CN117756858A - 一种一氧化氮供体型四价铂前药及其制备方法与应用 - Google Patents

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CN117756858A CN202311739512.5A CN202311739512A CN117756858A CN 117756858 A CN117756858 A CN 117756858A CN 202311739512 A CN202311739512 A CN 202311739512A CN 117756858 A CN117756858 A CN 117756858A
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黄张建
吴建兵
张奕华
张宸
袁逊
杨珊
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Abstract

本发明公开了一种结构式为I的一氧化氮供体型四价铂前药及其制备方法与应用，所述药物选择性地在肿瘤细胞中被激活，其结构中的四价铂被还原为顺铂，同时顺铂作为生物正交反应催化剂，催化NO供体片段释放出NO，后者与顺铂协同发挥抗肿瘤增殖及抗肿瘤转移活性；而在正常细胞中化合物则不具有上述过程，从而具有较好的安全性；并且本发明中的化合物具有独特的氨基甲酸酯碳长链结构，这种结构可帮助前药与白蛋白结合，提高了药物的循环稳定性和药代特性，具有较优的体内抗肿瘤增殖及体内抗肿瘤转移活性。

Description

一种一氧化氮供体型四价铂前药及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种药物及其制备方法和应用，特别涉及一种一氧化氮供体型四价铂前药及其制备方法和应用。
背景技术
目前，恶性肿瘤的发病率和死亡率发病率在全球范围内不断上升。化疗是肿瘤治疗的标准疗法，其中铂(Pt)类药物广泛用于各种肿瘤，约占癌症患者可用治疗方案的一半。铂衍生物，包括顺铂(DDP)和卡铂等，在各种癌症治疗中受到关注。但铂类药物虽使用至今，也存在诸多缺点，比如靶向性差等。
生物正交化学
生物正交化学反应化学具有1)可靠，选择性，与其他功能正交；2)模块化，适用范围广；3)产量高等特点。生物正交化学金属催化剂目前应用最广泛的包括金，铜和钯等。由于铂和钯位于元素周期表的同一主族，研究证明，顺铂可以作为一种生物正交催化剂，催化键断裂反应。但是由于顺铂具有较强的细胞毒性，不能直接给药，因此需要对顺铂进行前药改造。四价铂前药可以选择性地在肿瘤细胞还原介质的作用下还原为顺铂，顺铂与肿瘤细胞内的DNA发生交联，同时也可发挥生物正交化学催化作用，释放NO。
四价铂前药
四价铂前药是一类可能改善二价铂抗肿瘤药物药理性质的新型分子，其具有八面体低自旋5d6铂(IV)络合物相比平面5d8铂(II)络合物在动力学上更加惰性，这种差异可使四价铂化合物作为前药递送，并且在到达目标肿瘤部位之前具有较少的副反应。与Pt(II)相比，Pt(IV)的轴向取代基的引入可通过调节还原电位以及亲脂性来改善分子的药代动力学、生物活性和靶向能力。四价铂配合物被还原时发生两个电子的转移，被还原成具有抗肿瘤活性的二价铂，同时伴随着两个轴向配体的释放。
NO供体型药物
NO供体型药物一般是指由NO供体及相关药物或某种活性化合物通过各种连接基团而形成的前药。现已发现多种结构类型的NO供体，如亚硝基硫醇、硝酸酯、NO-金属复合物(硝普盐)、呋咱N-氧化物、偶氮鎓二醇盐等；其中，偶氮鎓二醇盐(diazeniumdiolates)在选择性和靶向性释放NO方面具有明显优势。一方面是偶氮鎓二醇盐在生理条件下极易不稳定，能自动释放1～2分子NO，其半衰期从几秒钟到几小时不等。另一方面，将偶氮鎓二醇盐的O2位(与氮鎓离子相连的O称之为O1，与烯键氮原子相连的O为O2)烷基化后，可转化成在生理条件下稳定的前药；通过体内某些特定酶识别或特殊生理环境作用下，去除O2保护基团，转化为不稳定的偶氮鎓二醇盐阴离子，从而达到选择性和靶向性释放NO。迄今为止，已发展出多种O2保护新策略。
专利202011077271.9合成了一种基于生物正交化学的整合型前药，包含四价铂配合物和偶氮鎓二醇盐片段的有机化合物，该化合物是以四价铂配合物和一氧化氮供体分子为基础，通过化学偶联方法，利用丁二酸酯键将一氧化氮供体分子和四价铂配合物连接起来，作为一个整体分子，具有抗肿瘤活性。但是，其循环稳定性和药代特性有待提高。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种提高循环稳定性和药代特性的一氧化氮供体型四价铂前药；本发明的第二目的为提供所述一氧化氮供体型四价铂前药的制备方法；本发明的第三目的为所述一氧化氮供体型四价铂前药的应用。
