CN117778589A - 一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂、试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂、试剂盒和检测方法，属于分子标记技术领域。本发明提供了与猪经济性状关联的突变位点的检测试剂，并将所述检测试剂和内切酶制备成经济性状关联突变位点检测试剂盒。本发明还提供了猪的经济性状关联突变位点检测方法。利用PCR扩增后猪WIP1、TRIM55、GAS7的基因片段在不同个体间具有位点差异，以限制性内切酶进行酶切，采用PCR或多重PCR方法分析鉴定猪的SNP，从分子生物学层面上将形态上不易区分的野生型、纯和突变型与杂合突变型进行区分，具有操作简单，鉴定直观，无需测序的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂、试剂盒和检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。这种变异可能会影响DNA的转录过程进而影响蛋白质的合成，最终改变代谢过程，对个体的性状产生影响，因此SNP的检测在畜牧生产中极其重要。目前SNP的检测方法主要有测序法、芯片法、基于酶学的检测方法、高分辨率溶解曲线法(High ResolutionMelting，HRM)、变性高效液相色谱、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等。
限制性片段长度多态性(RFLP)是基于酶学的检测方法技术的一种，是由于个体的基因突变引起酶切位点的改变，最终导致酶切片段的数量和长度的差异，可以用来检测DNA序列的突变情况。不同个体的DNA序列用相同的酶酶切后得到的产物跑胶后可以得到不同的片段数量和大小，在人上常用来诊断疾病，例如诊断人的镰刀红细胞贫血症。在动物遗传育种中也有应用，限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)是一种经典的基因型检测方法，具有分型技术简单、结果稳定、特异性好、灵敏度高、对检材质量要求低等优点。PCR-RFLP法是以PCR为基础的RFLP，此技术先用两个特定引物扩增基因组DNA，然后用合适的限制性内切酶酶切扩增产物，电泳检测基因多态性。
目前PCR-RFLP已经被广泛应用于猪育种实践中，早在1995年研究人员就利用几根猪毛使用PCR-RFLP方法鉴定了猪氟烷基因的基因型，1997年研究人员采用PCR-RFLP技术鉴别了RTRI的基因型。在2006～2009年，研究人员分别利用PCR-RFLP技术鉴定中国本地猪种和长白猪、大白猪的雌激素受体基因和卵泡促激素β亚基基因的多态性，并研究了这两个基因对断奶仔猪存活率的影响，PCR-RFLP在猪的遗传育种中发挥了巨大的作用。
然而，目前基于PCR-RFLP的SNP检测技术在一次检测中只能检测出一个SNP，但猪的某一生长性状往往与多个位点有关，当需要对多个位点进行检测时，需要单独对每个位点所在序列进行PCR扩增、酶切、电泳。因此亟待开发出一种能够实现同时检测多个位点的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂、试剂盒和检测方法，无需测序仅从分子生物学层面上就能将形态上不易区分的野生型、纯和突变型与杂合突变型进行区分，具有操作简单，鉴定直观的优点。
本发明提供了一种与猪经济性状关联的突变位点的检测试剂，包括针对以下至少一个基因的突变位点设计的特异性引物对：WIP1、TRIM55和GAS7；
所述WIP1包括SEQ ID No.1所示的序列，所述TRIM55包括SEQ ID No.2所示的序列，所述GAS7包括SEQ ID No.3所示的序列。
优选的，所述WIP1的特异性引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的WIP1-F和SEQ ID No.5所示的WIP1-R；
所述TRIM55的特异性引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的TRIM55-F和SEQ ID No.7所示的TRIM55-R；
所述GAS7的特异性引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的GAS7-F和SEQ IDNo.9所示的GAS7-R。
本发明提供了一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂盒，包括上述检测试剂，还包括与特异性引物对上酶切位点对应的限制性内切酶。
优选的，所述限制性内切酶包括ScaⅠ-HF(NEB，R3122V)、BstUI(NEB，R0518V)和HindIII(NEB，R0104V)。
本发明还提供了一种猪的经济性状关联突变位点检测方法，包括利用PCR或多重PCR方法，扩增猪WIP1、TRIM55和GAS7的至少一条基因片段，使用限制性内切酶酶切每个基因的扩增产物，根据酶切片段确认猪WIP1、TRIM55和GAS7的至少一个基因对应的上述SNP类型；
所述扩增用特异性引物对来自于上述检测试剂或上述经济性状关联突变位点检测试剂盒；
