CN117778586A - 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 - Google Patents
基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778586A CN117778586A CN202311666156.9A CN202311666156A CN117778586A CN 117778586 A CN117778586 A CN 117778586A CN 202311666156 A CN202311666156 A CN 202311666156A CN 117778586 A CN117778586 A CN 117778586A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- deer
- species
- sequence
- seq
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 title claims abstract description 144
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 127
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 19
- 241000283007 Cervus nippon Species 0.000 claims description 57
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 claims description 57
- 241000282985 Cervus Species 0.000 claims description 52
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 39
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 22
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 16
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 15
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 13
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 92
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241001416181 Axis axis Species 0.000 description 3
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 241001492697 Centropogon cornutus Species 0.000 description 1
- 241000283026 Cervus elaphus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001482579 Muntiacinae Species 0.000 description 1
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001481789 Rupicapra Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003056 antler Anatomy 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了基于时珍法的用于鹿科动物鉴定的物种特异性靶标序列、引物对、试剂盒、它们的应用及物种鉴定方法，其中，基于通过时珍法筛选得到的鹿科动物的物种特异性靶标序列，实现了对待检测样品的物种鉴定。本发明的物种鉴定方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可实现物种的快速鉴定，具有广阔的应用前景。
Description
本申请是申请日为2023年01月10日、发明名称为“基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用”的申请号为202310030583.1的专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及鹿科动物鉴定技术领域，具体涉及一种基于时珍法(Analysis ofwhole-GEnome，AGE，又称全基因组分析法或阿哥法)鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、引物对、试剂盒、它们的应用及物种鉴定方法。
背景技术
地球上生活着874万个真核生物物种，其中四分之三以上属于动物界。在食物、医药和工业等领域，丰富的动物资源对人类的生存都至关重要。动物的生理学和生活方式为人类提供了无数的灵感来源。然而，在“第六次灭绝浪潮”中，动物的生物多样性损失严重。鹿科动物是世界上最丰富的大型哺乳动物之一，鹿科(Cervidae)包括4个亚科，分别是鹿亚科(Cervinae)、獐亚科(Hydropotinae)、麂亚科(Mun tiacinae)和空齿鹿亚科(Odocoileinae)，共16属约52种，在极北地区、热带地区和高海拔地区都有分布。鹿科动物较其他科属动物最大的特点是其进化出周期性再生新器官——鹿茸角。鹿科动物作为哺乳动物器官再生的研究模型，具有重要科学价值。《本草纲目》记载称鹿茸可入药，具有温肾壮阳、益精补血、强筋健骨等功效。2020版的《中国药典》明确指出梅花鹿和马鹿鹿茸品种的产品为正宗中药材原料。
准确的动物物种鉴定是动物资源保护和动物生物多样性的基础。为了区分鹿科动物物种，人们开发了多种检测技术。形态学检测方法是最传统且基础的鉴别方法。但该方法对样品鉴别时需要完整的组织结构，不能遭到破坏，故在市场检测中有很大的局限性。随着分子技术的进步，荧光定量PCR、限制性片段长度多态性技术、测序技术和DNA条形码技术等发展起来的新方向，在目前的鉴定领域使用范围最广，但一些方法较为繁琐、或者存在脱靶风险。
时珍法是从物种全基因组出发寻找特异靶标序列，精准识别特异靶标序列，实现物种准确鉴定的分子诊断方法。基于不同物种基因组序列间的差异，时珍法在生物信息学分析和实验操作两个层面找到目标物种的特异靶标序列，并通过识别特异靶标序列进行鉴定。与传统DNA条形码相比，全基因组序列具有更丰富的物种生物信息，因此有望基于时珍法从鹿科动物全基因组、即核基因组和线粒体基因组开发有效鉴别鹿科动物的特异靶标序列，以期用于鹿科动物、鹿科动物组织或器官(例如鹿科动物不同部位的肉)或者含有鹿科动物的药材、饮片及相关中成药的基原鉴定。
发明内容
本发明基于时珍法筛选鹿科动物全基因组(即核基因组和线粒体基因组)，开发出了能够有效鉴别鹿科动物的特异靶标序列和特异引物对等，从而使得在鉴定鹿科动物及与其相关的样品时，鉴定过程便捷快速，鉴定结果准确，灵敏度高。
