CN117844798A - 一种外泌体总rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体总RNA的提取方法。该方法为：步骤1，向重悬的外泌体中加入QIAzol混匀，室温孵育4‑6min，加入氯仿混匀，其中氯仿和QIAzol的体积比为(0.15‑0.25):1，室温孵育3‑5min；离心，将上层水相转移到新的离心管中，加入1.4‑1.6倍体积的酒精，充分混匀；步骤2，吸取混匀液到离心柱中，离心，直到所有混匀液通过离心柱；步骤3，加入BufferRWT，离心，加入RPE，其中RPE和BufferRWT的体积比为(0.5‑1):1，离心，弃离心废液；步骤4，加入78‑85％酒精，离心，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，离心；将离心柱转入新的离心管中，向离心柱膜加入无酶水，孵育1‑2min，离心1‑2min，收集RNA样本。本发明提供的方法用于外泌体RNA提取时具有更好的提取效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种外泌体总RNA的提取方法。
背景技术
胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由细胞释放的具有脂质双分子层膜性小泡，主要分为三类：a.质膜向外出芽和分裂产生的微泡(microvesicles)，直径约100-1000nm；b.来源于晚期内吞体(multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后释放出来的，直径约30-150nm的小型囊泡，又称外泌体；c.细胞凋亡过程中质膜起泡释放的凋亡小体，直径约50nm-2μm。外泌体含有丰富的内容物，包括核酸、蛋白和脂质等。机体在正常和病理条件下均能分泌外泌体，且几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，因此外泌体广泛分布于外周血、尿液、唾液、泪液、脑脊液等体液中。随着二代测序、脂质组学、蛋白组学等技术的发展，外泌体不单是运输清除细胞代谢废物，还在细胞与细胞之间的通信交流中发挥作用，外泌体介导的通讯被认为是癌细胞存活的关键，参与肿瘤的启动、生长、进展和化疗耐药等。因此，外泌体在疾病早期诊断、药物载体、疾病治疗等方面有着广泛的应用前景。
关于RNA抽提纯化的方法主要包括沉淀法、溶剂萃取、超速离心、聚丙烯酰胺凝胶电泳、液相色谱等。其中，异硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶剂萃取是比较常用的方法，但是这种方法会被蛋白、有机溶剂、盐、乙醇、DNA等污染。现在基于离子交换树脂、磁珠、硅膜吸附柱、玻璃珠、玻璃过滤器等方法也被报道用于细胞或组织RNA的抽提。目前用于小型胞外囊泡RNA抽提的常用方法是异硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶剂萃取和硅膜吸附柱，Maria Eldh等关于不同外泌体RNA分离方法的研究显示(PMID：22424315)，miRCURYTM RNA Isolation Kit分离的细胞上清外泌体RNA的总量最高，并且miRCURYTM得到的外泌体miR451 CT值比mirVanaTM(外泌体RNA的总量最低之一)分离的外泌体miR451 CT值低。然而，该方法只研究外泌体RNA中miRNA的CT值，而没有研究外泌体长链编码RNA(Messenger RNA,mRNA)的总RNA抽提方法。寻找适合外泌体总RNA提取的有效方法，对于助力癌症的早期筛查、伴随诊断和预后监测至关重要。
发明内容
本发明的目的是，提供一种外泌体总RNA的提取方法。主要解决现有技术中缺少外泌体总RNA提取的有效方法。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种外泌体总RNA的提取方法，所述方法的步骤如下：
步骤1，向重悬的外泌体中加入QIAzol混匀，室温孵育4-6min，加入氯仿混匀，其中氯仿和QIAzol的体积比为(0.15-0.25):1，室温孵育3-5min；离心，将上层水相转移到新的离心管中，加入1.4-1.6倍体积的酒精，充分混匀；
步骤2，吸取混匀液到离心柱中，离心，直到所有混匀液通过离心柱；
步骤3，加入Buffer RWT，离心，加入RPE，其中RPE和Buffer RWT的体积比为(0.5-1):1，离心，弃离心废液；
步骤4，加入78-85％酒精，离心，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，离心；将离心柱转入新的离心管中，向离心柱膜加入无酶水，孵育1-2min，离心1-2min，收集RNA样本。
作为优选实施方案，采用miRNeasy Micro Kit试剂盒进行外泌体总RNA的提取；该试剂盒为市售产品，购自Qiagen，货号217084。
