CN117778392A - sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体及其制备方法和应用。本发明首次在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了sstr2a纯合敲除系，这将为鱼类乃至脊椎动物研究机体生长调控提供一个基因功能缺失平台，这个平台将有助于进一步认识sstr2a基因作用机制以及生长负调控作用的意义；与此同时，sstr2a突变鱼在四月龄较野生型增重率提高了10.13％、特定生长率提高了3.18％、肥满度增加了7.48％，这将为提高尼罗罗非鱼养殖产量提供重要支撑，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，涉及sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体及其制备方法和应用。
背景技术
鱼类的优良性状与水产养殖的经济效益息息相关，为进一步提升我国水产品产量，近年来我国在育种技术研发及优良品种培育等方面取得了突飞猛进的发展。
杂交和选育是鱼类育种的主要方式。但由于种间生殖隔离的存在，远缘杂交难以形成可育品系。并且由于缺乏可供参考和借鉴的遗传和繁殖规律，人们难以预判远缘杂交后代可能会出现的后代类型。如果光凭表型优势互补来进行带有盲目性质的育种，容易导致杂交后代死亡、没有杂交优势、难以形成品系等不良结果。因此，杂交育种虽作为鱼类最常规的育种方式仍具有较多局限性。
基因编辑育种则具有明确的目的性，例如“抗冻”、“抗逆”、“瘦肉率高”等。并且基因编辑育种的落脚点在某个基因或者某几个基因，基因功能的缺失往往具有组织特异性，对性腺的发育以及育性往往没有影响，这就避免了传统杂交育种存在的“生殖隔离”问题。
与传统的长周期选择育种相比，CRISPR/Cas9基因编辑育种具有靶向性强、育种周期短等优点。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术常被用于水产动物的快速育种，例如在虹鳟、鲤鱼、牙鲆、罗非鱼、大黄鱼、团头鲂等鱼类中敲除mstn后获得肌肉增生的突变鱼。在斑点叉尾鮰中敲除mc4r后获得体重增加的突变鱼。在罗非鱼中敲除pmela和pmelb后获得金色突变鱼。在泥鳅中敲除tyrb后获得白化突变鱼。可见CRISPR/Cas9基因编辑育种在鱼类中的应用广泛，且更多用于获得具有优良性状的新品种。
鱼类的生长发育受生长激素/胰岛素样生长因子(GH/IGFs)轴的调控，生长抑素(Somatostatin，SS)是对GH/IGFs轴起抑制作用的激素，通过结合生长抑素受体(Somatostatin receptor，SSTR)发挥功能，SSTR属于G蛋白偶联的细胞膜受体。目前的研究表明，SSTR可能通过GH/IGFs轴参与鱼类生长发育的调控。在金鱼的研究表明，SSTR2可能抑制GH的释放。虹鳟体外实验表明SSTR2与IGF-1的合成抑制相关。在草鱼的研究发现，采用SSTR2a拮抗剂MK-4256处理导致幼龄草鱼体重显著增加。目前关于sstr2a基因的敲除研究未见报道，没有直接证据证实sstr调控鱼类生长发育，但大量研究表明，通过抑制sstr可能有促进鱼类生长的潜力。
罗非鱼作为世界性养殖鱼类，具有生长快、繁殖周期短、抗病及适应性强等特点，养殖地区遍布80多个国家和地区。罗非鱼肉厚刺少，富含多不饱和脂肪酸，有“21世纪之鱼”之称，正逐渐成为传统白肉鱼种的替代品种，受到各国市场的青睐。
由此可见，通过sstr2a基因敲除来培育sstr2a基因敲除系尼罗罗非鱼，不仅可以丰富sstr2a基因的功能研究，还可为尼罗罗非鱼新品系的培育提供新思路。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、用于敲除sstr2a基因的gRNA引物组，包括：
sstr2a-gRNA-F：
5’TAATACGACTCACTATAGGTGCACTGGCCCTTCGGAGGTTTTAGAGCTAGAA3’，如SEQ IDNO.1所示；
sstr2a-gRNA-R：
5’AGCACCGACTCGGTGCCAC3’，如SEQ ID NO.2所示。
2、sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体的制备方法，具体步骤如下：
(1)先以gRNA质粒为模板，利用前述引物组进行PCR扩增并回收片段，以T7 RNA聚合酶进行体外转录，得到gRNA；
(2)质粒线性化，切胶回收，体外转录，得到Cas9；
(3)将gRNA和Cas9混合制成混合液，接着利用显微注射仪将混合液注射至1～4细胞受精卵中，孵化；
(4)筛选G0代阳性鱼，养殖至成年以传代；待雄鱼性成熟，将其与野生型雌鱼交配，从而得到不同突变类型的F1代鱼，鉴定选取突变类型相同的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼；待F1代亲鱼性成熟，两者交配得到含有纯合缺失的F2代鱼。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，质粒线性化条件为：37℃水浴3小时。