在一个方面，本发明提供了选自如下的鹿科动物的物种特异性靶标核苷酸：(1)以SEQ ID NO：7(TTTCCTTCTTATGAATCCGAGCATCT)示出的靶标核苷酸；(2)以SEQ ID NO：8(GCACACATGTACAATGGTACATAAA)示出的靶标核苷酸；或(3)以SEQ ID NO：9(TTTCTACTTCTTCTAGCATCATCCA)示出的靶标核苷酸。
另一方面，本发明提供上述的靶标核苷酸在对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定、或者区分鹿科动物与其近缘物种中的应用。
本发明首次发现了在鹿科动物中存在上文示出的物种特异性的靶标核苷酸序列。其中，以SEQ ID NO：7示出的靶标核苷酸见于马鹿，以SEQ ID NO：8示出的靶标核苷酸见于梅花鹿；并且以SEQ ID NO：9示出的靶标核苷酸见于驯鹿。
在一些实施方式中，所述鹿科动物可选自马鹿、梅花鹿和驯鹿，但不限于此。
另一方面，本发明提供了一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的引物对，包括：
(1)Ce_F：5’-CTACTCCAACCTATTGCAGA-3’(SEQ ID NO：1)，和Ce_R：5’-TTTGTGGAGGGATGCTTGAT-3’(SEQ ID NO：2)；或者
(2)Cn_F：5’-TACAGCTTTCTACTCAACAC-3’(SEQ ID NO：3)，和Cn_R：5’-CCACAGTTATGTGTGAGCAT-3’(SEQ ID NO：4)。
本发明的引物对能够用于对鹿科动物的物种特异性靶标序列进行扩增，从而实现对鹿科动物的物种鉴定。例如，以SEQ ID NOs：1-2示出的引物对可优选用于对源自马鹿的材料进行物种鉴定；以SEQ ID NOs：3-4示出的引物对可优选用于对源自梅花鹿的材料进行物种鉴定；并且以SEQ ID NOs：5-6示出的引物对可优选用于对源自驯鹿的材料进行物种鉴定。
在一些实施方式中，所述鹿科动物可选自马鹿、梅花鹿和驯鹿，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述的引物对。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含：PCR反应试剂和CRISPR/Cas12a体系反应试剂。
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应试剂包含：PCR扩增缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、MgCl2以及无菌超纯水。在一些优选的实施方式中，所述CRISPR/Cas12a体系反应试剂包含：基因编辑缓冲液、Cas蛋白、crRNA、无核酸酶水(nuclease-free water)和荧光信号分子(例如ssDNA荧光报告基因)。
在一些优选的实施方式中，所述crRNA为以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU CUUCUUAUGAAUCCGAGCAUCU(SEQ ID NO：11)；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU UGUACCAUUGUACAUGUGUGC(SEQ ID NO：12)；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU UACUUCUUCUAGCAUCAUCCA(SEQ ID NO：13)。
在另一方面，本发明还提供了上述的引物对或试剂盒在如下方面的应用：鉴定待检测样品中的鹿科动物成分，对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定，区分源自鹿科动物的中药材与其混伪品，或者用于食品、药品或保健品的安全检测。
在一些实施方式中，所述待检测样品可以是鹿科动物、鹿科动物的组织或器官(例如鹿科动物的肉)、含有鹿科动物的中药材、或者鹿科动物混伪品。
在本发明中，通过获取待检测的样品(例如，鹿科动物、鹿科动物的组织或器官、中药材、食品、保健品)的基因组DNA，并检测所述基因组DNA中是否含有待鉴定物种(即，鹿科动物)的所述特异性靶标序列，从而确定所述待检测的样品与所述待鉴定物种的同一性。
在本文中，所述待检测样品可以是来自任何鹿科动物的样品。在一些示例性的实施方式中，所述待检测的鹿科动物样品可以是来自梅花鹿、马鹿或驯鹿的样品。在一些实施方式中，所述待检测的鹿科动物样品是单一物种来源的样品或者是多个物种来源的样品的混合物。
在另一方面，本发明涉及一种基于时珍法的鹿科动物鉴定方法，包括：
(1)获取包括待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的全基因组序列，构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；
(2)按如下条件中的至少一种，对所述片段序列库中的序列进行筛选，获得全部鹿科动物各自的候选片段序列库：(i)候选序列GC含量为40％-60％；(ii)候选序列不能含有连续4连以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、3个以上的3连重复碱基；(iii)候选序列不能与crRNA重复序列互补；(iv)候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％；以及(v)候选序列所在区域-50bp到+300bp或-300bp到+50bp内不存在连续4个以上的A或GT重复；
(3)将所述待鉴定物种的候选片段序列库与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列进行比对，从所述待鉴定物种的候选片段序列库中筛选出与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列完全匹配的序列，构建所述待鉴定物种的候选靶标序列库；
(4)将所述待鉴定物种的候选靶标序列库中的每一条序列在除所述待鉴定物种之外的全部鹿科动物各自的候选片段序列库中进行比对，筛选出与除所述待鉴定物种之外的其他鹿科动物存在3个以上碱基错配的一条或多条序列作为特异性靶标序列；
(5)基于所述特异性靶标序列设计引物对，提取待检测样品的基因组DNA并使用所述引物对进行扩增，对扩增产物进行检测，检测到相应的扩增产物时，则所述待检测样品与待鉴定物种具有同一性。
在一些实施方式中，将所述鹿科动物的全基因组序列分别用Jellyfish分成“L-S+1”个长度为S的片段，对每个片段检测以选择5'端带有TTTV或3'端带有VAAA的PAM基序的序列，并提取带有PAM基序的序列构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；其中，L＝全基因组序列长度，S＝24-26bp。
在一些实施方式中，所述crRNA重复序列为以SEQ ID NO：10(5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3')示出的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述引物对包括：以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2示出的引物对；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4示出的引物对；或者以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6示出的引物对。