作为优选实施方案，所述miRNeasy Micro Kit试剂盒提取外泌体总RNA的方法为：
步骤1，向重悬的外泌体中加入700μL QIAzol混匀，室温孵育5min，加入140μL氯仿混匀，室温孵育3min；4℃条件下12000g离心15min，离心结束后，将上层水相转移到新的离心管中，加入1.5倍体积的100％酒精，充分混匀；
步骤2，吸取700μL混匀液到离心柱中，8000g室温离心15秒，弃离心废液，直到所有混匀液通过离心柱；
步骤3，加入700μL Buffer RWT，室温8000g离心15秒，弃离心废液；加入500μLRPE，室温8000g离心15秒，弃离心废液；
步骤4，加入500μL 80％酒精，室温8000g离心2min，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，室温20000g离心5min；将离心柱转入新的1.5mL离心管中，向离心柱膜加入32μL无酶水，室温孵育1min后室温20000g离心1min，收集RNA样本。
作为优选实施方案，所述外泌体为血浆外泌体。
作为优选实施方案，所述血浆外泌体的提取采用上海思路迪生物医学科技有限公司的外泌体提取试剂A21459。
本发明中用到的QIAzol、Buffer RWT、RPE均为试剂盒中的具体组分，QIAzol主要成分是苯酚/异硫氰酸胍，常用于细胞或组织裂解；Buffer RWT主要成分是低浓度的异硫氰酸胍和乙醇，用于清洗离心柱上残留的胍盐、苯酚、氯仿等有机试剂；RPE的主要成分是乙醇，用一定比例的乙醇进一步清洗离心柱。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1，市场上有多种适合于RNA提取的试剂盒，发明人发现不同的提取试剂盒对外泌体的提取存在显著差异，通过文献分析调研，选择四种RNA抽提试剂盒进行外泌体RNA的提取，发现采用miRNeasy Micro Kit抽提试剂盒的RNA提取方法能够实现对外泌体RNA最好的提取效果。
2，本发明研究结果表明：采用miRNeasy Micro Kit抽提体系与外泌体提取试剂A21459相结合，能够从1ml血浆中提取总RNA的产量是6.72ng，比金标准UC组富集的总RNA产量要高；二者抽提的外泌体RNA片段分布一致，以＜200nt的小片段为主。
3，本发明通过研究发现一套适合于外泌体RNA提取的方法体系，弥补了现有技术在mRNA关于血浆外泌体分离和RNA抽提体系上的空白，为临床基于血浆外泌体mRNA的研究提供基础，扩大外泌体在疾病早期诊断、药物载体、疾病治疗等方面的应用。
附图说明
图1是本发明实施例1中6组分离方法获得的外泌体的透射电镜图。
图2是本发明实施例1中6组分离方法获得的外泌体的粒径分布图。
图3是本发明实施例1中四种方法抽提的RNA总量的结果示意图。
图4是本发明实施例1中不同血浆外泌体分离方法的RNA抽提总量结果示意图。
图5是本发明实施例1中不同血浆外泌体分离方法的RNA片段分布示意图。
图6是本发明实施例1中不同血浆外泌体分离方法mRNA相对表达结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1外泌体分离和RNA提取
一、外泌体的分离
收集17例健康人的血液样本，所有健康人的血液样本均采集到10ml抗凝血的真空采血管中(REF367525,BD,USA)，随后样本在4℃低温条件下寄送。对收到的血样首先在4℃条件下1600g离心10min，去除细胞或细胞碎片，其次转移上清液在4℃条件下16000g离心15min，离心后转移上清液到50ml的离心管中，混匀后分装成每管1ml，-80℃冰箱中保存，用于后续外泌体的分离和RNA的抽提。
外泌体的分离方式分为6组：A21459组、UC组、ExoQuick组、Life kit组、miRCURY组、exoRNeasy组，每组三次重复。如未特别说明，以下用到的PBS均为0.01M、PH7.4的缓冲液。
1)A21459组分离血浆外泌体
将分装保存的血浆样本取出，待在37℃水浴锅中至完全融化后，4℃条件下12000g离心10min，离心结束后将清澈血浆转移到新的0.45μm tube filter(Costar,CLS8163-100EA,Corning,USA)，在4℃条件下12000g离心5min收集过滤液，转移过滤液到0.22μmtube filter(Costar,CLS8161-100EA,USA)，同样在4℃条件下12000g离心5min收集过滤液。加入1/4体积的A21459(3Dmed,180038,Shanghai，China)混匀，在4℃条件下3000g离心10min，弃上清液，加入1ml PBS重悬外泌体，再次加入1/4体积的A21459混匀，在4℃条件下3000g离心10min，弃上清液，加入200μL PBS重悬，备用。
2)UC组分离血浆外泌体
