CN111172112B

CN111172112B - 一种外泌体的全转录组表达谱及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111172112B
Application number: CN201911146551.8A
Authority: CN
Inventors: 潘庆军; 刘华锋; 廖淑珍; 招春飞; 陈小群; 陆兴; 杨陈
Original assignee: Affiliated Hospital of Guangdong Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Guangdong Medical University
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: CN111172112A

Abstract

本发明公开了一种活化的嗜碱性粒细胞释放的外泌体的制备方法，包括步骤：采用负选的方法从正常人抗凝的外周血中制备嗜碱性粒细胞，经Anti‑IgE刺激活化，采用无血清培养基于37℃含5％的CO₂培养箱中培养12～48小时，然后收集细胞培养液的上清，室温300g条件下离心，收集离心后培养液上清，经超速离心即得；本发明还公开了上述外泌体的全转录组表达谱及其构建方法。本发明首次成功分离并鉴定出人嗜碱性粒细胞所释放的外泌体，且首次建立了人嗜碱性粒细胞所释放的外泌体全转录组表达谱，鉴定了多个活化后差异表达的RNA，为进一步研究活化的嗜碱性粒细胞在疾病发生中与靶细胞作用的分子机制提供新的靶点。

Description

一种外泌体的全转录组表达谱及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及转录组技术领域，尤其是一种活化的嗜碱性粒细胞释放的外泌体的全转录组表达谱及其构建方法和应用。

背景技术

嗜碱性粒细胞(Basophil，Ba)是外周血白细胞中的一个小群体，是过敏性疾病的主要效应细胞。近年来，其在免疫调节方面的功能引起了研究者极大的关注。研究发现，嗜碱性粒细胞在类风湿关节炎及系统性红斑狼疮患者病例及小鼠模型中异常活化且与疾病活动有关；活化的嗜碱性粒细胞可通过影响Th1/Th2平衡参与RA的发展；可促使B细胞分化成熟为浆细胞并与IL-3协同作用增强抗体产生。多种途径可以介导嗜碱性粒细胞的活化，但是IgE途径是最主要的介导其活化的途径之一，也是目前报道最广泛的。嗜碱性粒细胞通过IgE高亲和力受体FcεRI与IgE-抗原复合物交联，可激活一系列信号通路，包括信号分子Fyn、Syk、Lyn、PI3k和Akt等，共同诱导嗜碱性粒细胞活化，进而参与疾病发生发展。不同疾病状态下，活化是嗜碱性粒细胞发挥其生物学功能的关键步骤。

活化的嗜碱性粒细胞可产生多种效应分子，理论上可通过3种主要交流模式作用于靶细胞：①通过“分泌可溶性信号分子”(一系列细胞因子和过敏相关的活性介质等)作用于靶细胞发挥作用；②细胞表面上调表达一些功能分子(CD62L，CD40/CD40L和MHC-II等)，通过“与靶细胞之间的直接接触”发挥作用，另外也会上调表达一些活化相关的标记物(CD203c和CD63等)；③释放外泌体(exosomes)—一类新近发现的细胞间的交流模式，可将其携带的内容物(蛋白或核酸等)传递给受体细胞，在细胞间起到通讯和免疫调节的作用。

外泌体是一类直径约30～150nm的具有完整膜结构的细胞外囊泡，其内包裹有来源细胞特异的多种核酸、脂质及蛋白质等。外泌体是细胞通讯的重要工具，可通过携带来源细胞的内容物，将携带的内容物传递给受体细胞，部分执行与来源细胞相似的生物学功能，发挥多种功能，被认为是用于疾病诊断和预后判断的细胞间通讯和循环生物标志物的重要载体；临床应用上还有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。目前，尚未有嗜碱性粒细胞活化释放外泌体的报道。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种活化的嗜碱性粒细胞释放的外泌体及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种活化的嗜碱性粒细胞释放的外泌体的制备方法，包括如下步骤：

1)外周血嗜碱性粒细胞的制备、活化和培养：采用负选的方法从正常人抗凝的外周血中制备嗜碱性粒细胞，经Anti-IgE刺激活化，采用无血清培养基于37℃含5％的CO₂培养箱中培养12～48小时；