在一些实施方式中，所述扩增选自PCR扩增、或恒温扩增(例如环介导的恒温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、解旋酶依赖的恒温DNA扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、聚合酶螺旋反应(PSR)、杂交链式反应(HCR)、引物交换反应(PER)、交换反应信号扩增(SABER)、基于转录的扩增系统(TAS)、自我持续序列复制反应(3SR)、单引物恒温扩增(SPIA)和交叉引物扩增(CPA))。
在一些实施方式中，采用基因编辑对扩增产物进行检测。在一些优选的实施方式中，采用CRISPR/Cas12a系统、例如具有荧光信号分子的CRISPR/Cas12a系统进行所述基因编辑。在一些优选的实施方式中，所述CRISPR/Cas12a系统包括以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU CUUCUUAUGAAUCCGAGCAUCU(SEQ ID NO：11)；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU UGUACCAUUGUACAUGUGUGC(SEQ ID NO：12)；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU UACUUCUUCUAGCAUCAUCCA(SEQ ID NO：13)。
本申请提出的基于时珍法的鹿科动物鉴定方法包括如下两个方面：
(1)鹿科动物特异靶标序列的筛选
以时珍法为基础，根据后续检测目的、要求和基因组注释文件以及目标物种和其他物种序列信息，通过筛选构建物种的片段序列文库。将目标物种片段文库中序列与其他物种片段序列文库进行比对，保留只存在于目标物种中的特异靶标序列，以此构建目标物种的特异靶标序列库。
(2)精准识别样品中的目标物种特异靶标序列
从目标物种的特异靶标序列库中随机选择一条靶标序列为模板合成crRNA，并根据靶标序列上下游的序列设计合成引物。通过常规PCR或者室温扩增对样品DNA进行扩增。可利用不同实验技术识别样品中的目标物种特异靶标序列，例如，采用基因编辑技术，通过Cas12a酶和crRNA结合形成复合物，与扩增的DNA片段结合后，激活Cas12a酶的反式切割活性，切割带荧光探针的单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)。通过酶标仪和可视荧光两种方式检测反应体系的荧光。反应体系有荧光产生，则判定待检测样品与目标物种具有同一性。反之，则不具有同一性。
采用本文所述的方法进行物种鉴定时，能够区分待鉴定物种与其近缘物种，从而准确实现涉及鹿科动物的待检测样品在物种水平上的准确鉴定。该方法可以在包括中药材混伪品鉴定、食品安全、药品及保健品安全方面能够发挥出积极的作用。所述方法特异性强、灵敏度高、重复性好、可实现生物样品的物种的快速鉴定，因此可具有广阔的应用前景。
以下将结合附图对本申请的示例性方案进行进一步说明，以说明本申请的方案的目的、技术特征和技术效果，但是本申请的方案还可具有其它未描述的特征、优点等，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
附图说明
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将结合附图进行简单的介绍，以下附图仅仅是本公开的示例，本申请的保护范围不限于此。
图1示出了马鹿、梅花鹿和驯鹿的物种特异性靶标序列以及各特异性靶标序列匹配的crRNA。
图2示出了马鹿样品(子图A和B)、梅花鹿样品(子图C和D)和驯鹿样品(子图E和F)与其他鹿科动物的荧光检测结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本申请进行了详细描述，但并不意味着存在对本申请而言任何不利的限制。本文已经详细地描述了本申请，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本申请精神和范围的情况下针对本申请具体实施方式进行各种变化和改进也是包含在本申请的保护范围内的。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor，NY 1989)；Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocolsin Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)。
在本文中，除非上下文另有明确指示，术语“或”意在包括“和”，反之亦然。在本文中，除非另有说明，否则单数术语涵盖复数指代物，反之亦然。
在本文中，除非另有说明，术语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”或其等同物(例如contain、containing、include、including)为开放式表述，应理解为“包括但不限于”，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
在本文中，除非另有说明，术语“全基因组”不仅涵盖生物的整个基因组序列，而且还涵盖了细胞器基因组(例如线粒体基因组)。
在本文中，本发明的示例性的实施方案可通过如下的编号段落中的内容进行说明：
1.鹿科动物的物种特异性靶标核苷酸，其中，所述靶标核苷酸选自：(1)以SEQ IDNO：7示出的靶标核苷酸；(2)以SEQ ID NO：8示出的靶标核苷酸；或(3)以SEQ ID NO：9示出的靶标核苷酸。
2.段落1所述的靶标核苷酸在对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定、或者区分鹿科动物与其近缘物种中的应用。
3.如段落2所述的应用，其中，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。
4.一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的引物对，包括：
(1)Ce_F：5’-CTACTCCAACCTATTGCAGA-3’(SEQ ID NO：1)，和Ce_R：5’-TTTGTGGAGGGATGCTTGAT-3’(SEQ ID NO：2)；或者
(2)Cn_F：5’-TACAGCTTTCTACTCAACAC-3’(SEQ ID NO：3)，和Cn_R：5’-CCACAGTTATGTGTGAGCAT-3’(SEQ ID NO：4)。
5.如段落4所述的引物对，其中，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。
6.一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的试剂盒，其中，所述试剂盒包含段落4或5所述的引物对。
7.如段落6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：PCR反应试剂和CRISPR/Cas12a体系反应试剂。
8.如段落7所述的试剂盒，其中，所述PCR反应试剂包含：PCR扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2以及无菌超纯水。