将分装保存的血浆样本取出，待在37℃水浴锅中至完全融化后，4℃条件下12000g离心10min，离心结束后将清澈血浆转移到0.45μm tube filter和0.22μm tube filter中，收集过滤液。将过滤液加入到超速离心管(332245A，Hitachi Koki,Japan)中，同时每管加入4ml PBS，并用PBS配平，配平后放置到超速离心机中，设置离心条件120000g，4℃离心2h，离心结束后弃上清，加入200μL PBS重悬，备用。
3)ExoQuick组分离外泌体
将分装保存的血浆样本取出，待在37℃水浴锅中至完全融化后，4℃条件下12000g离心10min，离心结束后将清澈血浆转移到0.45μm tube filter和0.22μm tube filter中，收集过滤液。向过滤后的血浆中加入1/4体积的ExoQuick沉降剂(EXOQ5A-1，SBI，USA)混匀，4℃孵育30min，孵育完成后在4℃条件下1500g离心30min，弃上清液，加入200μL PBS重悬。
4)Life kit组分离血浆外泌体
将分装保存的血浆样本取出，待在37℃水浴锅中至完全融化后，4℃条件下12000g离心10min，离心结束后将清澈血浆转移到0.45μm tube filter和0.22μm tube filter中，收集过滤液。加入1/2体积的PBS混匀，加入1/5体积的Life kit沉降剂(4484450，Lifetechnologies，USA)混匀，4℃孵育30min，孵育完成后室温10000g离心5min，弃上清液，加入200μL PBS重悬，备用。
5)miRCURY组分离血浆外泌体
将分装保存的血浆样本取出，待在37℃水浴锅中至完全融化后，4℃条件下12000g离心10min，离心结束后将清澈血浆转移到0.45μm tube filter和0.22μm tube filter中，收集过滤液。采用Exosome Serum/Plasma Kit(76603，Qiagen，Shanghai,China)分离血浆外泌体。具体为：加入1/100体积的Thrombin(500U/mL)混匀，室温孵育5min，室温10000g离心5min。吸取上清液并加入2/5体积的Precipitation Buffer A混匀，4℃孵育60min，孵育完成后室温500g离心5min，弃上清液，加入200μL PBS重悬。Thrombin和Precipitation Buffer A均是试剂盒中的组分。
6)exoRNeasy组分离血浆外泌体和提取RNA
将分装保存的血浆样本取出，待在37℃水浴锅中至完全融化后，4℃条件下12000g离心10min，离心结束后将清澈血浆转移到0.45μm tube filter和0.22μm tube filter中，收集过滤液。采用exoRNeasy Midi试剂盒(77144，Qiagen，Shanghai,China)分离外泌体并提取RNA，具体方法为：加入等体积的buffer XBP混匀，转移混匀液到exoEasy Midi spincolumn中，室温500g离心1min。弃离心废液，向吸附柱加入3.5ml XWP，室温3000g离心1min，弃离心废液，再次室温3000g离心1min。转移吸附柱到新的管子中，向吸附柱膜加入700μLQIAzol，室温3000g离心5min。转移裂解物到2ml离心管中，室温孵育5min，加入90μL氯仿混匀，室温孵育3min。4℃条件下12000g离心15min，离心结束后，将上层水相转移到新的离心管中，加入2倍体积的100％酒精，充分混匀。吸取700μL混匀液到离心柱中，8000g室温离心15秒，弃离心废液，直到所有混匀液通过离心柱。加入700μL Buffer RWT，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μL RPE，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μL RPE，室温8000g离心2min，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，室温20000g离心5min。将离心柱转入新的1.5mL离心管中，向离心柱膜加入32μL RNase-free water，室温孵育1min后室温20000g离心1min，收集RNA样本。
二、外泌体RNA提取
选择ExoQuick、Life kit、A21459三种方法分离的外泌体分别使用miRNeasyMicro Kit(217084,Qiagen,Shanghai,China)、miRNeasy serum/Plasma kit(217184,Qiagen,Shanghai,China)、RNeasy Mini Kit(74104,Qiagen,Shanghai,China)三种RNA富集方法进行RNA抽提，同时采用exoRNeasy分离小型胞外囊泡RNA。
1)miRNeasy Micro Kit抽提外泌体RNA