2)收集细胞培养的上清：收集步骤1)细胞培养液的上清，室温条件下离心，收集离心后培养液上清；

3)制备外泌体：取步骤2)所得培养液上清，超速离心即得所述外泌体。

优选地，所述步骤3)中超速离心转速为100000g。

优选地，所述步骤2)中离心转速为300g。

优选地，所述步骤1)中Anti-IgE的浓度为1μg/mL。

在另一个方面，本发明提供了根据上述的制备方法制得的外泌体。

在第三个方面，本发明提供了上述外泌体的全转录组表达谱的构建方法，包括如下步骤：

S1、采用Trizol法抽提外泌体的总RNA；

S2、外泌体全转录组测序：采用Illumina HiSeq测序仪检测步骤S1所得总RNA；

S3、分析外泌体全转录组差异：从步骤S2的Illumina HiSeq测序仪上取得原始reads，以总reads数进行样品的标准化，并进行log2转化，获得标准化reads数，从而建立Control组及Anti-IgE组外泌体mRNA、lncRNA、circRNA、microRNA表达谱；并在样品间进行比较，利用标准化的reads数，计算倍数变化，以倍数变化、P-value作为差异基因筛选阈值，从而分别筛选出差异表达基因，即得；

其中，Control组为人嗜碱性粒细胞活化前释放的外泌体组；Anti-IgE组为人嗜碱性粒细胞活化后释放的外泌体组。

优选地，所述步骤S3中，mRNA和lncRNA对应的倍数变化为大于或等于2、P-value小于或等于0.05。

优选地，所述步骤S3中，circRNA对应的倍数变化为大于或等于2、P-value小于或等于0.1。

优选地，所述步骤S3中，microRNA对应的倍数变化为大于或等于2、P-value小于或等于0.05。

在第四个方面，本发明提供了活化的人嗜碱性粒细胞释放的外泌体的全转录组表达谱，与未经活化的人嗜碱性粒细胞释放的外泌体的全转录组表达谱相比：

(1)mRNA中有11个显著上调：ENSG00000000971、ENSG00000002549、ENSG00000003400、ENSG00000003436、ENSG00000003989、ENSG00000004700、ENSG00000004948、ENSG00000005302、ENSG00000005893、ENSG00000006327、ENSG00000006611、ENSG00000008394；9个显著下调：ENSG00000001626、ENSG00000002746、ENSG00000003137、ENSG00000004809、ENSG00000004846、ENSG00000004939、ENSG00000005102、ENSG00000005108、ENSG00000005379；

(2)lncRNA中有7个显著上调：ENST00000363624、ENST00000432530、ENST00000488188、ENST00000488188、ENST00000488188、ENST00000488188、ENST00000488188；5个显著下调：ENST00000419119、ENST00000420829、ENST00000422854、ENST00000436590、ENST00000440350；

(3)circRNA中有8个显著上调：hsa_circ_0000002、hsa_circ_0007755、hsa_circ_0000128、hsa_circ_0006892、hsa_circ_0000196、hsa_circ_0002665、hsa_circ_0000255、hsa_circ_0000267；5个显著下调：hsa_circ_0003287、chrM:14530-14807+、chrM:14056-14263-、chrM:14068-14446-、chrM:14068-14827+；

其中chrM:14530-14807+、chrM:14056-14263-、chrM:14068-14446-、chrM:14068-14827+为首次鉴定的circRNA，具体序列见表2；

(4)microRNA中有10个显著上调：hsa-let-7g-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-1273h-3p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-1299、hsa-miR-novel-chr10_1135、hsa-miR-novel-chr10_1755、hsa-miR-novel-chr10_1837、hsa-miR-novel-chr10_1869；8个显著下调：hsa-let-7d-3p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-novel-chr15_10685、hsa-miR-novel-chr1_20274、hsa-miR-novel-chr1_21463；

其中，hsa-miR-novel-chr10_1135、hsa-miR-novel-chr10_1755、hsa-miR-novel-chr10_1837、hsa-miR-novel-chr10_1869、hsa-miR-novel-chr15_10685、hsa-miR-novel-chr1_20274、hsa-miR-novel-chr1_21463为首次鉴定的microRNA，具体序列见表2。

在第五个方面，本发明提供了上述的表达谱中RNA作为靶标在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明首次成功分离并鉴定出人嗜碱性粒细胞所释放的外泌体，并认为其生物学功能极有可能主要通过活化后释放大量的外泌体而实现的。

本发明首次建立了人嗜碱性粒细胞所释放的外泌体全转录组表达谱，可准确全面地了解IgE途径介导人嗜碱性粒细胞活化前后释放的外泌体中的全转录组学表达谱的改变，鉴定了多个活化后差异表达的RNA，为进一步研究活化的嗜碱性粒细胞在疾病发生中与靶细胞作用的分子机制提供新的靶点。