所述限制性内切酶来自于上述经济性状关联突变位点检测试剂盒。
优选的，所述PCR的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸5s，30～35循环；72℃终延伸3min。
优选的，所述PCR的体系以50μL计，包括：2×RapidTaq MasterMix 25μL(Vazyme，P222)、上下游引物(10μM)各1μL、模板10ng和余量的H2O。
优选的，所述多重PCR的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火90s，72℃延伸30s，30～35循环；72℃终延伸10min。
优选的，所述多重PCR的体系以50μL计，包括：2×Multiplex Buffer 25μL(Vazyme，PM101)、Multiplex DNAPolymerase(Vazyme，PM101)1μL、每条引物(10μM)0.5μL、模板10ng和余量的H2O。
本发明还提供了上述检测试剂或上述经济性状关联突变位点检测试剂盒在区分猪经济性状SNP位点为野生型、纯和突变型与杂合突变型中的应用。
有益效果：本发明提供了与猪经济性状关联的突变位点的检测试剂，并将所述检测试剂和内切酶制备成检测试剂盒，结合前人报导与本课题组研究，选择了三个SNP位点为检测目标，分别为：与猪背膘厚相关的WIP1(也称PPM1D)基因中的rs 334589942位点(T>G)；与腿臀比率、背膘厚相关的TRIM55基因的rs 326263523位点(A>G)；与眼肌厚相关的GAS7基因的rs 81437379位点(T>C)，利用PCR扩增后猪WIP1、TRIM55、GAS7的基因片段在不同猪个体间具有位点差异，以限制性内切酶进行酶切，采用多重PCR-RFLP方法分析鉴定猪，从分子生物学层面上将形态上不易区分的野生型、纯和突变型与杂合突变型进行区分，具有操作简单，鉴定直观，无需测序的优点。
附图说明
图1为各基因不同基因型的突变位点基因型和酶切片段长度对应图；
图2为WIP1基因酶切电泳预想图、电泳图与所用样品测序结果图；
图3为TRIM55基因酶切电泳预想图、电泳图与所用样品测序结果图；
图4为GAS7基因酶切电泳预想图、电泳图与所用样品测序结果图；
图5为WIP1和GAS7基因双酶切电泳预想图、电泳图与所用样品测序结果图；
图6为WIP1和TRIM55基因双酶切电泳预想图、电泳图与所用样品测序结果图；
图7为GAS7和TRIM55基因双酶切电泳预想图、电泳图与所用样品测序结果图；
图8为WIP1、TRIM55和GAS7基因三酶切电泳预想图、电泳图与所用样品测序结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种与猪经济性状关联的突变位点的检测试剂，包括针对以下至少一个基因的突变位点设计的特异性引物对：WIP1、TRIM55和GAS7；所述WIP1包括SEQ IDNo.1所示的序列
加粗部分为SNP位点及其突变类型，下划线部分为ScaⅠ-HF内切酶识别序列，识别序列为AGT^ACT，^表示酶切位点)，K表示T/G；所述TRIM55包括SEQ ID No.2所示的序列
加粗部分为SNP位点及其突变类型，下划线部分为BstUI内切酶识别序列，识别序列为CG^CG，^表示酶切位点)，R表示A/G；所述GAS7包括SEQ ID No.3所示的序列
加粗部分为SNP位点及其突变类型，下划线部分为HindIII内切酶识别序列，识别序列为A^AGCTT，^表示酶切位点，Y表示T/C；由于GAS7基因的该SNP位点附近没有合适酶切位点，因此，本发明在引物设计时，在上游引物中人为改变一个碱基，以配合该SNP形成合适的酶切位点，即原引物序列GAAGCCAGTTAACAGGAAAC改变为GAAGCCAGTTAACAGGAAGC，倒数第二个碱基由A改变为G后存在酶切位点5’-A^AGCTT-3’)。
本发明针对上述序列，依次设计并委托生物公司合成如下所示的引物对：
WIP1-F(SEQ ID No.4)：5'AGGAATCAACCCTGCTTA3'；
WIP1-R(SEQ ID No.5)：5'CCTTCACCCTCTCACACA3'；
TRIM55-F(SEQ ID No.6)：5'GGGACCTCTGAACAGGATTT 3'；
TRIM55-R(SEQ ID No.7)：5'ACAAGAGTGTAGTGCCGACTT 3'；
GAS7-F(SEQ ID No.8)：5'GAAGCCAGTTAACAGGAAGC 3'；
GAS7-R(SEQ ID No.9)：5'CCACGGCAAATCATCCA3'。
本发明提供了一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂盒，包括上述检测试剂，还包括与特异性引物对上酶切位点对应的限制性内切酶。
本发明所述限制性内切酶优选包括ScaⅠ-HF、BstUI和HindIII，实施例中将ScaⅠ-HF与WIP1结合，将BstUI和TRIM55结合，将HindIII和GAS7结合，用于猪的经济性状关联突变位点的检测。