9.如段落7或8所述的试剂盒，其中，所述CRISPR/Cas12a体系反应试剂包含：基因编辑缓冲液、Cas蛋白、crRNA、无核酸酶水和荧光信号分子。
10.如段落9所述的试剂盒，其中，所述crRNA为以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。
11.段落4或5所述的引物对或段落6-10中任一段所述的试剂盒在如下方面的应用：鉴定待检测样品中的鹿科动物成分，对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定，区分源自鹿科动物的中药材与其混伪品，或者用于食品、药品或保健品的安全检测。
12.如段落11所述的应用，其中，所述待检测样品是鹿科动物、鹿科动物的组织或器官、含有鹿科动物的中药材、或者鹿科动物混伪品。
13.如段落11或12所述的应用，其中，所述待检测样品是来自梅花鹿、马鹿或驯鹿的样品。
14.如段落11-13中任一段所述的应用，其中，所述待检测样品是单一物种来源的样品或者是多个物种来源的样品的混合物。
15.一种基于时珍法的鹿科动物鉴定方法，包括：
(1)获取包括待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的全基因组序列，构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；
(2)按如下条件中的至少一种，对所述片段序列库中的序列进行筛选，获得全部鹿科动物各自的候选片段序列库：(i)候选序列GC含量为40％-60％；(ii)候选序列不能含有连续4连以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、3个以上的3连重复碱基；(iii)候选序列不能与crRNA重复序列互补；(iv)候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％；以及(v)候选序列所在区域-50bp到+300bp或-300bp到+50bp内不存在连续4个以上的A或GT重复；
(3)将所述待鉴定物种的候选片段序列库与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列进行比对，从所述待鉴定物种的候选片段序列库中筛选出与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列完全匹配的序列，构建所述待鉴定物种的候选靶标序列库；
(4)将所述待鉴定物种的候选靶标序列库中的每一条序列在除所述待鉴定物种之外的全部鹿科动物各自的候选片段序列库中进行比对，筛选出与除所述待鉴定物种之外的其他鹿科动物存在3个以上碱基错配的一条或多条序列作为特异性靶标序列；
(5)基于所述特异性靶标序列设计引物对，提取待检测样品的基因组DNA并使用所述引物对进行扩增，对扩增产物进行检测，检测到相应的扩增产物时，则所述待检测样品与待鉴定物种具有同一性。
16.如段落15所述的鹿科动物鉴定方法，其中，将所述鹿科动物的全基因组序列分别用Jellyfish分成“L-S+1”个长度为S的片段，对每个片段检测以选择5'端带有TTTV或3'端带有VAAA的PAM基序的序列，并提取带有PAM基序的序列构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；其中，L＝全基因组序列长度，S＝24-26bp。
17.如段落15或16所述的鹿科动物鉴定方法，其中，所述crRNA重复序列为以SEQID NO：10示出的核苷酸序列。
18.如段落15-17中任一段所述的鹿科动物鉴定方法，其中，所述引物对包括：以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2示出的引物对；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4示出的引物对；或者以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6示出的引物对。
19.如段落15-18中任一段所述的鹿科动物鉴定方法，其中，所述扩增选自PCR扩增、或恒温扩增。
20.如段落15-19中任一段所述的鹿科动物鉴定方法，其中，采用基因编辑对扩增产物进行检测。
21.如段落15-20中任一段所述的鹿科动物鉴定方法，其中，采用CRISPR/Cas12a系统进行所述基因编辑。
22.如段落15-21中任一段所述的鹿科动物鉴定方法，其中，所述CRISPR/Cas12a系统包括以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件实施。除非另外说明，下述实施例中所用试剂、材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：马鹿(Cervus elaphus)特异性靶标序列的筛选
1.1鹿科动物的全基因组序列获取。
从NCBI数据库中下载用作待鉴定物种的马鹿的全基因组数据(版本号：GCA_910594005.1)。各实施例中涉及的鹿科动物的全基因组序列的相关信息见下表。
| 鹿科动物 | 全基因组序列的相关信息 |
| 梅花鹿 | 委托上海凌恩生物科技有限公司测序获得 |
| 马鹿 | NCBI数据库(版本号：GCA_910594005.1) |
| 驯鹿 | NCBI数据库(版本号：GCA_004026565.1) |
1.2基于后续的检测的要求和上述得到的所有鹿科动物的基因组序列，构建所有鹿科动物各自的片段序列库。
将上述得到的鹿科动物的全基因组序列分别用Jellyfish(v1.1.12)分成“L-S+1”(L＝全基因组序列长度)个长度为S的片段，对每一个片段检测选择5'端带有TTTV或3'端带有VAAA的PAM基序，并提取带有PAM的序列构建片段序列库，S＝26bp(马鹿)，或S＝25bp(梅花鹿和驯鹿)。
1.3分析候选靶标序列，可选择性地对所述片段序列库中的序列进行筛选，获得全部鹿科动物(梅花鹿、马鹿和驯鹿)各自的候选片段序列库。候选序列筛选条件包括：
1.3.1候选序列GC含量为40％-60％；
1.3.2候选序列不能含有连续4连以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、3个以上的3连重复碱基；
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列(5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3'；SEQ IDNO：10)互补；
1.3.4候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％；
1.3.5候选序列所在区域-50bp到+300bp或-300bp到+50bp内不存在连续4个以上A或GT重复。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3得到的马鹿的候选片段序列库中的序列与数据库下载的所有已公布的马鹿基因组序列进行比对，从所述马鹿候选片段序列库中筛选出能够与所有已公布的马鹿基因组序列完全匹配的序列，构建马鹿候选靶标序列库。
1.5基于全部鹿科动物各自的候选片段序列库，将马鹿的候选靶标序列库中的每一条序列在除马鹿之外的全部鹿科动物各自的候选片段序列库中进行比对，筛选出与除马鹿之外的其他鹿科动物存在3个以上碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，将其命名为Ce_target(TTTCCTTCTTATGAATCCGAGCATCT；SEQ ID NO：7)。