具体实施方式

本发明首次成功分离并鉴定出人外周血嗜碱性粒细胞活化前后释放的外泌体，并认为其生物学功能极有可能主要通过活化后释放大量的外泌体而实现的。另外，通过对外泌体中某一个或几个相关RNA研究，无法系统阐明其参与疾病的分子机制，更无法阐明活化的嗜碱性粒细胞释放外泌体对靶细胞的作用机制。本发明进一步提供人嗜碱性粒细胞所释放的外泌体全转录组表达谱分析，有利于全面了解嗜碱性粒细胞活化前后全转录组学表达谱的改变，通过对表达谱差异表达分析、序列特征分析及功能富集分析，可以进一步研究嗜碱性粒细胞在疾病发生中与靶细胞作用的分子机制。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。如无特别说明，本发明中的试剂或材料均可从市场上或其它公开渠道获得。

实施例1

本发明中嗜碱性粒细胞所释放的外泌体全转录组表达谱的构建方法的一种实施例，包括步骤：人外周血嗜碱性粒细胞的制备、活化和培养，收集细胞培养的上清，制备外泌体，抽提外泌体的总RNA，外泌体全转录组测序，分析全转录组表达谱的变化。

本实施例提供的人嗜碱性粒细胞活化前释放的外泌体组为Control 1，Control2，Control 3，与之对应的基人嗜碱性粒细胞活化后释放的外泌体组为Anti-IgE 1，Anti-IgE 2，Anti-IgE 3。

其中，人外周血嗜碱性粒细胞的制备、活化和培养，包括以具体下步骤：

(1)标本采集：在获得健康志愿者的知情同意后，采集EDTA抗凝的外周静脉血，备用；

(2)多型核细胞的制备:将抗凝血置于15ml的离心管中，加入Hetasep^TM分离液(按分离液：抗凝血为1:5添加)(STEMCELL Technologies,Canada)；放入离心机中(室温，90g×5min)水平离心；从离心机中取下后常温静置10min；取上清，加入至少4倍体积的Easysep^TMbuffer(STEMCELL Technologies,Canada)，室温120g×10min离心，弃上清；重复2次；将细胞浓度调整为5×10⁷个/ml重悬于Easysep^TMbuffer，移入流式管中；

(3)采用EasySep^TMHuman Basophil Isolation Kit(STEMCELL Technologies,Vancouver,BC,Canada)分离嗜碱性粒细胞：加“EasySep^TMHuman Basophil IsolationCocktail”50μl/ml细胞悬液，吹打混匀，在常温孵育7min；将Vortex Rapidspheres在混旋器上震荡混匀30秒，加“Vortex Rapidspheres”50μl/ml细胞悬液，轻轻吹打混匀；再加Easysep^TMbuffer调节细胞悬液体积至2.5ml，轻轻吹打混匀，放入EasySep^TMMagnet磁极中，常温放置3min；将整个磁极拿起，轻轻倾斜倒出细胞悬液于新的流式管中(不可管碰管，否则混入其他细胞影响纯度)，再将新流式管放于磁极中，室温放置3min；重复3次；最后富集的细胞悬液就是嗜碱性粒细胞；

(4)嗜碱性粒细胞纯度鉴定：取富集前及富集后细胞悬液各100ul于流式管中，避光依次加入CD123 Monoclonal Antibody(6H6)-FITC(eBioscience^TM,U.S.A)及CD203cMonoclonal Antibody(NP4D6)-PE(eBioscience^TM,U.S.A)，轻轻震荡混匀，在室温下避光摇床孵育30min；各管添加4ml PBS，室温300g×6min离心洗涤；弃上清，加300μl PBS重悬细胞，震荡混匀后用流式细胞仪上机检测；根据前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)在散点图中对白细胞群进行设门，再以CD123和CD203c双阳性(CD123⁺CD203c⁺)确定为嗜碱性粒细胞群设门，分别记录富集前及富集后嗜碱性粒细胞比例；

(5)嗜碱性粒细胞的活化和培养：富集后细胞分两组，Anti-IgE组经Anti-HumanIgE(ε-chain specific)(Sigma,UK)活化，工作浓度1μg/mL，Control组加入同等体积PBS，用细胞计数板计嗜碱性粒细胞富集后的数量，并调整细胞浓度为5.0×10⁵个/ml，采用无血清培养基于37℃含5％的CO₂培养箱中培养48小时，同时添加IL-3(终浓度为10ng/ml)维持嗜碱性粒细胞的存活，培养48小时后换液，室温300g条件下离心10分钟，收集培养上清，存于-80℃备用；