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，其结构式为：
其中，R1为哌嗪基或N-甲基乙醇胺基，为顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂，R2选自C4～C18。
所述一氧化氮供体型四价铂前药包含氨基甲酸酯碳链、四价铂配合物和偶氮鎓二醇盐片段，以氨基甲酸酯碳链、四价铂配合物和一氧化氮供体分子为基础，通过化学偶联方法，利用丁二酰基将NO供体分子和四价铂氨基甲酸酯碳链配合物连接起来，作为一个整体分子。
优选的，所述R2选自C6～C12。
优选的，所述R2为十二烷基。
优选的，所述为顺式二胺二氯二羟基铂。
优选的，所述R1为哌嗪基。
优选的，所述一氧化氮供体型四价铂前药的结构式为：
所述的一氧化氮供体型四价铂前药的制备方法，当R1为哌嗪基，包括以下步骤：
(1)化合物I4与丁二酸酐发生酰胺缩合反应得到化合物I5；
(2)化合物I5与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应得到化合物I6；
(3)化合物I6与顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂发生酯交换反应得到化合物I7；
(4)化合物I7与R2-N＝C＝O发生胺基化反应得到化合物I8；
合成路线如下：
其中，R2选自C4～C18。
化合物Ⅰ5的合成：取化合物Ⅰ4溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺作为缚酸剂，20～25℃搅拌后加入丁二酸酐，20～25℃搅拌反应12～18h，反应液浓缩后柱层析得到黄色固体产物Ⅰ5；所述化合物Ⅰ4与丁二酸酐的摩尔比为1：1～1.5。所述柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷和甲醇。
化合物Ⅰ6的合成：取化合物Ⅰ5于单颈反应瓶中，加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，碳酸二甲酯(DCC)，并加入二氯甲烷溶解，反应液在20～25下搅拌反应2～4h。过滤收集滤液，浓缩除去二氯甲烷，柱层析得到目标产物Ⅰ6。所述化合物Ⅰ5与NHS的摩尔比为1：1～1.5；所述柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷和甲醇。
化合物Ⅰ7的合成：取化合物Ⅰ6于单颈反应瓶中，加入顺或反式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂，加入DMSO，反应液在75～80℃下避光搅拌反应4～5h。随后过滤得Ⅰ7的黄色DMSO溶液，可直接用于下一步反应。所述化合物Ⅰ6与顺或反式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂的摩尔比为1：1～1.5。
化合物Ⅰ8的合成：往Ⅰ7的黄色DMSO溶液中滴加四烷基异氰酸酯、八烷基异氰酸酯、十二烷基异氰酸酯或十八烷基异氰酸酯，20～25℃避光搅拌4～5h。反应结束后，加入饱和氯化钠水溶液至反应液，用二氯甲烷萃取，有机层浓缩，柱层析得到目标产物Ⅰ8a-e。所述柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷和甲醇。所述化合物Ⅰ7与烷基异氰酸酯的摩尔比为1：1～1.5。
所述I4的合成路线如下：
化合物Ⅰ2的合成：将N-boc哌嗪和甲醇钠的甲醇溶液混合加入到聚四氟容器中，加入四氢呋喃、无水乙醚，将反应体系N2置换后，通入一氧化氮(NO)气体，使压力达到0.4～0.8MPa，20℃～25℃密闭反应40～48h。反应结束后，放掉未反应的过量的NO气体，使压力降为常压，打开容器后，将反应液倒入无水乙醚中析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤，干燥，收集白色产物即为化合物Ⅰ2。
化合物Ⅰ3的合成：取化合物I2、十五冠五醚和DMF加入到100mL两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行N2保护，然后取溴丙炔缓慢滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下反应，然后将反应液移至20℃～25℃继续反应。反应结束后，首先蒸除DMF，剩余物柱层析得到黄色固体Ⅰ3。所述柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷和甲醇。