作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，将gRNA及Cas 9分别稀释至1000ng/μL，并等体积混合，得到混合液。
作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，孵化温度为28℃。
作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，筛选G0代阳性鱼的具体方法为：孵化后第三天收集部分鱼卵，提取DNA，并以此为模板，利用酶切引物进行PCR扩增并回收产物，利用Mln I限制内切酶进行酶切检测，酶切完进行琼脂糖凝胶电泳；由于序列改变，突变后的片段切不开，而未突变的序列则被切开；阳性鱼为嵌合体，故其序列一部分能切开而另一部分不能被切开。
作为进一步优选的技术方案之一，确定gRNA、Cas9工作之后，进行批量注射，在2月龄进行同样的酶切检测，并将阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代。
作为进一步优选的技术方案之一，所述酶切引物包括：
sstr2a-M-F：5’-ACAATTCCATCCCTGAGCCC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
sstr2a-M-R：5’-AGCATCAAAATGTTTGCCGAGT-3’，如SEQ ID NO.4所示。
作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，通过PAGE引物扩增结合测序技术对突变类型进行鉴定，进而选取突变类型相同的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼；纯合突变也通过PAGE引物扩增结合测序技术进行检测。
作为进一步优选的技术方案之一，所述PAGE引物包括：
sstr2a-page-F：5’-ATCCTCAACCTGGCAGTAGC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
sstr2a-page-R：5’-TCCGCTGTGAACCATTAGCC-3’，如SEQ ID NO.6所示。
作为进一步优选的技术方案之一，酶切检测条件为：37℃水浴3小时。
3、sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体，是通过前述制备方法得到的。
4、前述的突变体在培育快速生长尼罗罗非鱼新品系中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了生长抑素受体(SSTR)缺失的尼罗罗非鱼突变体，以便应用于生长调控机制的研究。
本发明首次在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了sstr2a纯合敲除系，这将为鱼类乃至脊椎动物研究机体生长调控提供一个基因功能缺失平台，这个平台将有助于进一步认识sstr2a基因作用机制以及生长负调控作用的意义；与此同时，sstr2a突变鱼在四月龄较野生型增重率提高了10.13％、特定生长率提高了3.18％、肥满度增加了7.48％，这将为提高尼罗罗非鱼养殖产量提供重要支撑，具有良好的应用前景。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为尼罗罗非鱼sstr2a纯合敲除系的建立。A)sstr2a基因结构和突变检测。靶位点在第一个外显子上。红色字母表示Mnl I的限制性酶切位点。Sanger测序结果表明存在不同的突变类型。PAM区域用绿色标记，缺失的碱基用(-)标记，序号右边括号中的数字表示每个等位基因的碱基缺失或插入数量。B)sstr2a纯合突变系的构建。C)+4bp的sstr2a截断蛋白结构图。D)sstr2a纯合突变体Sanger测序峰图。E)sstr2a纯合突变体PAGE电泳检测图。
图2为sstr2a-/-罗非鱼生长实验。A)体长(Body length)；B)体重(Body weight)；C)体宽(Body width)；D)体厚(Body height)，结果表示为3个组的平均值±标准差，每组11条鱼。统计分析采用非配对双尾Student’s t-test进行。*，P<0.05；**，P<0.01。WT，野生型。dpf，受精后天数。
图3为四月龄sstr2a-/-罗非鱼GH/IGFs轴基因表达检测；A)120dpf野生型和sstr2a-/-鱼垂体gh表达(n＝6)。B)120dpf野生型和sstr2a-/-鱼肝脏GH/IGFs轴基因表达(n＝6)。结果表示为平均值±标准差。统计分析采用非配对双尾Student’s t-test进行。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。以gapdh作为内参基因。WT，野生型。dpf，受精后天数。
图4为四月龄sstr2a-/-罗非鱼血清GH和IGF-1激素水平检测；A)120dpf野生型和sstr2a-/-鱼血清GH水平(n＝6)。B)120dpf野生型和sstr2a-/-鱼血清IGF-1水平(n＝6)。结果表示为平均值±标准差。统计分析采用非配对双尾Student’s t-test进行。*，P<0.05。以gapdh作为内参基因。WT，野生型。dpf，受精后天数