制备外泌体，抽提外泌体的总RNA，外泌体全转录组测序，具体步骤如下：

(1)实验设3个生物重复，分别用超速离心法分离出人外周血嗜碱性粒细胞Control组及Anti-IgE组的外泌体，并通过透射电子显微镜观察其大小为30-150nm、形态为典型的囊泡状圆形结构；Nanosight NS300分析其粒径为30-150nm、浓度为10⁹particles/ml的大量小囊泡；Western Blot检测其表达外泌体特征蛋白标记CD81、CD63、TSG101；

(2)用Trizol法分别抽提Control组及Anti-IgE组外泌体总RNA，使用

rRNA Depletion Kit(New England Biolabs，Inc.,Massachusetts，USA)移除总RNA中的rRNAs；使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina，USA)，以rRNA-depleted RNAs构建RNA测序文库；使用BioAnalyzer 2100仪器(AgilentTechnologies，美国)进行文库质控和定量；在Illumina HiSeq测序仪上进行150bp双端reads测序。microRNA测序文库需另外制备，包括以下步骤：1)3'接头连接；2)5'接头连接；3)cDNA合成；4)PCR扩增；5)回收～150bp的PCR扩增片段(对应～22nt的miRNAs)；将文库变性为单链DNA分子，在Illumina flow cell上捕获，原位扩增为簇(cluster)，并根据供应商操作说明，在Illumina HiSeq测序仪上进行50cycle测序。

(3)从Illumina HiSeq测序仪上收获原始reads，本发明以总reads数进行样品的标准化，并进行log2转化，获得标准化reads数，从而建立Control组及Anti-IgE组外泌体mRNA、lncRNA、circRNA、microRNA表达谱；并在3组样品间进行比较，对于两个样品，利用标准化的reads数，计算倍数变化(fold change)，以倍数变化、P-value作为差异基因筛选阈值，从而分别筛选出差异表达基因。

本实施例通过高通量转录组测序，获得了RNA-seq reads数，并通过FPKM标准化，且根据Ensembl中已注释的mRNA，计算并建立人嗜碱性粒细胞释放的外泌体中mRNA的表达谱；以倍数变化(fold change)>＝2.0，即log(FC)>＝1.0，p-value<＝0.05，及FPKM值至少在一个样品中>＝0.1作为差异筛选的阈值，挑选差异表达mRNA，结果显示鉴定出20个差异表达的mRNA(11个上调，9个下调)，具体结果见表1；

本实施例通过高通量转录组测序，检测到每个lncRNA的reads数，并通过FPKM标准化，且根据Ensembl中已注释的lncRNA，计算并建立人外周血嗜碱性粒细胞释放的外泌体中lncRNA的表达谱；以倍数变化(fold change)>＝2.0，即log(FC)>＝1.0，p-value<＝0.05，及FPKM值至少在一个样品中>＝0.1作为差异筛选的阈值，挑选差异表达lncRNA，结果显示共筛选出12个差异表达的lncRNA(7个上调，5个下调)，具体结果见表1；

本实施例通过高通量转录组测序，检测到circRNA的junction reads数，标准化后进行log2转化，获得标准化reads数，并在样品间进行比较，然后根据环状RNA的基因组位置，以circBase数据库和circ2Trait环状RNA-疾病数据库链接鉴定的环状RNA，建立了人嗜碱性粒细胞释放的外泌体中circRNA的表达谱；以倍数变化(fold change)>＝2.0，即log(FC)>＝1.0，p-value<＝0.1，作为差异筛选的阈值，挑选差异表达circRNA，结果显示共筛选出13个差异表达的circRNAs(8个上调，5个下调)，具体结果见表1；

本实施例通过高通量转录组测序，得到每个成熟miRNA的比对tag数，以比对数作为成熟miRNA的原始表达量，以TPM(tag counts per million aligned miRNA)方法进行标准化后，建立了人嗜碱性粒细胞释放的外泌体中miRNA的表达谱；以倍数变化>＝2.0，P-value<＝0.05作为差异miRNA筛选阈值，挑选差异表达miRNA，结果显示共筛选出18个差异表达的miRNAs(10个上调，8个下调)，具体结果见表1。