向重悬的外泌体中加入700μL QIAzol混匀，室温孵育5min，加入140μL氯仿混匀，室温孵育3min。4℃条件下12000g离心15min，离心结束后，将上层水相转移到新的离心管中，加入1.5倍体积的100％酒精，充分混匀。吸取700μL混匀液到离心柱中，8000g室温离心15秒，弃离心废液，直到所有混匀液通过离心柱。加入700μL Buffer RWT，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μL RPE，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μL 80％酒精，室温8000g离心2min，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，室温20000g离心5min。将离心柱转入新的1.5mL离心管中，向离心柱膜加入32μL RNase-free water，室温孵育1min后室温20000g离心1min，收集RNA样本。
2)miRNeasy serum/Plasma kit抽提外泌体RNA
向重悬的外泌体中加入700μL QIAzol混匀，室温孵育5min，加入90μL氯仿混匀，室温孵育3min。4℃条件下12000g离心15min，离心结束后，将上层水相转移到新的离心管中，加入2倍体积的100％酒精，充分混匀。吸取700μL混匀液到离心柱中，8000g室温离心15秒，弃离心废液，直到所有混匀液通过离心柱。加入700μL Buffer RWT，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μL RPE，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μL RPE，室温8000g离心2min，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，室温20000g离心5min。将离心柱转入新的1.5mL离心管中，向离心柱膜加入32μL RNase-free water，室温孵育1min后室温20000g离心1min，收集RNA样本。
3)RNeasy Mini Kit抽提外泌体RNA
向重悬的外泌体中加入400μL Buffer RLT混匀，室温孵育5min，加入等体积的70％酒精混匀，吸取700μL混匀液到离心柱中，8000g室温离心15秒，弃离心废液，直到所有混匀液通过离心柱。加入700μL Buffer RW1，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μLRPE，室温8000g离心15秒，弃离心废液。加入500μL RPE，室温8000g离心2min，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，室温20000g离心1min。将离心柱转入新的1.5mL离心管中，向离心柱膜加入32μL RNase-free water，室温孵育1min后室温8000g离心1min，收集RNA样本。
三、外泌体分离和RNA抽提结果分析
为了验证本发明建立的A21459血浆外泌体分离方法和RNA抽提体系的效果，从血浆外泌体形态、粒径分布、血浆外泌体RNA抽提总量、片段分布、血浆外泌体RNA相对表达来评估。
血浆外泌体形态特征鉴定：将获得的外泌体用PBS重悬，加入4％多聚甲醛对外泌体进行固定，将外泌体滴到碳包覆的200目电子显微镜铜网上。用PBS清洗铜网2次，用含甘氨酸(50mM)的PBS清洗铜网3min，用含0.5％BSA的PBS再次清洗铜网10min，最后用2％醋酸铀酰对铜网进行染色，染色完成后采用透射电镜(H-7650,Hitachi High-Technologies,Japan)对小型胞外囊泡形态进行特征分析。参见图1，为6组分离方法获得的外泌体的透射电镜图。由图1可以看到：A21459能看到外泌体典型的“马蹄状”形态；另外UC和exoRNeasy均能检测到小型胞外囊泡的典型形态，而沉淀法商品化试剂盒ExoQuick、Life kit、miRCURY则未检测到典型形态。
血浆外泌体粒径分布检测：首先将外泌体用PBS稀释到1*10^7-1*10^9/ml，吹打混匀。随后，打开NTA(NanoSight NS300,Malvern,UK)仪器将稀释后的样本注入样本室，使用488nm激发模块，设置照相机的镜头参数，快门值选择890，增益值选择146，检测阈值设置为7。每个视频至少分析和获得200个完整的轨道。最后，使用NTA分析软件(version 2.3)对外泌体的纳米粒子跟踪数据进行分析。参见图2，为6组分离方法获得的外泌体的粒径分布图。由图2可以看到：A21459分离的外泌体粒径主峰是124nm，符合外泌体的粒径分布；另外五组分离方法获得的外泌体粒径主峰均符合小型胞外囊泡的粒径分布，但exoRNeasy分离的外泌体平均粒径最大。
血浆外泌体RNA抽提总量和片段分布特征：采用安捷伦2100分析仪及Agilent RNA6000 Pico Kit(5067-1513,Agilent,USA)检测外泌体RNA的浓度及片段分布特征。参见图3，为四种方法抽提的RNA总量的结果示意图。由图3可以看到：miRNeasy Micro Kit方法抽提的外泌体RNA总量最高，显著性高于另外三种方法抽提的RNA总量。