实施例2：识别待检测样品中的目标物种特异靶标序列
为了确定实施例1筛选出的待鉴定物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种(目标物种)的同一性，接下来基于马鹿样品、梅花鹿样品和驯鹿样品各自的基因组DNA进行样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续实验采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)以及crRNA设计原则，设计匹配Ce_target的crRNA，命名为Ce_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUUCUUAUGAAUCCGAGCAUCU；SEQ ID NO：11)。
2.2待检测的马鹿、梅花鹿和驯鹿样品的基因组DNA提取
本实施例共收集11份动物样品，其中3份为梅花鹿动物样品，4份为马鹿动物样品，4份为驯鹿动物样品，相关信息见表1。
表1样品信息表
取各马鹿样品分别向其中加入液氮充分研磨为粉末，然后分别使用TIANGEN公司提供的试剂盒TIANamp Genomic DNA kit按照说明书提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop 2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
同时，按照上述操作提取梅花鹿和驯鹿样品各自的基因组DNA，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品的总DNA的完整性。
基于实施例1获得的马鹿的特异性靶标序列，设计特异性引物，其序列信息如下：
Ce_F：5’-CTACTCCAACCTATTGCAGA-3’(SEQ ID NO：1)；
Ce_R：5’-TTTGTGGAGGGATGCTTGAT-3’(SEQ ID NO：2)。
2.3采用基因组编辑技术基于特异性靶标序列进行样品的检测
使用上文设计的特异性引物扩增所获得的马鹿、梅花鹿和驯鹿的基因组DNA，PCR反应体系为30μL，PCR扩增程序：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；72℃10min。扩增产物采用天根通用型DNA纯化回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化回收。
PCR体系
分别设置Ce组(马鹿样品组)、Cn组(梅花鹿样品组)、Rt组(驯鹿样品组)和CK(空白对照，不加入DNA底物)组。在用于物种鉴定的如下的反应体系中，使用Ce_crRNA作为crRNA，并且对于待检测的各样品组，以上述提取得到的各组样品(待检测的马鹿样品、梅花鹿样品或驯鹿样品)的PCR扩增回收产物作为DNA底物。
使用NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，反应体系总体积为100μL：10μL 10×NEBuffer 2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μL crRNA(300nM)、3μL DNA底物(10ng/μL)、47μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL nuclease-free H2O。在PCR小管中加入DNA底物和NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、Os_crRNA和nuclease-free H2O，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光；或者加入Poly_C_FQ后，在37℃孵育3分钟时，放入蓝光投射仪((BG-Vtrans520s，北京百晶生物技术有限公司)检测荧光。
图2中的子图A示出了上述各待检测的样品组的酶标仪荧光测定结果。如子图A所示，Ce组产生了荧光信号，荧光值在20分钟达到最大并保持，与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。而Rt组、Cn组与CK组一致，都没有荧光信号产生，荧光值与CK组无显著性差异(P>0.01)。图2中的子图B示出了上述各待检测的样品组的可视荧光测定结果。如子图B所示，马鹿样品的管中可以观察到明显荧光，而梅花鹿样品组、驯鹿样品组与CK组一致，都没有观察到荧光。这些结果说明，本发明实施例1得到的特异性靶标序列Ce_target能够特异性地用于待检测的马鹿样品的物种鉴定。
由此可以看出，本发明所述的方法能够得到物种特异性的靶标，从而实现特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种是否具有同一性。
实施例3：梅花鹿(Cervus nippon)特异性靶标序列的筛选
3.1委托上海凌恩生物科技有限公司通过浅层测序技术进行全基因组测序获得待鉴定物种的梅花鹿全基因组数据。按照实施例1所述的方法和筛选条件构建得到梅花鹿的候选片段序列库，其中S＝25bp。
使用Bowtie(v1.1.0)将3.1得到的梅花鹿的候选片段序列库中的序列与数据库下载的所有已公布的梅花鹿基因组序列进行比对，从所述梅花鹿候选片段序列库中筛选出能够与所有已公布的梅花鹿基因组序列完全匹配的序列，构建梅花鹿候选靶标序列库。
3.2基于全部鹿科动物(梅花鹿、马鹿和驯鹿)各自的候选片段序列库，将梅花鹿的候选靶标序列库中的每一条序列在除梅花鹿之外的全部鹿科动物各自的候选片段序列库中进行比对，筛选出与除梅花鹿之外的其他鹿科动物存在3个以上碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，将其命名为Cn_target(GCACACATGTACAATGGTACATAAA；SEQ ID NO：8)。
实施例4：识别待检测样品中的目标物种特异靶标序列
为了确定实施例3筛选出的待鉴定物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种的同一性，接下来基于马鹿样品、梅花鹿样品和驯鹿样品各自的基因组DNA进行样品的物种鉴定。
4.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续实验采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)以及crRNA设计原则，设计匹配Cn_target的crRNA，命名为Cn_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGUACCAUUGUACAUGUGUGC；SEQ ID NO：12)。
4.2待检测的马鹿、梅花鹿和驯鹿样品的基因组DNA提取
本实施例共收集11份动物样品，其中3份为梅花鹿动物样品，4份为马鹿动物样品，4份为驯鹿动物样品，相关信息见表1。
基于实施例3获得的梅花鹿的特异性靶标序列，设计特异性引物，其序列信息如下：
Cn_F：5’-TACAGCTTTCTACTCAACAC-3’(SEQ ID NO：3)；
Cn_R：5’-CCACAGTTATGTGTGAGCAT-3’(SEQ ID NO：4)。