本发明还提供了一种猪的经济性状关联突变位点检测方法，包括利用PCR或多重PCR方法，扩增猪WIP1、TRIM55和GAS7的至少一条基因片段，使用限制性内切酶酶切每个基因的扩增产物，根据酶切片段确认猪WIP1、TRIM55和GAS7的至少一个基因对应的上述SNP类型；
所述扩增用特异性引物对来自于上述检测试剂或上述经济性状关联突变位点检测试剂盒；
所述限制性内切酶来自于上述经济性状关联突变位点检测试剂盒。
本发明所述引物既可用于普通PCR的扩增，也可用于多重PCR的扩增，当采用普通PCR的方法进行扩增时，体系以50μL计，优选包括：2×Rapid Taq Master Mix 25μL、上下游引物(10μM)各1μL、模板10ng和余量的H2O；其程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸5s，30～35循环；72℃终延伸3min。当采用多重PCR的方法进行扩增时，体系同样以50μL计，优选包括：2×Multiplex Buffer 25μL、Multiplex DNAPolymerase 1μL、每条引物(10μM)0.5μL、模板10ng和余量的H2O；其程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火90s，72℃延伸30s，30～35循环；72℃终延伸10min。
本发明实施例中优选以组织DNA为模板，利用Fast Pure Cell/Tissue DNAIsolationMini Kit(Vazyme，DC102)进行细胞基因组的提取，具体包括：
(1)组织的消化裂解
①取1～20mg的剪碎或研磨的组织样品至1.5ml离心管中，加入230μLBuffer GA和20μLPK工作液至样品中，涡旋混匀，55℃水浴至完全酶解(组织样品需0.5～3h)。
②加入250μLBuffer GB至细胞重悬液中，涡旋混匀。70℃水浴10min。
(2)过柱纯化
③加入180μL无水乙醇至消化液中，涡旋混匀15～20sec。
④将gDNAColumns吸附柱置于CollectionTubes 2mL收集管中。将上一步所得混合液(上清液)转移至吸附柱中。13400rpm离心1min。
⑤弃滤液，将吸附柱置于收集管中。加入500μLWashingBufferA至吸附柱中。13400rpm离心1min。
⑥弃滤液，将吸附柱置于收集管中。加入650μLWashingBufferB至吸附柱中。13400rpm离心1min。
⑦重复步骤4。
⑧弃滤液，将吸附柱置于收集管中。13400rpm空管离心2min。
⑨将吸附柱置于新的1.5mL离心管。加入100μL预热至70℃的Elution Buffer至吸附柱的膜中央，室温放置3min。13400rpm离心1min。
⑩弃掉吸附柱，将DNA保存于2～8℃，长期保存需放置于-20℃。
本发明将提取得到的基因组DNA为模板，利用上述方法PCR扩增后，利用DNAClean&ConcentratorTM-5(ZYMO RESEARCH，D4014)进行产物纯化回收，具体步骤如下：
①加入5倍体积DNAbindingbuffer，震荡混匀；
②转移混合物到Zymo-Spin Column，30s离心，10000rpm，室温；
③200μLDNAwashbuffer洗2遍，30s离心，10000rpm，室温；
④25μL DNAElutionbuffer加至柱中，室温孵育1min，30s离心，10000rpm，室温。
本发明对上述纯化回收后的产物进行酶切，优选包括取200ng纯化的PCR产物利用NEB酶进行酶切，所述酶切的体系以50μL计，优选包括：酶(NEB)2U、NEB Buffer(NEB)5μL、DNA200 ng和余量的ddH2O。本发明将所述体系混匀后，37℃反应0.5h，80℃酶灭活反应20min，每50μL加10μL 6×DNA loading buffer(Thermo Fisher，R0611)，取6μL跑胶，三种基因的不同的SNP类型及其酶切片段长度如图1所示。
本发明所述跑胶优选为采用8％PAGE胶电泳：1mm板，配胶添加成分如表1所示。本发明利用0.5×TBE电泳液进行电泳，调整参数：恒压60V，15min；120V，90min。本发明在所述电泳结束后进行Gel染色，SYBR Gold(S11494，Invitrogen)用1×TBE稀释10000倍，染色5min。而后照胶。
表18％PAGE胶
本发明还提供了上述检测试剂或上述经济性状关联突变位点检测试剂盒在区分猪经济性状相关SNP为野生型、纯和突变型与杂合突变型中的应用。
在本发明实施例中，可依据图1所示的酶切条带的大小判定各基因对应的的上述SNP类型。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂、试剂盒和检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第四版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1
WIP1基因rs 334589942位点单位点检测
S1、组织DNA提取：利用Fast Pure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(Vazyme，DC102)进行细胞基因组的提取；