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
步骤一 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对尼罗罗非鱼sstr2a基因进行有效打靶
1、靶点设计
在NCBI上下载罗非鱼sstr2a基因的全序列，并根据CRISPR/gRNA靶序列设计网站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)在sstr2a的第一个外显子上设计靶点，设计gRNA引物序列后送华大公司合成。
sstr2a-gRNA-F：
5’TAATACGACTCACTATAGGTGCACTGGCCCTTCGGAGGTTTTAGAGCTAGAA3’
sstr2a-gRNA-R：
5’AGCACCGACTCGGTGCCAC3’
2、gRNA和Cas9合成及显微注射
2.1gRNA合成
1)以gRNA质粒(Minghui Li,et al.Efficient and heritable gene targetingin tilapia by CRISPR/Cas9.Genetics.2014Jun；197(2):591-9.doi:10.1534/genetics.114.163667.)为模板，用设计好的F引物和通用R引物进行扩增并回收片段，TaqDNA聚合酶(2×Taq Master Mix)购自Takara公司(Takara，中国)。反应体系见表1。
表1
反应条件：退火温度60℃；延伸时间10s
2)体外转录
体外mRNA转录试剂盒T7 mMESSAGEKit购自Ambion公司(Ambion，美国)，以T7 RNA聚合酶进行体外转录，体系见表2。
表2
混匀后，37℃水浴2h。加入2μl的DNase I，37℃水浴15分钟。加入50μl无水乙醇和2μl醋酸钠，混匀，-80℃过夜。4℃，12000rpm离心25分钟，弃上清；体积浓度70％乙醇溶液洗2次；空离5分钟，吸去多余酒精，超净吹干并加入适量无酶水；测浓度，电泳检测，-80℃保存。
2.2Cas9合成
1)质粒线性化：限制性内切酶Xba I购自NEB公司(NEB，北京)，线性化体系见表3。
表3
线性化条件：37℃水浴，3h。
2)切胶回收(胶浓度：1％)；
3)体外转录；
以上步回收产物为模板进行体外转录，体外mRNA转录试剂盒T7 mMESSAGE
Kit购自Ambion公司(Ambion，美国)，体系见表4。
表4
2.3显微注射
将gRNA及Cas 9稀释至1000ng/μL。按照1:1比例各1μl进行混合，并加入约0.4μl酚红溶液(起指示作用)。将混合液转至微型针管中并利用显微注射仪将其注射至1细胞—4细胞受精卵中，同时单独注射gRNA和Cas9做阴性对照。注射完成后，将其转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化(孵化至出膜后)。
3、G0代阳性鱼的突变筛选
3.1突变检测引物设计
引物在NCBIPrimer blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上进行设计并检测其特异性。酶切及PAGE引物如下：
酶切引物：
sstr2a-M-F：5’-ACAATTCCATCCCTGAGCCC-3’
sstr2a-M-R：5’-AGCATCAAAATGTTTGCCGAGT-3’
PAGE引物：
sstr2a-page-F：5’-ATCCTCAACCTGGCAGTAGC-3’
sstr2a-page-R：5’-TCCGCTGTGAACCATTAGCC-3’
3.2F0检测：
孵化后第三天收集部分鱼卵，并采用苯酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA，收集注射后的鱼卵采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取基因组DNA，并以此为模板，用预先设计好的酶切引物进行PCR扩增并回收产物，利用Mln I限制内切酶(序列未突变即可切开，序列突变则切不开)进行酶切检测，Mln I限制内切酶购自NEB公司(NEB，北京)。体系见表5。
表5
条件：37℃水浴，3h。
酶切完进行琼脂糖凝胶电泳(胶质量浓度，1.5％；时间，20min)。
由于序列改变，突变后的片段切不开，而未突变的序列则被切开。阳性鱼为嵌合体，故其序列一部分能切开而另一部分不能被切开。确定gRNA、Cas9工作之后，进行批量注射，在2月龄进行同样的酶切检测，并将阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代。
步骤二 基于G0代阳性鱼的传代建系
1、获得杂合子sstr2a突变F1代；
待雄鱼性成熟(6月龄左右)，将其与野生型雌鱼交配，从而得到不同突变类型的F1代鱼，通过PAGE引物扩增结合测序技术对突变类型进行鉴定，选取突变类型相同(且碱基非3的倍数缺失)的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼。待F1代亲鱼性成熟，两者交配即可得到含有纯合缺失的F2代鱼。
2、获得纯合子sstr2a突变F2代
纯合突变采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结合测序技术进行检测。首先提取F2代鱼基因组DNA，以此为模板利用PAGE引物扩增并将扩增产物进行PAGE，后经凝胶成像系统成像。通过条带显示判断野生型(一条带)、杂合子(4条带)以及纯合子(1条带)。将初步检测出的纯合鱼，提取尾鳍基因组，利用Mln I限制内切酶进行酶切，将未切开的条带亚克隆后送测序公司(擎科，中国)测序，以确认检测结果。
综上，依托于CRISPR/Cas9基因编辑技术以及显微注射技术，本发明成功获得sstr2a基因突变F0代阳性鱼。敲除靶位点设计在第一个外显子上，序列为：“TGCACTGGCCCTTCGGAGAGG”，含Mnl I酶切位点。F0代基因组酶切显示，在gRNA和Cas9 mRNA双注射的泳道，有未被切开的条带，表明在G0代基因组水平出现阳性突变(图1中A)。将阳性雄鱼作为父本，以野生型雌鱼为母本，通过杂交得到F1代。筛选F1代突变类型相同雌雄鱼并将其作为父母本进而杂交得到F2代(图1中B)。通过sanger测序、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和蛋白预测对纯合子进行鉴定(图1中C,D,E)。测序峰图比较发现纯合子靶点处增添4bp(AGAG)，这种突变会导致sstr2a形成一个没有功能的截断蛋白，PAGE结果显示：野生型只有一条带；杂合子含有四条带：位于上方的两条异源双链、位于下方的一条野生型带和一条突变带；纯合子只有一条突变带。综上所述，我们在尼罗罗非鱼中成功地建立了sstr2a纯合突变系。
步骤三 基于sstr2a纯合突变鱼的生长实验和生长性能检测
1、生长实验
将获得的F2代混合饲养，在60dpf时筛选突变类型分缸喂养，选取体长、体重及生长状态无异的野生型和sstr2a-/-鱼各33条，养殖于同一循环水系统的两个水箱中，保证喂养的条件相同，采取饱食投喂，每次投喂时间控制在10min内，每天投喂早晚2次(早9：00,晚18：00)，设置3个重复。在90dpf的时候，对各组鱼体长、体重、体宽和体厚进行测量，后每15天测量一次并统计直到150dpf。具体测量方法如下：
体长(Body length,cm)：将鱼置放于桌面上，摆好直尺，准确计量鱼体嘴尖到尾根部长度(体长精确到1位小数,单位:cm)。
体重(Body weight,g)：称重前禁食一晚。用网将鱼依次捞出并用毛巾擦净体表水分，采用小型体重称对每个个体进行准确称重(体重精确到两位小数,单位:g)。
体宽(Body width,cm)：计量鱼体背鳍从头数2-3鳍条处到鱼体腹部的垂直距离(体宽精确到1位小数,单位:cm)。
体厚(Body depth,mm)：将鱼立放，采用电子游标卡尺准确计量体厚(体宽精确到1位小数，单位:mm)。
2、生长性能检测
实验开始时鱼的平均体重为初始平均体重(Initial body weight,IBW)，实验结束时鱼的平均体重为最终平均体重(Final body weight,FBW)。食物摄入量(Food intake,FI)是在实验过程中消耗的食物量相对于鱼的重量。增重率(Weight gain rate,WGR)是实验开始到结束的鱼的重量与数量的比值。肝体指数(Hepatosomatic index,HSI)是指肝脏质量与身体质量的比值。饲料系数(Feed coefficient,FC)是饲料消耗与鱼增重的比率。特定生长率(Specific growth rate,SGR)是相当于鱼大小的生长率。肥满度(Conditionfactor,CF)是鱼体重量与体长立方数的比值。每个处理以3个重复的平均值为基础，计算方式如下：
WGR(％)＝100×(Wf/Nf-Wi/Ni)/(Wi/Ni)
SGR(％/day)＝100×[ln(Wf/Nf)-Ln(Wi/Ni)]/T
CF(g/cm3)＝(Wf’/Lf’3)×100
FI(％/day)＝100×I/[(Wi+Wf)/2×T]
FC＝I/(Wf-Wi)
HSI(％)＝liver wet weight×100/body wet weight
注：I(g)：饲料总消耗量，Wi(g)：初始总体重，Wf(g)：最终总体重，Wf’(g)：最终平均体重，Lf’(cm)：最终平均体长，Ni：初始鱼数，Nf：最终鱼数，T：实验持续时间。
3、数据处理
数据在WPS Excel 2020上进行整理后，在graphpad prism5.0上进行画图和组间差异性分析，显著水平定为0.05，实验数据用平均值±标准误表示。
生长实验结果表明，sstr2a-/-鱼的体长、体重、体宽和体厚明显大于野生型，特别是在120dpf均差异显著(图2中A、B、C、D)。进一步对野生型和sstr2a-/-鱼的生长性能进行了检测。结果表明，与野生型相比，在120dpf，sstr2a-/-鱼的增重率提高了10.13％，特定生长率提高了3.18％，肥满度增加了7.48％，食物摄入量减少了7.28％，饲料系数减少了9.35％，其中增重率和肥满度均有显著差异(P＜0.05)；在150dpf，sstr2a-/-鱼的增重率提高了3.14％，特定生长率提高了0.88％，肥满度增加了6.56％、食物摄入量减少了4.87％，饲料系数减少了4.92％，其中肥满度有显著差异(P＜0.05)(表6)。这些数据表明，sstr2a-/-罗非鱼具有较野生型更为良好的生长性能。
表6生长性能试验
注：IBW(g)代表90dpf鱼初始平均体重；FBW(g)代表终末平均体重；WGR(％)代表增重率；SGR(％/day)代表特定生长率；CF(g/cm3)代表肥满度；FI(％/day)代表食物摄入量；FC代表饲料系数。不同字母表示存在显著性差异；表中列了两个时期的突变鱼和对照的对比数据，a、b代表120dpf的，A、B代表150dpf的。
本发明通过RT-qPCR和酶联免疫(ELISA)实验，分析了sstr2a突变对罗非鱼GH/IGFs轴的影响(图3中A)。RT-qPCR结果显示，与野生型相比，sstr2a-/-鱼垂体中gh表达显著上调，肝脏中igf1、ghr2、igf1ra、igf1rb、igfbp1和igfbp4表达显著上调(图3中B)。进一步对血清GH和IGF-1激素水平检测发现，与野生型相比，sstr2a-/-鱼血清中GH和IGF-1含量显著升高(P＜0.05)(图4中A、B)。因此，这些数据表明导致sstr2a-/-罗非鱼生长加快的原因是GH/IGFs轴的上调。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.用于敲除sstr2a基因的gRNA引物组，其特征在于，包括：
sstr2a-gRNA-F：
5’TAATACGACTCACTATAGGTGCACTGGCCCTTCGGAGGTTTTAGAGCTAGAA3’，如SEQ ID NO.1所示；
sstr2a-gRNA-R：
5’AGCACCGACTCGGTGCCAC3’，如SEQ ID NO.2所示。
2.sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先以gRNA质粒为模板，利用权利要求1所述引物组进行PCR扩增并回收片段，以T7RNA 聚合酶进行体外转录，得到gRNA；
(2)质粒线性化，切胶回收，体外转录，得到Cas9；
(3)将gRNA和Cas9混合制成混合液，接着利用显微注射仪将混合液注射至1～4细胞受精卵中，孵化；
(4)筛选G0代阳性鱼，养殖至成年以传代；待雄鱼性成熟，将其与野生型雌鱼交配，从而得到不同突变类型的F1代鱼，鉴定选取突变类型相同的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼；待F1代亲鱼性成熟，两者交配得到含有纯合缺失的F2代鱼。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，质粒线性化条件为：37℃水浴3小时。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将gRNA及Cas 9分别稀释至1000ng/μL，并等体积混合，得到混合液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，筛选G0代阳性鱼的具体方法为：孵化后第三天收集部分鱼卵，提取DNA，并以此为模板，利用酶切引物进行PCR扩增并回收产物，利用Mln I限制内切酶进行酶切检测，酶切完进行琼脂糖凝胶电泳；由于序列改变，突变后的片段切不开，而未突变的序列则被切开；阳性鱼为嵌合体，故其序列一部分能切开而另一部分不能被切开。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，确定gRNA、Cas9工作之后，进行批量注射，在2月龄进行同样的酶切检测，并将阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代；
所述酶切引物包括：
sstr2a-M-F：5’-ACAATTCCATCCCTGAGCCC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
sstr2a-M-R：5’-AGCATCAAAATGTTTGCCGAGT-3’，如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，通过PAGE引物扩增结合测序技术对突变类型进行鉴定，进而选取突变类型相同的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼；纯合突变也通过PAGE引物扩增结合测序技术进行检测。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述PAGE引物包括：
sstr2a-page-F：5’-ATCCTCAACCTGGCAGTAGC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
sstr2a-page-R：5’-TCCGCTGTGAACCATTAGCC-3’，如SEQ ID NO.6所示。
9.sstr2a基因敲除尼罗罗非鱼突变体，其特征在于，是通过权利要求2～8所述制备方法得到的。
10.权利要求9所述的突变体在培育快速生长尼罗罗非鱼新品系中的应用。
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