4.3采用基因组编辑技术基于特异性靶标序列进行样品的检测
使用上文设计的特异性引物扩增所获得的马鹿、梅花鹿和驯鹿的基因组DNA(在实施例2的2.2部分中获得)，PCR反应体系为30μL，PCR扩增程序：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 10min。扩增产物采用天根通用型DNA纯化回收试剂盒纯化回收。
PCR体系
分别设置Ce组(马鹿样品组)、Cn组(梅花鹿样品组)、Rt组(驯鹿样品组)和CK(空白对照，不加入DNA底物)组。在用于物种鉴定的如下的反应体系中，使用Cn_crRNA作为crRNA，并且对于待检测的各样品组，以上述提取得到的各组中的样品(待检测的马鹿样品、梅花鹿样品或驯鹿样品)的PCR扩增回收产物作为DNA底物。
按照实施例2的2.3部分描述的操作步骤和反应条件采用NEB公司的EnGen LbaCas12a(Cpf1)系统进行上述样品的物种鉴定。
图2中的子图C示出了上述各待检测的样品组的酶标仪荧光测定结果。如子图C所示，Cn组产生了荧光信号，荧光值在20分钟达到最大并保持，与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。而Rt组、Ce组与CK组一致，都没有荧光信号产生，荧光值与CK组无显著性差异(P>0.01)。图2中的子图D示出了上述各待检测的样品组的可视荧光测定结果。如子图D所示，梅花鹿样品的管中可以观察到明显荧光，而马鹿样品组、驯鹿样品组与CK组一致，都没有观察到荧光。这些结果说明，本发明实施例3得到的特异性靶标序列Cn_target能够特异性地用于待检测的马鹿样品的物种鉴定。
由此可以看出，本发明所述的方法能够得到物种特异性的靶标，从而实现特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种是否具有同一性。
实施例5：驯鹿(Rangifer tarandus)特异性靶标序列的筛选
5.1从NCBI数据库中下载用作待鉴定物种的驯鹿全基因组数据(版本号：GCA_004026565.1)。按照实施例1所述的方法和筛选条件构建得到驯鹿的候选片段序列库，其中S＝25bp。
使用Bowtie(v1.1.0)将5.1得到的驯鹿的候选片段序列库中的序列与数据库下载的所有已公布的驯鹿基因组序列进行比对，从所述驯鹿候选片段序列库中筛选出能够与所有已公布的驯鹿基因组序列完全匹配的序列，构建驯鹿候选靶标序列库。
5.2基于全部鹿科动物(梅花鹿、马鹿和驯鹿)各自的候选片段序列库，将驯鹿的候选靶标序列库中每一条序列在除驯鹿之外的全部鹿科动物各自的候选片段序列库中进行比对，筛选出与除驯鹿之外的其他鹿科动物存在3个及以上碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，将其命名为Rt_target(TTTCTACTTCTTCTAGCATCATCCA；SEQ ID NO：9)。
实施例6：识别待检测样品中的目标物种特异靶标序列
为了确定实施例3筛选出的待鉴定物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种的同一性，接下来基于马鹿样品、梅花鹿样品和驯鹿样品各自的基因组DNA进行样品的物种鉴定。
6.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续实验采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)以及crRNA设计原则，设计匹配Rt_target的crRNA，命名为Rt_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACUUCUUCUAGCAUCAUCCA；SEQ ID NO：13)。
6.2马鹿、梅花鹿和驯鹿样品的基因组DNA提取
本实施例共收集11份动物样品，其中3份为梅花鹿动物样品，4份为马鹿动物样品，4份为驯鹿动物样品，相关信息见表1。
基于实施例5获得的驯鹿的特异性靶标序列，设计特异性引物，其序列信息如下：
Rt_F：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’(SEQ ID NO：5)；
Rt_R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’(SEQ ID NO：6)。
6.3采用基因组编辑技术基于特异性靶标序列进行样品的检测
使用上文设计的特异性引物扩增所获得的马鹿、梅花鹿和驯鹿的基因组DNA(在实施例2的2.2部分中获得)，PCR反应体系为30μL，PCR扩增程序：94℃1min；94℃1min，45℃1.5min，72℃1.5min，5个循环；94℃1min，50℃1.5min，72℃1min，35个循环；72℃5min。扩增产物经天根通用型DNA纯化回收试剂盒纯化回收。
PCR体系
分别设置Ce组(马鹿样品组)、Cn组(梅花鹿样品组)、Rt组(驯鹿样品组)和CK(空白对照，不加入DNA底物)组。在用于物种鉴定的如下的反应体系中，使用Rt_crRNA作为crRNA，并且对于待检测的各样品组，以上述提取得到的各组中的样品(待检测的马鹿样品、梅花鹿样品或驯鹿样品)的PCR扩增回收产物作为DNA底物。
按照实施例2的2.3部分描述的操作步骤和反应条件采用NEB公司的EnGen LbaCas12a(Cpf1)系统进行上述样品的物种鉴定。
图2中的子图E示出了上述各待检测的样品组的酶标仪荧光测定结果。如子图E所示，Rt组产生了荧光信号，荧光值在20分钟达到最大并保持，与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。而Cn组、Ce组与CK组一致，都没有荧光信号产生，荧光值与CK组无显著性差异(P>0.01)。图2中的子图F示出了上述各待检测的样品组的可视荧光测定结果。如子图F所示，驯鹿样品的管中可以观察到明显荧光，而马鹿样品组、梅花鹿样品组与CK组一致，都没有观察到荧光。这些结果说明，本发明实施例5得到的特异性靶标序列Rt_target能够特异性地用于待检测的马鹿样品的物种鉴定。
由此可以看出，本发明所述的方法能够得到物种特异性的靶标，从而实现特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种是否具有同一性。
根据上述实施例2、4和6的结果可知，本申请所述的方法能够准确地对源自鹿科动物的待检测样品(例如包括马鹿样品、梅花鹿样品和驯鹿样品的各组样品)进行物种鉴定，并能够用于将涉及鹿科动物的药材正品(例如马鹿、梅花鹿)与其各自的常见混伪品(例如驯鹿)明确地区别开。
所属领域的普通技术人员应当理解，以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的保护范围被限于这些实施例；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它出版物在此明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。而且，在任何国家，在本中对这些出版物的任何引用并不构成关于该出版物成为本领域的公知常识的一部分的认可。
Claims (10)
1.一种基于时珍法的鹿科动物鉴定方法，包括：