化合物Ⅰ4的合成：取化合物Ⅰ3溶解于二氯甲烷中，20℃～25搅拌，加入饱和碳酸氢钠溶液至pH为7.5～8.0。反应结束后，用饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机层，干燥，浓缩得到化合物Ⅰ4。
所述的一氧化氮供体型四价铂前药的制备方法，当R1为N-甲基乙醇胺基，包括以下步骤：
(1)化合物Ⅱ3与丁二酸酐发生酰胺缩合反应得到化合物Ⅱ4；
(2)化合物Ⅱ4与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应得到化合物Ⅱ5；
(3)化合物Ⅱ5与顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂发生酯交换反应得到化合物Ⅱ6；
(4)化合物Ⅱ6与R2-N＝C＝O发生胺基化反应得到化合物Ⅱ7；
合成路线如下：
其中，R2选自C4～C18。
化合物Ⅱ4的合成：取化合物Ⅱ3溶解于无水四氢呋喃中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)，20℃～25℃搅拌1～2h后，加入丁二酸酐，反应液回流反应10～12h。后处理，首先将反应液过滤，滤液浓缩后加入水，用二氯甲烷萃取，浓缩有机层得到化合物Ⅱ4。所述化合物Ⅱ3与丁二酸酐的摩尔比为1：1～1.5。
化合物Ⅱ5的合成：取化合物Ⅱ4于单颈反应瓶中，加入NHS，DCC，并加入二氯甲烷溶解，反应液在20℃～25℃下搅拌反应2～4h。然后，过滤收集滤液，浓缩除去二氯甲烷，剩余物制砂，柱层析得到目标产物Ⅱ5。所述柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷和甲醇。所述化合物Ⅱ4与NHS的摩尔比为1：1～1.5。
化合物Ⅱ6的合成：取化合物Ⅱ5于单颈反应瓶中，加入顺或反式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂和DMSO，反应液在75～80℃下避光搅拌反应4～5h。后处理，过滤得Ⅱ6的黄色DMSO溶液，直接用于下一步反应。所述化合物Ⅱ5与顺或反式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂的摩尔比为1：1～1.5。
化合物Ⅱ7的合成：往Ⅱ6的黄色DMSO溶液中滴加四烷基异氰酸酯、八烷基异氰酸酯、十二烷基异氰酸酯或十八烷基异氰酸酯，20～25℃避光搅拌反应4～5h。随后加入饱和氯化钠水溶液至反应液，用二氯甲烷萃取，浓缩除去二氯甲烷，柱层析得到目标产物Ⅱ7。所述柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷和甲醇。
所述化合物Ⅱ3的合成路线如下：
化合物Ⅱ2的合成：将N-甲基-2-羟基乙胺、甲醇钠的甲醇溶液混合加入到聚四氟容器中，加入无水乙醚，将反应体系N2置换后，通入一氧化氮(NO)气体，使压力达到0.4～0.8MPa，室温密闭反应。后处理，放掉未反应的过量的NO气体，使压力降为常压，打开容器后，将反应液倒入无水乙醚中析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤，置于真空干燥箱中室温进行干燥，收集白色产物即为化合物Ⅱ2。得到的化合物Ⅱ2不经纯化直接进行下一步反应。
化合物Ⅱ3的合成：取化合物Ⅱ2和DMF加入到两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行N2保护，然后取溴丙炔缓缓滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下反应，然后将反应液移至室温继续反应。后处理，首先通过旋蒸除去DMF，柱层析得到无色油状物Ⅱ3。所述柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷和甲醇。
所述的一氧化氮供体型四价铂前药的制备方法，所述化合物I6或Ⅱ5与顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂发生酯交换反应中，所用溶剂为无水DMSO，反应条件为避光，75～80℃。
本发明的一种药物组合物，含有所述一氧化氮供体型四价铂前药及药学上可接受的载体。
所述一氧化氮供体型四价铂前药或其溶剂合物在预防或治疗抗肿瘤药物中的应用。