将UC、miRCURY、ExoQuick、Life kit、A21459分离的外泌体使用miRNeasy MicroKit进行RNA抽提，并与exoRNeasy分离外泌体RNA结果进行分析。参见图4和图5，其中图4为不同血浆外泌体分离方法的RNA抽提总量结果示意图，图5为不同血浆外泌体分离方法的RNA片段分布示意图。由图4和图5可以看到：从1ml血浆中A21459分离的外泌体RNA总量为6.72ng，比金标准UC组分离的RNA总量高但无显著性差异，且A21459分离的外泌体RNA片段分布与金标准UC组一致。沉淀法商品化试剂盒ExoQuick、Life kit、miRCURY分离的外泌体RNA总量高于金标准UC组，exoRNeasy分离的外泌体RNA总量最低但均无显著性差异(图4)，但是沉淀法商品化试剂盒ExoQuick、Life kit、miRCURY分离的外泌体RNA大片段居多，exoRNeasy分离的外泌体RNA片段分布与UC组类似。
血浆外泌体RNA内容物检测：采用qPCR检测外泌体mRNA的相对表达。抽提好的外泌体RNA先去除基因组DNA，随后反转录为cDNA模板，最后采用ABI 7500进行荧光定量。根据exoRBase 2.0数据库RNA-seq的结果挑选在健康人胞外囊泡高表达(TPM平均值是25040.53)的HBB一个mRNA。以GAPDH作为内参，UC外泌体分离方法作为对照组，根据公式2^(-ΔΔCT)计算其余5组分离方法目的基因的相对表达。参见图6，为不同血浆外泌体分离方法mRNA相对表达结果示意图。图6结果表明：A21459组HBB的相对表达与金标准UC组一致，表明基于化学沉淀法建立的A21459分离的血浆外泌体RNA能够用于下游mRNA分析。另外四种外泌体分离方法中，沉淀法商品化试剂盒ExoQuick组、exoRNeasy组HBB的相对表达与金标准UC组相比是显著性升高的，沉淀法商品化试剂盒Life kit组和miRCURY组HBB的相对表达与金标准UC组一致。
从血浆外泌体形态、粒径、RNA的总量、片段分布以及RNA内容物五个方面综合来看，基于化学沉淀法建立的A21459分离血浆外泌体以及采用miRNeasy Micro Kit方法抽提RNA是一套适合于外泌体RNA提取的方法体系。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (5)
1.一种外泌体总RNA的提取方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
步骤1，向重悬的外泌体中加入QIAzol混匀，室温孵育4-6min，加入氯仿混匀，其中氯仿和QIAzol的体积比为(0.15-0.25):1，室温孵育3-5min；离心，将上层水相转移到新的离心管中，加入1.4-1.6倍体积的酒精，充分混匀；
步骤2，吸取混匀液到离心柱中，离心，直到所有混匀液通过离心柱；
步骤3，加入Buffer RWT，离心，加入RPE，其中RPE和Buffer RWT的体积比为(0.5-1):1，离心，弃离心废液；
步骤4，加入78-85％酒精，离心，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，离心；将离心柱转入新的离心管中，向离心柱膜加入无酶水，孵育1-2min，离心1-2min，收集RNA样本。
2.根据权利要求1所述的外泌体总RNA的提取方法，其特征在于：采用miRNeasyMicroKit试剂盒进行外泌体总RNA的提取。
3.根据权利要求3所述的外泌体总RNA的提取方法，其特征在于，所述miRNeasyMicroKit试剂盒提取外泌体总RNA的方法为：
步骤1，向重悬的外泌体中加入700μL QIAzol混匀，室温孵育5min，加入140μL氯仿混匀，室温孵育3min；4℃条件下12000g离心15min，离心结束后，将上层水相转移到新的离心管中，加入1.5倍体积的100％酒精，充分混匀；
步骤2，吸取700μL混匀液到离心柱中，8000g室温离心15秒，弃离心废液，直到所有混匀液通过离心柱；
步骤3，加入700μLBufferRWT，室温8000g离心15秒，弃离心废液；加入500μL RPE，室温8000g离心15秒，弃离心废液；
步骤4，加入500μL 80％酒精，室温8000g离心2min，弃离心废液，将离心柱转入新的收集管中，室温20000g离心5min；将离心柱转入新的1.5mL离心管中，向离心柱膜加入32μL无酶水，室温孵育1min后室温20000g离心1min，收集RNA样本。
4.根据权利要求1-3任一项所述的外泌体总RNA的提取方法，其特征在于：所述外泌体为血浆外泌体。
5.根据权利要求4所述的外泌体总RNA的提取方法，其特征在于：所述血浆外泌体的提取采用上海思路迪生物医学科技有限公司的外泌体提取试剂A21459。
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