(1)获取包括待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的全基因组序列，构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；
(2)按如下条件中的至少一种，对所述片段序列库中的序列进行筛选，获得全部鹿科动物各自的候选片段序列库：(i)候选序列GC含量为40％-60％；(ii)候选序列不能含有连续4连以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、3个以上的3连重复碱基；(iii)候选序列不能与crRNA重复序列互补；(iv)候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％；以及(v)候选序列所在区域-50bp到+300bp或-300bp到+50bp内不存在连续4个以上的A或GT重复；
(3)将所述待鉴定物种的候选片段序列库与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列进行比对，从所述待鉴定物种的候选片段序列库中筛选出与所述待鉴定物种的所有已知的基因组序列完全匹配的序列，构建所述待鉴定物种的候选靶标序列库；
(4)将所述待鉴定物种的候选靶标序列库中的每一条序列在除所述待鉴定物种之外的全部鹿科动物各自的候选片段序列库中进行比对，筛选出与除所述待鉴定物种之外的其他鹿科动物存在3个以上碱基错配的一条或多条序列作为特异性靶标序列；
(5)基于所述特异性靶标序列设计引物对，提取待检测样品的基因组DNA并使用所述引物对进行扩增，对扩增产物进行检测，检测到相应的扩增产物时，则所述待检测样品与待鉴定物种具有同一性。
2.如权利要求1所述的鹿科动物鉴定方法，其中，将所述鹿科动物的全基因组序列分别用Jellyfish分成“L-S+1”个长度为S的片段，对每个片段检测以选择5'端带有TTTV或3'端带有VAAA的PAM基序的序列，并提取带有PAM基序的序列构建包括所述待鉴定物种在内的全部鹿科动物各自的片段序列库；其中，L＝全基因组序列长度，S＝24-26bp；
优选地，所述crRNA重复序列为以SEQ ID NO：10示出的核苷酸序列；
优选地，所述引物对包括：以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2示出的引物对；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4示出的引物对；或者以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6示出的引物对；
优选地，所述扩增选自PCR扩增、或恒温扩增；
优选地，采用基因编辑对扩增产物进行检测；
优选地，采用CRISPR/Cas12a系统进行所述基因编辑；
优选地，所述CRISPR/Cas12a系统包括以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。
3.鹿科动物的物种特异性靶标核苷酸，其中，所述靶标核苷酸选自：(1)以SEQ ID NO：7示出的靶标核苷酸；(2)以SEQ ID NO：8示出的靶标核苷酸；或(3)以SEQ ID NO：9示出的靶标核苷酸，
并且其中，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。
4.权利要求3所述的靶标核苷酸在对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定、或者区分鹿科动物与其近缘物种中的应用；
其中，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。
5.一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的引物对，包括：
(1)Ce_F：5’-CTACTCCAACCTATTGCAGA-3’(SEQ ID NO：1)，和Ce_R：5’-TTTGTGGAGGGATGCTTGAT-3’(SEQ ID NO：2)；或者
(2)Cn_F：5’-TACAGCTTTCTACTCAACAC-3’(SEQ ID NO：3)，和Cn_R：5’-CCACAGTTATGTGTGAGCAT-3’(SEQ ID NO：4)，
其中，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。
6.一种用于对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定的试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求5所述的引物对，所述鹿科动物选自马鹿、梅花鹿和驯鹿。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：PCR反应试剂和CRISPR/Cas12a体系反应试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中，所述PCR反应试剂包含：PCR扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2以及无菌超纯水；
或者，所述CRISPR/Cas12a体系反应试剂包含：基因编辑缓冲液、Cas蛋白、crRNA、无核酸酶水和荧光信号分子；优选地，所述crRNA为以SEQ ID NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。
9.权利要求5所述的引物对或权利要求6-8中任一项所述的试剂盒在如下方面的应用：鉴定待检测样品中的鹿科动物成分，对鹿科动物或源自鹿科动物的材料进行物种鉴定，区分源自鹿科动物的中药材与其混伪品，或者用于食品、药品或保健品的安全检测。
10.如权利要求9所述的应用，其中，所述待检测样品是鹿科动物、鹿科动物的组织或器官、含有鹿科动物的中药材、或者鹿科动物混伪品；
优选地，所述待检测样品是来自梅花鹿、马鹿或驯鹿的样品；
优选地，所述待检测样品是单一物种来源的样品或者是多个物种来源的样品的混合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311666156.9A CN117778586A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310030583.1A CN116083602B (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
| CN202311666156.9A CN117778586A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310030583.1A Division CN116083602B (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117778586A true CN117778586A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=86187836
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310030583.1A Active CN116083602B (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