S2、引物设计和DNA扩增；
WIP1-F(SEQ ID No.4)：5'AGGAATCAACCCTGCTTA3'；
WIP1-R(SEQ ID No.5)：5'CCTTCACCCTCTCACACA3'；
50μL体系：2×Rapid TaqMasterMix 25μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、DNA 10ng和余量的ddH2O；程序设定为：95℃预变性3min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸5s，30循环；72℃终延伸3min。
S3、产物回收纯化：
利用DNA Clean&ConcentratorTM-5(ZYMO RESEARCH，D4014)进行产物纯化回收；
S4、ScaI-HF酶切；
将S3纯化完的PCR产物取200ng，利用内切酶ScaⅠ-HF做酶切，混匀，37℃反应30min，80℃酶灭活反应20min，每50μL加10μL 6×DNA loading buffer，取6μL跑胶。
S5、电泳；
①配胶：8％PAGE：1mm板，凝胶，其余添加成分如表6。
②电泳，0.5×TBE电泳液，参数：恒压60V，15min；120V，90min。
③Gel染色，SYBR Gold用1×TBE稀释10000倍，染色5min。
④照胶。(对照胶步骤进行补充说明：由于较小的一条酶切条带分子量过小，通过PAGE电泳后照胶，一般无法直接观察到，但通过较大的酶切条带可推断其是否存在。在本实验中，WIP1基因PCR产物长度为363bp，可被酶切为308bp和55bp两条带，其中55bp条带观察不到，但若可观察到308bp的条带，说明该产物被切开，则55bp条带是存在的；GAS7基因PCR产物长度为298bp，可被酶切为281bp和17bp两条带，其中17bp条带观察不到，但若可观察到281bp的条带，说明该产物被切开，则17bp条带是存在的；TRIM55基因PCR产物长度为247bp，可被酶切为198bp和49bp两条带，其中49bp条带观察不到，但若可观察到198bp的条带，说明该产物被切开，则49bp条带是存在的。后续实验均适用该方法，为此再不做重复说明)。图2中A为根据测序结果做出的电泳预想图，实际酶切结果电泳图如图2中B所示，实际图中可观察到的条带与预想图一一对应。1、2号泳道酶切条带为1条带，363bp，说明1、2号样品WIP1基因rs334589942位点为GG型；3、4号泳道可观察到酶切条带为2条带，363bp，308bp，说明该位点为GT型；5号泳道为对照组，为未经酶切的WIP1基因PCR产物，条带为363bp。图2中C为该实施例所用样品WIP1基因的PCR产物测序结果图，阴影部分为WIP1基因rs334589942位点的碱基类型。
实施例2
TRIM55基因rs 326263523位点单位点检测
除引物为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物以及采用BstUI酶切外，其余方案均与实施例1相同。
图3中A为根据测序结果做出的电泳预想图，实际酶切结果电泳图如图3中B所示，实际图中可观察到的条带与预想图一一对应。1、3、4号泳道条带相同，均为247bp，198bp，说明1、3、4号样品TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；2号泳道只有一条带，大小为247bp，说明2号样品该位点为AA型；5号泳道为对照组，为未经酶切的TRIM55基因PCR产物，条带长度为247bp。图3中C为该实施例所用样品TRIM55基因的PCR产物测序结果图，阴影部分为TRIM55基因rs 326263523位点的碱基类型。
实施例3
GAS7基因rs 81437379位点单位点检测
除引物为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的引物以及采用HindIII酶切外，其余方案均与实施例1相同。
图4中A为根据测序结果做出的电泳预想图，实际酶切结果电泳图如图4中B所示，实际图中可观察到的条带与预想图一一对应。1、2、4号泳道均只有一条带，大小为281bp，说明1、2、4号样品GAS7基因rs81437379位点为TT型；3号泳道有两条带298bp，281bp，说明3号样品该位点为CT型；5号泳道为对照组，为未经酶切的GAS7基因PCR产物，条带为298bp。图4中C为该实施例所用样品GAS7基因的PCR产物测序结果图，阴影部分为GAS7基因rs81437379位点的碱基类型。
实施例4
WIP1基因rs 334589942位点和GAS7基因rs 81437379位点双位点检测
除引物为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5以及SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的引物进行多重PCR扩增，以及采用HindIII和ScaI-HF双酶切外，其余方案均与实施例1相同；
其中多重PCR的50μL体系：2×Multiplex Buffer 25μL、Multiplex DNAPolymerase 1μL、每条引物(10μM)0.5μL、DNA 10ng，ddH2O加至50μL。并设定程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火90s，72℃延伸30s，30循环；72℃延伸10min。
图5中A为根据测序结果做出的电泳预想图，实际酶切结果电泳图如图5中B所示，实际图中可观察到的条带与预想图一一对应。1、2、3号泳道条带相同，分别为363bp，308bp，298bp，281bp，说明1、2、3号样品的WIP1基因rs 334589942位点为GT型，GAS7基因rs81437379位点为CT型；4号泳道条带为363bp，298bp，281bp，说明4号样品的WIP1基因rs334589942位点为GG型，GAS7基因rs 81437379位点为CT型；5号泳道为对照组，为未经酶切的WIP1和GAS7基因双重PCR产物，条带分别为为363bp，298bp。图5中C为该实施例所用样品WIP1与GAS7基因的PCR产物测序结果图，阴影部分为WIP1基因rs 334589942位点或GAS7基因rs 81437379位点的碱基类型。
实施例5
WIP1基因rs 334589942位点和TRIM55基因rs 326263523位点双位点检测
除引物为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5以及SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物进行多重PCR扩增，以及采用ScaI-HF、BstUI双酶切外，其余方案均与实施例4相同。
图6中A为根据测序结果做出的电泳预想图，实际酶切结果电泳图如图6中B所示，实际图中可观察到的条带与预想图一一对应。1号泳道条带为363bp，308bp，247bp，198bp，说明1号样品的WIP1基因rs 334589942位点为GT型，TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；2、3号泳道条带相同，为363bp，247bp，198bp，说明2、3号样品的WIP1基因rs 334589942位点为GG型，TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；4号泳道条带为363bp，308bp，247bp，说明4号样品的WIP1基因rs 334589942位点为GT型，TRIM55基因rs 326263523位点为AA型；5号泳道为对照组，为未经酶切的WIP1和TRIM55基因双重PCR产物，条带为363bp，247bp。图6中C为该实施例所用样品WIP1与GAS7基因的PCR产物测序结果图，阴影部分为WIP1基因rs334589942位点或GAS7基因rs 81437379位点的碱基类型。
实施例6
GAS7基因rs 81437379位点和TRIM55基因rs 326263523位点双位点检测
除引物为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7以及SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的引物进行多重PCR扩增，以及采用HindⅢ、BstUI双酶切外，其余方案均与实施例4相同。
图7中A为根据测序结果做出的电泳预想图，实际酶切结果电泳图如图7中B所示，实际图中可观察到的条带与预想图一一对应。1、2号泳道条带相同，为281bp，247bp，198bp，说明1、2号样品的GAS7基因rs 81437379位点为TT型，TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；3号泳道条带为298bp，281bp，247bp，198bp，说明3号样品的GAS7基因rs 81437379位点为TC型，TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；4号泳道条带为281bp，247bp，说明4号样品的GAS7基因rs 81437379位点为TT型，TRIM55基因rs 326263523位点为AA型；5号泳道为对照组，为未经酶切的GAS7和TRIM55基因双重PCR产物，条带为298bp，247bp。图7中C为该实施例所用样品WIP1与GAS7基因的PCR产物测序结果图，阴影部分为GAS7基因rs_81437379位点或TRIM55基因rs326263523位点的碱基类型。
实施例7
WIP1基因rs 334589942位点、GAS7基因rs 81437379位点和TRIM55基因rs326263523位点三位点检测
除引物为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7以及SEQ IDNo.8和SEQ ID No.9所示的引物进行三重PCR扩增，以及采用ScaI-HF、HindⅢ、BstUI三酶切外，其余方案均与实施例4相同。
图8中A为根据测序结果做出的电泳预想图，实际酶切结果电泳图如图8中B所示，实际图中可观察到的条带与预想图一一对应。1号泳道条带为363bp，308bp，281bp，247bp，198bp，说明1号样品的WIP1基因rs 334589942位点为TG型，GAS7基因rs 81437379位点为TT型，TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；2号泳道条带为363bp，281bp，247bp，198bp，说明2号样品的WIP1基因rs 334589942位点为GG型，GAS7基因rs 81437379位点为TT型，TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；3号泳道条带为363bp，298bp，281bp，247bp，198bp，说明3号样品的WIP1基因rs 334589942位点为GG型，GAS7基因rs 81437379位点为TC型，TRIM55基因rs 326263523位点为AG型；4号泳道条带为363bp，308bp、281bp，247bp，说明4号样品的WIP1基因rs334589942位点为TG型，GAS7基因rs 81437379位点为TT型，TRIM55基因rs326263523位点为AA型；5号泳道为对照组，为未经酶切的WIP1、GAS7和TRIM55基因三重PCR产物，条带为363bp，298bp，247bp。图8中C为该实施例所用样品WIP1、GAS7与TRIM55基因的PCR产物测序结果图，阴影部分为WIP1基因rs 334589942位点或GAS7基因rs 81437379位点或TRIM55基因rs 326263523位点的碱基类型。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种与猪经济性状关联的突变位点的检测试剂，其特征在于，包括针对以下至少一个基因的突变位点设计的特异性引物对：WIP1、TRIM55和GAS7；
所述WIP1包括SEQ ID No.1所示的序列，所述TRIM55包括SEQ ID No.2所示的序列，所述GAS7包括SEQ ID No.3所示的序列。
2.根据权利要求1所述检测试剂，其特征在于，所述WIP1的特异性引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的WIP1-F和SEQ ID No.5所示的WIP1-R；
所述TRIM55的特异性引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的TRIM55-F和SEQ IDNo.7所示的TRIM55-R；
所述GAS7的特异性引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的GAS7-F和SEQ IDNo.9所示的GAS7-R。
3.一种猪的经济性状关联突变位点检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述检测试剂，还包括与特异性引物对上酶切位点对应的限制性内切酶。
4.根据权利要求3所述经济性状关联突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶包括ScaⅠ-HF、BstUI和HindIII。
5.一种猪的经济性状关联突变位点检测方法，其特征在于，包括利用PCR或多重PCR方法，扩增猪WIP1、TRIM55和GAS7的至少一条基因片段，使用限制性内切酶酶切每个基因的扩增产物，根据酶切片段确认猪WIP1、TRIM55和GAS7的至少一个基因的基因型；
所述扩增用特异性引物对来自于权利要求1或2所述检测试剂或权利要求3或4所述经济性状关联突变位点检测试剂盒；
所述限制性内切酶来自于权利要求3或4所述经济性状关联突变位点检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述经济性状关联突变位点检测方法，其特征在于，所述PCR的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸5s，30～35循环；72℃终延伸3min。
7.根据权利要求5或6所述经济性状关联突变位点检测方法，其特征在于，所述PCR的体系以50μL计，包括：2×Rapid TaqMasterMix(Vazyme，P222)25μL、上下游引物(10μM)各1μL、模板10ng和余量的H2O。
8.根据权利要求5所述经济性状关联突变位点检测方法，其特征在于，所述多重PCR的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火90s，72℃延伸30s，30～35循环；72℃终延伸10min。
9.根据权利要求5或8所述经济性状关联突变位点检测方法，其特征在于，所述多重PCR的体系以50μL计，包括：2×Multiplex Buffer 25μL(Vazyme，PM101)、MultiplexDNAPolymerase(Vazyme，PM101)1μL、每条引物(10μM)0.5μL、模板10ng和余量的H2O。
10.权利要求1或2所述检测试剂或权利要求3或4所述经济性状关联突变位点检测试剂盒在区分猪经济性状基因的基因型中的应用。
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