表1人嗜碱性粒细胞所释放的外泌体全转录组差异表达谱

表2人嗜碱性粒细胞所释放的外泌体差异表达RNA分子序列

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东医科大学附属医院

<120> 一种外泌体的全转录组表达谱及其构建方法和应用

<130> 2019

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 278

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

cucccccaaa auucagaaua auaacacacc cgaccacacc gcuaacaauc aguacuaaac 60

ccccauaaau aggagaaggc uuagaagaaa accccacaaa ccccauuacu aaacccacac 120

ucaacagaaa caaagcauac aucauuauuc ucgcacggac uacaaccacg accaaugaua 180

ugaaaaacca ucguuguauu ucaacuacaa gaacaccaau gaccccaaua cgcaaaauua 240

acccccuaau aaaauuaauu aaccacucau ucaucgac 278

<210> 2

<211> 208

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

gauccuauug gugcgggggc uuuguaugau uaugggcguu gauuaguagu gguuacuggu 60

ugaacauugu uuguuggugu auauauugua auugagauug cucgggggaa uagguuaugu 120

gauuaggagu aggguuagga ugagugggaa gaagaaagag aggaaguaaa guuuaauuau 180

gccuuuuugg guugagguga ugauggag 208

<210> 3

<211> 378

<212> RNA

<213> 智人

<400> 3

gaguauccug aggcaugggg gucagggguu gaggucuugg ugaguguuuu agugggguug 60

cgauggaggu aggauuggug cuguggguga aagaguauga ugggguggug guugugguaa 120

acuuuaauag uguaggaagc ugaauaauuu augaaggaga ggggucaggg uugauucggg 180

aggauccuau uggugcgggg gcuuuguaug auuaugggcg uugauuagua gugguuacug 240

guugaacauu guuuguuggu guauauauug uaauugagau ugcucggggg aauagguuau 300

gugauuagga guaggguuag gaugaguggg aagaagaaag agaggaagua aaguuuaauu 360

augccuuuuu ggguugag 378

<210> 4

<211> 760

<212> RNA

<213> 智人

<400> 4

cucaacccaa aaaggcauaa uuaaacuuua cuuccucucu uucuucuucc cacucauccu 60

aacccuacuc cuaaucacau aaccuauucc cccgagcaau cucaauuaca auauauacac 120

caacaaacaa uguucaacca guaaccacua cuaaucaacg cccauaauca uacaaagccc 180

ccgcaccaau aggauccucc cgaaucaacc cugaccccuc uccuucauaa auuauucagc 240

uuccuacacu auuaaaguuu accacaacca ccaccccauc auacucuuuc acccacagca 300

ccaauccuac cuccaucgcu aaccccacua aaacacucac caagaccuca accccugacc 360

cccaugccuc aggauacucc ucaauagcca ucgcuguagu auauccaaag acaaccauca 420

uucccccuaa auaaauuaaa aaaacuauua aacccauaua accuccccca aaauucagaa 480

uaauaacaca cccgaccaca ccgcuaacaa ucaguacuaa acccccauaa auaggagaag 540

gcuuagaaga aaaccccaca aaccccauua cuaaacccac acucaacaga aacaaagcau 600

acaucauuau ucucgcacgg acuacaacca cgaccaauga uaugaaaaac caucguugua 660

uuucaacuac aagaacacca augaccccaa uacgcaaaau uaacccccua auaaaauuaa 720

uuaaccacuc auucaucgac cuccccaccc cauccaacau 760

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<400> 5

aaggagaggg aggggcggga c 21

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<400> 6

gugccuggcg ugacucgac 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

cggggcggcg gcgguggcg 19

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 8

cucagguggc uggugguacg ugc 23

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 9

uucugaucuu cacucccugu gc 22

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<400> 10

agggccuggu ugaagaaga 19

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人

<400> 11

uaggcaaaua gaucuguaga 20

Claims

1.一种活化的嗜碱性粒细胞释放的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）外周血嗜碱性粒细胞的制备、活化和培养：采用负选的方法从正常人抗凝的外周血中制备嗜碱性粒细胞，经Anti-IgE刺激活化，采用无血清培养基于37℃含5%的CO₂培养箱中培养12～48小时；

2）收集细胞培养的上清：收集步骤1）细胞培养液的上清，室温条件下离心，收集离心后培养液上清；

3）制备外泌体：取步骤2）所得培养液上清，超速离心即得所述外泌体；

所述步骤1)中Anti-IgE的浓度为1μg/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中超速离心转速为100000g。

3.根据权利要求1～2任一项所述的制备方法制得的外泌体。

4.权利要求3所述的外泌体的全转录组表达谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、采用Trizol法抽提外泌体的总RNA；

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，mRNA和lncRNA对应的倍数变化为大于或等于2、P-value小于或等于0.05。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，circRNA对应的倍数变化为大于或等于2、P-value小于或等于0.1。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，microRNA对应的倍数变化为大于或等于2、P-value小于或等于0.05。