| CN202311666156.9A Pending CN117778586A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310030583.1A Active CN116083602B (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN116083602B (zh) |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101974522B (zh) * | 2010-11-23 | 2012-08-08 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于马鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法 |
| CN104946730B (zh) * | 2014-03-28 | 2020-06-19 | 中国中医科学院中药研究所 | 鉴定鹿茸的pcr特异引物及其检测方法 |
| CN107365840B (zh) * | 2017-07-07 | 2020-10-13 | 北京麋鹿生态实验中心 | 基于dna条形码的鹿科动物快速鉴定试剂盒及其应用 |
| WO2019084063A1 (en) * | 2017-10-23 | 2019-05-02 | The Broad Institute, Inc. | SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION |
| US20210371932A1 (en) * | 2018-06-01 | 2021-12-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients |
| CN111808975A (zh) * | 2020-08-07 | 2020-10-23 | 长春科技学院 | 一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对及其鉴别方法 |
| CN112210611B (zh) * | 2020-11-02 | 2023-11-10 | 中国农业科学院特产研究所 | 用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记、鉴别方法及应用 |
| CN114292843B (zh) * | 2021-12-03 | 2023-07-21 | 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 | 一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用 |
| KR20240046529A (ko) * | 2022-03-30 | 2024-04-09 | 인스티튜트 오브 메디시날 플랜트 디벨롭먼트, 차이니즈 아카데미 오브 메디컬 사이언스 | 전체 게놈 분석을 기반으로 한 진핵생물의 종 식별 방법 및 이의 용도 |
-
2023
- 2023-01-10 CN CN202310030583.1A patent/CN116083602B/zh active Active
- 2023-01-10 CN CN202311666156.9A patent/CN117778586A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116083602A (zh) | 2023-05-09 |
| CN116083602B (zh) | 2023-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111235232B (zh) | 基于CRISPR-Cas12a系统的可视化快速核酸检测方法及应用 | |
| Melton et al. | Forensic mitochondria DNA analysis: current practice and future potential | |
| US20210403991A1 (en) | Sequencing Process | |
| CN111394426A (zh) | 用于个人表观基因组学的至天然染色质的转座 | |
| CN115087750B (zh) | 基于全基因组分析的真核生物物种鉴定方法及应用 | |
| CN106520982A (zh) | 一种用于身份鉴定的复合分型系统 | |
| CN110863056A (zh) | 一种人类dna精准分型的方法、试剂和应用 | |
| CN108138244A (zh) | 病毒组捕获测序平台、设计和构建方法以及使用方法 | |
| JP2016518822A (ja) | アセンブルされていない配列情報、確率論的方法、及び形質固有（ｔｒａｉｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）のデータベースカタログを用いた生物材料の特性解析 | |
| CN106702010B (zh) | 一种遗传标记组合、个体基因身份证、二维码、试剂盒及其用途 | |
| CN111549146A (zh) | 一种两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物及其应用方法 | |
| Yi et al. | Unravelling the enigma of the human microbiome: Evolution and selection of sequencing technologies | |
| CN107365840B (zh) | 基于dna条形码的鹿科动物快速鉴定试剂盒及其应用 | |
| CN107365839B (zh) | 一种用于鹿科动物鉴定的引物及其应用 | |
| CN116083602B (zh) | 基于时珍法鉴定鹿科动物的物种特异性靶标序列、试剂盒及应用 | |
| CN115843318B (zh) | 基于全基因组分析与基因组编辑的植物物种鉴定方法与应用 | |
| CN112501320B (zh) | 一种蛇源成分快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN111549107B (zh) | 一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用 | |
| CN110894531A (zh) | 用于猪的str基因座集及用途 | |
| CN110734986B (zh) | 一种获得混合斑迹中个体来源未知的dna的dip-str基因座分型结果的方法和系统 | |
| CN109852706B (zh) | 一种快速鉴定食品中鸭源成分的试剂盒及其应用 | |
| CN108060239B (zh) | 用于区分牦牛与非牦牛牛族的引物对组合产品、试剂盒及方法 | |
| CN106282332B (zh) | 用于多重核酸测序的标签和引物 | |
| CN109825605B (zh) | 一种快速鉴定食品中马源成分的试剂盒及其应用 | |
| CN109852708B (zh) | 一种快速鉴定食品中鹅源成分的试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |