,044号(Schroeder等，2014)采用了二乙烯基砜或1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。

本领域需要开发用于充填软组织的透明质酸(玻尿酸)材料。

发明内容

本公开描述了交联的透明质酸作为可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子(例如PLA和PLGA球体或聚ε-己内酯(PCL)球或聚对二氧环己酮(PDO)球和颗粒)的载体的应用。

在一些实施方式中，本公开涉及可注射的、化学交联的透明质酸溶液，其含有可吸收的聚-L-丙交酯(PLA)或聚-乙交酯(PLG)丙交酯或L-丙交酯/乙交酯共聚物-PLGA(直径20-50μm)或聚ε-己内酯(PCL)球或聚对二氧环己酮(PDO)球，用于软组织充填和组织再生。

在一些实施方式中，化学交联的透明质酸可以购自合同制造组织或可以由生产或商业化用于软组织充填的交联透明质酸的公司提供。此外，交联的透明质酸可以使用现有和公开的工艺在内部生产。例如，可用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)生产交联透明质酸。

在一些实施方式中，聚L-乳酸晶体或微球可以购自多个制造商，包括Phosphorex、Carbion、Polysciences或Akina。对聚-L-乳酸晶体进行研磨和筛分以提供直径为20-50μm的微球或颗粒。采用γ辐射、环氧乙烷或其他合适的灭菌方法对颗粒进行灭菌。交联透明质酸可以通过高压灭菌进行灭菌。通过将灭菌的聚L-乳酸球或晶体与灭菌的交联透明质酸无菌地组合，然后混合以提供均质的混合物并填充到容器(例如最终产品注射器)中来制备最终产品。

附图说明

所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述阐述了利用本发明原理的说明性实施方式和附图，其中：

图1：兔子中对照注射组织的H&E染色(40x)。

图2：兔子中HA+PLA注射组织的H&E染色(40x)。

图3：兔子中对照注射组织的三色蓝染色(40x，箭头显示植入并且胶原纤维被染成深色)。

图4：兔子中HA+PLA注射组织的三色蓝染色(40x，箭头显示植入并且胶原纤维被染成深色)。

图5：兔子中对照注射组织的盖森染色(Geison’s stain)(40x，显示植入并且弹性原纤维被染成深色)。

图6：兔子中HA+PLA注射组织的盖森染色(Geison’s stain)(40x，显示植入并且弹性原纤维被染成深色)。

具体实施方式

所有专利、专利申请和书面参考文献通过引用以其全文纳入本文。本发明提供补充有可缓慢降解的微球或晶体(例如由聚L-乳酸、聚乙二醇或丙交酯和乙交酯共聚物组成的那些)的生物相容性交联透明质酸组合物。

除非另有说明，术语"透明质酸"或其缩写"HA"在本申请中广义地表示透明质酸(玻尿酸)或改性透明质酸或交联透明质酸，或交联透明质酸微球及其金属盐，例如其钠盐。

如本文所用，术语“生物相容性”是指根据本发明交联的透明质酸或根据本发明配制的透明质酸组合物，其在掺入或植入对象生物组织或放置于对象生物组织附近时是稳定的，更具体而言，其不会随时间而明显劣化或在所述掺入、植入或放置后诱发免疫应答或有害的组织反应。

如本文所用，术语“可注射透明质酸组合物”是指可注射的化学改性或交联的相容性透明质酸组合物，以及补充有可缓慢吸收性微球的此类组合物，其在注射入组织时，充填缺陷的组织，例如皮肤纹路和褶皱。

引用了描述用于软组织应用的透明质酸组合物应用的数篇专利和专利申请(参见专利参考文献)。数篇其他专利和专利申请描述了聚-L-丙交酯、聚乙二醇及其组合在药物递送中的潜在应用、与生长因子组合用于组织修复的应用、或单独用于(不添加透明质酸)软组织充填。还有其他专利和专利申请提到了含有乳酸聚合物的生物可吸收聚合物颗粒的潜在应用。然而，这些专利或专利申请均未建议实践包含可缓慢吸收颗粒、球体或粒子(例如聚L-乳酸微球或晶体)的交联透明质酸组合物用于软组织充填。目前唯一的含有聚L-乳酸的微球或晶体的软组织填充产品是Sculptra(FDA P020012SSER)，它由粉末状的羧甲基纤维素、甘露醇和PLLA组成。

可将具有可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子的化学交联透明质酸溶液注射入真皮浅层(superficial dermis)、中皮层(mid-dermis)或深皮层(deep dermis)以矫正面部皮肤中的轮廓缺陷，或者可将此类组合物注射入唇部肌肉周围松弛的结缔组织，或者注射入唇体以改善唇部外观。透明质酸/可缓慢吸收的材料组合物是可以通过25-30号针头注射的。该材料基本上保持无色，并提供了持久的临床效果。可将组合物预包装在包含具有数种不同耐久性程度的材料的即用型注射器中。

为了制备具有延长耐久性的透明质酸组合物，该交联透明质酸溶液补充有10-30％聚-L-丙交酯球(直径25-50μm)、或具有类似尺寸的丙交酯/丙交酯或丙交酯/乙交酯颗粒。与未补充的透明质酸组合物相比，聚丙交酯组合物或聚丙交酯/乙交酯组合物(PLGA)提供了具有延长的耐久性的软皮肤填充物。

本公开还涉及一种用于充填软组织或再生组织的方法。该方法包括将本公开的组合物注射到软组织缺陷处。该组合物填充了软组织缺陷。如本文所使用的，填充并不要求缺陷被完全填充。然而，也可以考虑完全填充该缺陷。

软组织充填方法可用于多种软组织缺陷。可以使用本发明的方法或产品处理的软组织缺陷包括：皱纹、皮肤皱褶、皮肤松弛、皮肤轮廓缺陷、皮肤细纹、皮肤沟纹和皮肤不均匀。该组合物可注射到多种皮肤区域。该方法特别适合注射到嘴唇或面部皮肤的软组织缺陷处。本领域技术人员可以根据所处理的软组织缺陷来确定待注射组合物的量。在许多应用中，可以使用0.1-0.5mL的体积。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所适用领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但是描述了优选的方法和材料。

本文所用术语“一个”或“一种”旨在表示“一个(种)”或“多个(种)”(即，至少一个(种))该冠词在语法上的宾语。除非上下文中另有定义，否则单数表述包括复数表述。例如，“一(种)要素/元素”表示一个(种)要素/元素或者多于一个(种)要素/元素。

“约”或“大约”意指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的变化相对于参比数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度可达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

除非另有说明，否则“或”表示“和/或”。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”和“含有”应理解为暗示包括规定步骤或要素或者步骤组或要素组，并且不排除任何其他步骤或要素或步骤组或要素组。

短语“由......组成”旨在包括且限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”是指示所列出要素是必需的或强制性的，并且可以存在其他要素。

下文列举的实施方式是本发明的代表：

1.一种用于软组织充填的组合物，其包含：

(i)HA载体，其中所述载体选自透明质酸、改性透明质酸或交联透明质酸，或其盐(例如钠盐)；和

(ii)可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子。

2.如项目1所述的组合物，其中所述HA载体具有1,000-10,000,000道尔顿的分子量，和/或

所述HA载体来源于动物组织或微生物发酵。

3.如项目1所述的组合物，其中改性透明质酸或交联透明质酸是由二乙烯基砜、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、对亚苯基双碳二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷或富含氨基的低聚物(如聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸)改性或交联的；和/或

改性透明质酸或交联透明质酸的浓度为12mg/mL至30mg/mL，优选16mg/mL至24mg/mL；和/或

改性透明质酸或交联透明是内聚的(cohesive)。

4.如项目1所述的组合物，其中交联透明质酸微球包被有生物可降解聚合物，例如聚-L-丙交酯(PLA)、聚乙二醇(PEG)或PLGA，或聚对二氧环己酮(PDO)；和/或

其中交联透明质酸微球是由乳化交联反应、双乳化蒸发法、微流控交联反应或压印成形制备的；和/或

交联透明质酸微球的交联剂选自下组：二乙烯基砜、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚或对亚苯基双碳二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷或富含氨基的低聚物(如聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸)；和/或

其中所述交联的透明质酸微球的粒径为：5～150μm，优选20～50μm。

5.如项目1所述的组合物，其中可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子选自：聚-L-丙交酯(PLA)、PEG-PLA共聚物或聚-L-丙交酯-羟基磷灰石、聚乙醇酸(PGA)、聚-L-丙交酯-羟基磷灰石、交联的透明质酸微球的颗粒、球体或粒子。

6.如项目1所述的组合物，其中可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子是：聚丙交酯和聚乙交酯聚合物和共聚物(PLGA)的颗粒、球体或粒子；和/或聚ε-己内酯(PCL)或PCL-PLA共聚物或聚ε-己内酯-羟基磷灰石微球的颗粒、球体或粒子；和/或聚对二氧环己酮(PDO)或聚对二氧环己酮-羟基磷灰石的颗粒、球体或粒子。

7.如项目1所述的组合物，其中可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子是通过喷雾-沉降技术、乳化法、双乳化蒸发法、微流控反应、固体-凝胶法、熔融挤出技术或压印成形生产的；和/或是通过湿热灭菌、γ射线或环氧乙烷灭菌法灭菌的；和/或

其中可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子直径为5至150μm，优选20至50μm。

8.如项目1所述的组合物，其进一步包含添加剂，例如选自下组的添加剂：

局部麻醉药物，如利多卡因、普鲁卡因等，其浓度优选为0.1重量％至0.5重量％；和/或

多元醇稳定剂，例如甘油、甘露醇、丁二醇、山梨糖醇，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

具有螯合能力的稳定剂，例如EDTA、EGTA、柠檬酸、柠檬酸钠，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

硫稳定剂或溶解促进剂，如硫酸软骨素钠(CS)、硫酸葡萄糖胺(GS)或甲基磺酰基甲烷(MSM)，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

其中通过透析过程添加可溶性小分子。

9.如项目1所述的组合物，其中组合物中HA载体的量为0.1体积％至55体积％；和/或

组合物中可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子的量为0.1体积％至50体积％，优选1体积％至20体积％；和/或

组合物中添加剂为0.1重量％至10重量％，优选0.1体积％至5体积％。

10.如项目1所述的组合物，其中组合物包含：

(ia)交联透明质酸；或(ib)内聚(cohesive)交联HA载体，其通过用二乙烯基砜在碱性环境中交联透明质酸，然后用乙醇沉淀交联的透明质酸产生；和

(iia)PLA微球；(iib)PEG-PLA微球；(iic)PLA-PCL微球；或(iid)交联HA微球，其使用ε-聚赖氨酸和4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)作为交联剂，在有机油(例如橄榄油或硅油)存在下，搅拌下进行乳化交联反应所得；

例如，组合物包含(ia)和(iia)；(ia)和(iib)；(ia)和(iic)；或(ib)和(iid)。

11.一种制备项目1-10中任一项所述的组合物的方法，其包括：

将HA载体与可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子组合。

12.如项目11所述的方法，其中利用真空行星式混合器，例如在200rpm～1400rpm的转速和100rpm～700rpm的自转速度下，将所述可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子与HA载体组合以形成可注射的均质凝胶；和/或真空下混合10～30分钟；和/或

其中将可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子添加到HA载体的乙醇或甲醇或丙酮沉淀中，并通过透明质酸溶液或0.9％氯化钠溶液或PBS缓冲液重新溶解以形成均质的可注射凝胶。

13.如项目11所述的方法，其还包括：

将化学试剂添加到可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子与HA载体的混合物中以进行交联或改性，例如，通过添加选自下组的化学试剂：二乙烯基砜，戊二醛，1,4-丁二醇二缩水甘油醚或对亚苯基双碳二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷或富含氨基的低聚物，聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸；和/或

用0.9％氯化钠溶液或PBS缓冲液透析，以获得均质的可注射组合物。

14.在有需要的对象中充填软组织的方法，其包括将项目1-10中任一项所述的组合物注射到需要充填的部位。

15.如项目14所述的方法，其中将所述组合物注射入软组织以矫正软组织缺陷；和/或

将所述组合物注射入皮肤以矫正软组织缺陷，包括皱纹、皮肤褶皱、皮肤松弛、不均匀、面部消瘦、脂肪萎缩、脸颊凹陷、眼窝凹陷或其组合。

16.如项目14所述的方法，其中所述组合物能够通过25～27号针头或套筒，例如25、27或30号针头或套筒注射。

17.如项目1所述的组合物，其中所述交联的透明质酸是通过CN111234271B中公开的方法制备的。

18.如项目1所述的组合物，其中所述交联的HA微球是通过乳化交联反应获得的，例如通过CN109224127B中公开的方法制备。

下面列出的实施例旨在说明本发明而不限制其范围。

本文引用的出版物及其中援引相关的材料都具体通过引用整体纳入本文。除非另有说明，所有试剂均是可商购的。除非另有说明，所有份数和百分数均以重量计。除非另有说明，显示结果的平均值。除非另有定义，本文使用的缩写是常规的。

实施例

实施例1.交联透明质酸/PLA组合物的制备

对于初始评估，获得交联透明质酸的市售样品。澄清、粘稠、交联的透明质酸中补充了购自PolySciences的聚L-乳酸晶体。研磨并筛分晶体以提供直径为25-45μm的尺寸分布。通过在两个注射器之间缓慢通过混合物以避免形成气泡，在洁净室环境中进行均质混合。以3500rpm进行离心以确保去除气泡。将HA-PLA注射器置于2-8℃储存。

实施例2.内聚交联HA/PEG-PLA和PLA-PCL复合物

为了进一步改进配方，根据CN111234271B获得内聚交联透明质酸凝胶(参见实施例2)。2～3％(w/v)透明质酸(MW>1300kDa)溶液用二乙烯基砜(DVS)在碱性环境(2％NaOH溶液)中在40℃下交联2.5小时。反应结束后，缓慢加入95％乙醇溶液直到析出白色沉淀。将白色沉淀用相同浓度的乙醇溶液洗涤5-10次，过滤得到白色粉末。将白色粉末溶解于PBS(pH＝7.0～7.4)中，经湿热灭菌，得到内聚交联透明质酸钠凝胶。

PEG-PLA微球(直径25-50μm)购自EvonikLP t 16并用EtO灭菌。PEG-PLA微球和灭菌内聚HA凝胶(v/v比率：25～45％)在带有冷却适配器的容器中用THINKY混合器以1000rpm转速(自转速度为转速的一半)在无菌条件下混合10分钟。获得无任何气泡的均质内聚HA/PEG-PLA复合材料。

均质内聚HA/PLA-PCL复合材料的制备是相同的，只是将PEG-PLA微球替换为PLA-PCL微球(EvonikLC 703 S)。

实施例3.内聚交联HA与交联HA微球复合材料

为了进一步改进配方，根据CN111234271B获得内聚交联透明质酸凝胶(参见实施例2)。2～3％(w/v)透明质酸(MW>1300kDa)溶液用二乙烯基砜(DVS)在碱性环境(2％NaOH溶液,pH＝8.5～10)中在40℃下交联2.5小时。反应结束后，缓慢加入95％乙醇溶液直到析出白色沉淀。将白色沉淀用相同浓度的乙醇溶液洗涤5-10次，过滤得到白色粉末。将白色粉末溶解于PBS(pH＝7.0～7.4)中，经湿热灭菌，得到内聚交联透明质酸钠凝胶。

通过乳化交联反应得到交联的HA微球(按照CN109224127B的实施例1-2制备)。具体地，将1～3％透明质酸(MW>1500kDa)溶液(在PBS中，pH7.2)与交联剂ε-聚赖氨酸和4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)在0.9％氯化钠溶液中按相同摩尔比与HA混合，在5倍体积的有机油硅油和Span 80混合物(v:v＝1.0～2.0:25)中反应，并在30～45℃下，1000-1500rpm搅拌24小时以上。搅拌速度越快，产生的微球直径越小。额外的有机油用正己烷和乙酸乙酯洗涤3次，用无水乙醇洗涤3次。以8,000～10,000rpm离心10分钟后收集交联HA微球。经PBS复水化后，对交联HA微球悬浮液进行过滤，收集合适尺寸(20～50μm)的微球。乙醇沉淀后得到HA微球的白色粉末。

将内聚交联HA凝胶脱水粉末和交联HA微球脱水粉末以(V/V＝1:1)混合，并在PBS中重新溶解，以得到内聚交联HA与交联HA微球复合材料。将组合材料湿热灭菌，以悬浮液形式于2～35℃保存备用。

实施例4.内聚交联HA与交联HA微球复合材料的体外降解

将0.5g(填充物中约0.5mL)实施例3中制备的内聚交联HA与交联HA微球复合材料(V/V＝1:1)添加到7.5mL 300U/mL透明质酸酶(Sigma)的PBS溶液(pH＝7.0～7.2)中并在37℃下反应8小时。10,000rpm离心15分钟后，反应溶液中(目视或通过微滤器过滤)未发现凝胶或微球，复合材料已被透明质酸酶完全降解。

在临床实践中，透明质酸酶无菌溶液被用于降解透明质酸，因此可以被注射到软组织中，以减少未达最佳标准地放置的HA填充物或来逆转局部缺血并发症。可缓慢吸收的聚合物微球能够提供长期效果，然而，植入后很难去除。交联的HA微球可具有类似的耐久性，并且其通过透明质酸酶的可逆性将提高制剂的安全性。

实施例5.交联HA/微球复合材料的动物评估

进行1个月的动物研究以检查组织对实施例1中制备的透明质酸/PLA制剂和市售透明质酸对照(Juvederm)的反应性。测试是在一只健康的新西兰白兔和健康小鼠中进行的。兔模型接受耳部HA/PLA注射。小鼠接受背部皮肤注射。30天后，在马萨诸塞州伍斯特市的大规模组织学服务处对动物实施安乐死，并取出植入物部位进行固定、切片和组织病理学评估。切片用H&E、三色蓝和冯盖森(Von Geison)(弹性纤维网)染色。对所有染色试样进行评估，制备图像并起草病理报告。

一个月后HA和HA+PLA植入物的组织学评估清晰可见，炎症证据有限(图1和2)；在兔子外植体的整个植入物和周围纤维囊中观察到新胶原纤维形成的证据(图3和4)。冯盖森染色染色没有显示与植入物有关的弹性组织的证据(图5和6)。兔模型中HA+PLA的组织学评估显示出胶原纤维散布于植入物的证据(预期的，因为注射物由HA载体中完整PLA组成)。

随着HA的降解，巨噬细胞和肌成纤维细胞整合到空间中，PLA微球被周围组织包围，且巨噬细胞和肌成纤维细胞整合到HA降解的空间中。在PLA微球刺激下观察到新胶原和新组织的形成。

与对照HA(已成功商业化的产品)的效果相比，本发明的HA+PLA植入物的效果至少与对照一样好，甚至更好。

结论：

所有植入物均显示出低至极低水平的炎症反应性。兔模型的HA和HA+PLA植入物显示小的早期胶原纤维散布于植入物，表明部分宿主组织融合或对新生胶原形成的刺激(参见图1：HA对照和图2：HA/PLA植入物)。

PLLA、羟基磷灰石钙(CaHA)、聚己内酯(PCL)微球与载体，例如羧甲基纤维素(CMC)和生理盐水被广泛用作软组织充填中的胶原刺激剂。大多数这些载体材料在植入后经历快速扩散或分散。微球的急性炎症导致异物巨细胞聚集在微球之间和表面上的空间，出现肿胀、发硬、肿块/凸块、疼痛、发红、瘙痒等并发症。

与在体外和体内溶胀并分散有限的内聚交联HA凝胶相比，本发明的具有可缓慢降解聚合物的内聚交联HA减小了微球植入时的比表面积，避免了微球在组织中的移位和扩散，并进一步降低了炎症反应性水平。

与通常由于较低的比表面积而具有耐久性的内聚交联HA相比，本发明的具有可缓慢降解聚合物的内聚交联HA更安全且更持久。注射复合材料后，交联HA首先被身体吸收，新胶原在聚合物微球的刺激下取代植入物，充填皮肤缺陷，并最终在聚合物分子缓慢降解后仍然能够维持植入效果。尽管可缓慢吸收微球被认为具有生物相容性，但它在体内不能快速降解。具有交联微球复合材料的交联HA凝胶可以很容易地被透明质酸酶降解，并使复合材料的植入像普通交联HA凝胶那样可逆。

不希望囿于理论，颗粒的有序排布为免疫相关细胞提供了软组织中的3D空间结构，诱导新胶原生成。分子量大于1,000kDa的透明质酸发挥抗血管生成、免疫抑制和抗炎效果。交联或改性透明质酸通常具有高分子量，并且具有免疫惰性，从而将植入物的刺激降低到较低水平。交联HA与可缓慢吸收微球的组合可从机械和空间趋势调控免疫，缩短植入后的急性免疫期，并改进组合物在软组织充填中的安全性、耐久性和效果。

其它实施方式

虽然参考优选实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员很容易确定本发明的基本特征而不会偏离本发明的精神和范围，且能够对本发明进行各种改变和修饰以使其适于各种用途和条件。本领域技术人员会明白或能够确定采用常规实验即可获得的本文所述本发明具体实施方式的众多等同形式。这些等同形式也意在包含于本发明的范围内。

本说明书中提到的所有参考文献，包括专利、出版物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇独立的出版物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。

选定的现有技术专利

US 5,824,333

US 7,314,636

US 7,887,599

US 8,455,459

US 8,580,289

US 9,480,775

CN 105879124

CN 109503864B

CN 111234271B

CN 109224127B

US 2008/0188416

US 2009/0117188

US 2010/0217403

US 2010/0210588

US 2011/0087152

Claims (16)

1.一种用于软组织充填的组合物，其包含

(i)HA载体，其中所述载体选自透明质酸、改性透明质酸或交联透明质酸，或其盐(例如钠盐)；和

(ii)可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述HA载体具有1,000-10,000,000道尔顿的分子量，和/或

所述HA载体来源于动物组织或微生物发酵。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述改性透明质酸或交联透明质酸是由二乙烯基砜、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、对亚苯基双碳二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷或富含氨基的低聚物(如聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸)改性或交联的；和/或

改性透明质酸或交联透明质酸的浓度为12mg/mL至30mg/mL，优选16mg/mL至24mg/mL；和/或

所述改性透明质酸或交联透明是内聚的。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述微球是交联透明质酸微球，其包被有生物可降解聚合物，例如聚-L-丙交酯(PLA)、聚乙二醇(PEG)或PLGA，或聚对二氧环己酮(PDO)；和/或

其中所述交联透明质酸微球是由乳化交联反应、双乳液蒸发法、微流控交联反应或压印成形制备的；和/或

所述交联透明质酸微球的交联剂选自下组：二乙烯基砜、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚或对亚苯基双碳二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷或富含氨基的低聚物(如聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸)；和/或

其中所述交联的透明质酸微球的粒径为：5～150μm，优选20～50μm。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子选自：聚-L-丙交酯(PLA)、PEG-PLA共聚物或聚-L-丙交酯-羟基磷灰石、聚乙醇酸(PGA)、聚-L-丙交酯-羟基磷灰石、交联的透明质酸微球的颗粒、球体或粒子。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子是：聚丙交酯和聚乙交酯聚合物和共聚物(PLGA)的颗粒、球体或粒子；和/或聚ε-己内酯(PCL)或PCL-PLA共聚物的颗粒、球体或粒子或聚ε-己内酯-羟基磷灰石微球；和/或聚对二氧环己酮(PDO)或聚对二氧环己酮-羟基磷灰石。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子是通过喷雾-沉降技术、乳化法、双乳化蒸发法、微流控反应、固体-凝胶法、熔融挤出技术或压印成形生产的；和/或是通过湿热灭菌、γ射线或环氧乙烷灭菌法灭菌的；和/或

其中所述可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子的直径为5至150μm，优选20至50μm。

8.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含添加剂，例如选自下组的添加剂：

局部麻醉药物，如利多卡因、普鲁卡因等，其浓度优选为0.1重量％至0.5重量％；和/或

多元醇稳定剂，例如甘油、甘露醇、丁二醇、山梨糖醇，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

具有螯合能力的稳定剂，例如EDTA、EGTA、柠檬酸、柠檬酸钠，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

硫稳定剂或溶解促进剂，如硫酸软骨素钠(CS)、硫酸葡萄糖胺(GS)或甲基磺酰基甲烷(MSM)，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

其中通过透析过程添加可溶性小分子。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中HA载体的量为0.1体积％至55体积％；和/或

组合物中可缓慢吸收颗粒、球体或粒子的量为0.1体积％至50体积％，优选1体积％至20体积％；和/或

所述组合物中添加剂为0.1重量％至10重量％，优选0.1体积％至5重量％。

10.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含：

(ia)交联透明质酸；或(ib)内聚性交联HA载体，其通过制得：将透明质酸与二乙烯基砜在碱性环境中交联，然后用乙醇沉淀交联的透明质酸；和

(iia)PLA微球；(iib)PEG-PLA微球；(iic)PLA-PCL微球；或(iid)交联HA微球，其为使用ε-聚赖氨酸和4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)作为交联剂，在有机油(例如橄榄油或硅油)存在下，搅拌下进行乳化交联反应所得；

例如，所述组合物包含(ia)和(iia)；(ia)和(iib)；(ia)和(iic)；或(ib)和(iid)。

11.一种制备如权利要求1-10中任一项所述的组合物的方法，其包括：

将所述HA载体与所述可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子组合。

12.如权利要求11所述的方法，其中利用真空行星式混合器形成可注射的均质凝胶，例如在200rpm～1400rpm的转速和100rpm～700rpm的自转速度下，将所述可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子与所述HA载体组合以形成可注射的均质凝胶；和/或真空混合10～30分钟；和/或

其中将所述可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子添加到所述HA载体的乙醇或甲醇或丙酮沉淀中，并通过透明质酸溶液或0.9％氯化钠溶液或PBS缓冲液重新溶解以形成均质的可注射凝胶。

13.如权利要求11所述的方法，其还包括：

将化学试剂添加到所述可缓慢吸收的颗粒、球体和粒子与所述HA载体的混合物中以进行交联或改性，例如，通过添加选自下组的化学试剂：二乙烯基砜，戊二醛，1,4-丁二醇二缩水甘油醚或对亚苯基双碳二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷或富含氨基的低聚物，聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸；和/或

通过0.9％氯化钠溶液或PBS缓冲液透析，以获得均质的可注射组合物。

14.一种在有需要的对象中充填软组织的方法，其包括将权利要求1-10中任一项所述的组合物注射到需要充填的部位。

15.如权利要求14所述的方法，其中将所述组合物注射入软组织以矫正软组织缺陷；和/或

将所述组合物注射入皮肤以矫正软组织缺陷，所述缺陷包括皱纹、皮肤褶皱、皮肤松弛、不均匀、面部消瘦、脂肪萎缩、脸颊凹陷、眼窝凹陷或其组合。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述组合物能够通过25～27号针头或套筒，例如25、27或30号针头或套筒注射。