发明机理：本发明将NO供体偶氮鎓二醇盐与四价铂配合物这两个片段整合在一起，同时在分子中加入了长烷基链部分，合成了一种新的生物正交自催化NO供体/Pt(IV)前体药物。该药物可帮助前药与血清白蛋白结合，使得前药结合在白蛋白表面下，防止循环系统中还原物质对其降解，改善了前述专利(ZL202011077271.9)中所涉及化合物的循环稳定性和药代特性，从而具有更优的体内抗肿瘤增殖及体内抗肿瘤转移活性。该前药可以选择性地在肿瘤细胞中被激活，其结构中的四价铂被还原为顺铂，一方面，其与肿瘤细胞内DNA发生交联，从而发挥抗肿瘤作用；另一方面，顺铂作为生物正交催化剂，在肿瘤细胞内催化O2保护的偶氮鎓二醇盐发生生物正交键断裂反应，使得NO在肿瘤细胞内特异性释放，释放的NO可导致金属转运体抗氧化1铜伴侣蛋白(Antioxidant1copper chaperone,Atox1)和铜离子转运ATP酶α肽(P-type ATPases,ATP7a)的S-亚硝基化并造成活性降低，进一步抑制赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)的Cu负荷，增加Pt在细胞中的滞留，起到协同抗肿瘤作用，而在正常细胞中化合物则不具有上述过程，从而具有较好的安全性。并且本发明中的化合物具有独特的碳长链结构，这种结构可帮助前药与白蛋白结合，改善了四价铂前药的循环稳定性和药代特性，进一步在体内可产生优异的抗肿瘤增殖及抗肿瘤转移活性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明首次合成了具有独特氨基甲酸酯碳长链结构的新化合物Ⅰ8a-e、II7a和II7b。通过表面等离子共振生物传感器(surface plasmon resonance,SPR)实验首先证明了Ⅰ8c与人血清白蛋白的结合能力。这种与白蛋白的结合能力使得本发明中的前药相比专利ZL202011077271.9中的化合物具有更高的循环稳定性和更优的药代特性，从而使得本发明中包含的化合物有了更优的体内抗肿瘤增殖及体内抗肿瘤转移活性。抗肿瘤机制研究表明，化合物Ⅰ8c会优先进入到肿瘤细胞中，四价铂被还原为顺铂，同时顺铂催化化合物释放NO，NO导致Atox1和ATP7a的S-亚硝基化，进一步抑制赖氨酰氧化酶LOX的Cu负荷，增加Pt在细胞中的滞留，起到NO与铂的协同抗肿瘤作用。与目前存在的生物正交前药相比较，化合物Ⅰ8c可以避免分开给药，增强了化合物的靶向性，也减少了催化剂的毒性。其氨基甲酸酯碳长链结构与人血清白蛋白的结合能力极大地提高了化合物Ⅰ8c的成药性。
附图说明：
图1A是用HPLC测定化合物11(ZL202011077271.9中化合物的类似物，不包含烷基长链结构)、Ⅰ8a、Ⅰ8b、Ⅰ8c、Ⅰ8d、Ⅱ7在大鼠血浆中2小时的稳定性数据；图1B～C是Ⅰ8c在大鼠血浆中半衰期的测定结果图；
图2是化合物Ⅰ8a、Ⅰ8b、Ⅰ8c、Ⅰ8d、Ⅱ7a、顺铂(DDP)在10μM浓度下对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性测试结果图；
图3A～B是Ⅰ8c与化合物11和人血清白蛋白结合常数KD测定实验结果(SPR)，图3C-D是Ⅰ8c与人血清白蛋白结合情况的计算机对接结果图；
图4A是相同浓度的Ⅰ8c和cisplatin分别与MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞孵育24h后，通过ICP-MS检测细胞的Pt摄取情况图；图4B是相同方法孵育48h后的Pt摄取情况图；
图5是相同浓度的Ⅰ8c与MCF-7细胞、MCF-7/DDP细胞、MDA-MB-231细胞孵育后的细胞内NO释放结果图；
图6A是化合物Ⅰ8c进行Transwell实验验证其抑制MDA-MB-231细胞迁移能力的实验结果图；图6B是化合物Ⅰ8c进行划痕实验验证其抑制MDA-MB-231细胞迁移能力的实验结果图；
图7是Ⅰ8c小鼠体内抗MDA-MB-231移植瘤药效评价的实验结果图；其中，图7A是每隔一天测量和计算肿瘤体积结果；图7B是每隔一天测量小鼠体重结果；图7C是小鼠瘤重称量结果；图7D是小鼠肿瘤图片；
图8是Ⅰ8c小鼠体内抗MDA-MB-231-luc肺转移的实验结果图；其中，图8A是3张具有代表性的小动物荧光成像图像；图8B是各组小鼠肺部荧光强度定量计算的统计图；
图9A是利用Biotin-Switch法验证Ⅰ8c所释放的NO造成MDA-MB-231细胞内Atox1和ATP7a亚硝基化升高的实验结果图；图9B是其条带灰度统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
实施例1
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，Ⅰ8a的制备方法包括如下步骤：
(1)化合物Ⅰ2的合成：
将N-boc哌嗪(I1，10g)、甲醇钠的甲醇溶液(5.4mol/L)12.18g混合后，加入到聚四氟容器中，加入四氢呋喃20ml、无水乙醚120mL，将反应体系N2置换后，通入一氧化氮(NO)气体，使压力达到0.4～0.8MPa，室温密闭反应48h。反应结束后，放掉未反应的过量的NO气体，使压力降为常压，打开容器后，将反应液倒入1L的无水乙醚中析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗3次，至于真空干燥箱中干燥2h，收集白色产物即为化合物Ⅰ2。
(2)化合物Ⅰ3的合成：
取4g化合物I2(14.9mmol)、十五冠五醚(0.149mmol)和25mL DMF加入到100mL两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行N2保护，然后取2.22ml溴丙炔(29.8mmol)缓慢滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下反应0.5h，然后将反应液移至室温继续反应12h。反应结束后，首先通过旋蒸除去DMF，剩余物柱层析得到黄色固体Ⅰ3。柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷与甲醇体积比为20：1。
(3)化合物Ⅰ4的合成：
取1g(3.52mmol)化合物Ⅰ3溶解于10mL二氯甲烷中，加入3ml的二氯甲烷，室温搅拌2h后加入饱和碳酸氢钠溶液至pH为8.0。反应结束后，用饱和氯化钠溶液洗三遍，收集有机层，干燥，浓缩得到化合物Ⅰ4。
(4)化合物Ⅰ5的合成：
取1.1g化合物Ⅰ4(5.97mmol)溶解于40mL二氯甲烷中，加入1.2g的三乙胺(11.9mmol),室温搅拌15mins后加入1.2g的丁二酸酐(11.94mmol)，常温搅拌过夜，反应液浓缩后柱层析得到黄色固体产物Ⅰ5。柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷与甲醇积比为10：1。
(5)化合物Ⅰ6的合成：
取100mg化合物Ⅰ5(0.175mmol)于单颈反应瓶中，加入21.9mg NHS(0.19mmol)，39.2mg DCC(0.19mmol)，并加入3mL的二氯甲烷溶解，反应液在室温下搅拌30mins。过滤收集滤液，浓缩除去二氯甲烷，柱层析得到目标产物Ⅰ6。柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷与甲醇积比为10：1。
(6)化合物Ⅰ7的合成
取86.5mg化合物Ⅰ6(0.23mmol)于单颈反应瓶中，加入76.8mg顺式二胺二氯二羟基铂(顺铂)，加入2mL的DMSO，反应液在80℃下避光搅拌5h。随后过滤得Ⅰ7的黄色DMSO溶液。可直接用于下一步反应。
(7)化合物Ⅰ8a的合成
往Ⅰ7的黄色DMSO溶液中滴加四烷基异氰酸酯(0.368mmol)，常温避光搅拌5h。反应结束后，加入饱和氯化钠水溶液至反应液，用二氯甲烷萃取三次，有机层浓缩，柱层析得到目标产物Ⅰ8a。
化合物Ⅰ8a：淡黄色固体，43mg。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ6.18(s,6H),5.73–5.51(m,1H),4.80(s,2H),3.72(d,J＝22.5Hz,4H),3.60–3.40(m,4H),3.21–2.89(m,2H),2.68(s,2H),2.60(d,J＝11.6Hz,2H),2.24(s,1H),1.48–1.35(m,2H),1.33–1.26(m,2H),0.88(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ180.03,170.39,163.86,79.00,78.46,60.58,50.63,50.38,43.20,31.95,30.83,28.49,19.54,13.76.HRMS(ESI)calculated forC16H31Cl2N7O7Pt,[M+H]+:699.13880；found:699.13859.ppm error 0.3.
实施例2
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，Ⅰ8b的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)～(7)同实施例1，区别在于，步骤(7)中采用八烷基异氰酸酯代替四烷基异氰酸酯。
化合物Ⅰ8b：淡黄色固体，58mg，。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ6.16(s,6H),5.58(s,1H),4.79(s,2H),3.74(s,2H),3.67(s,2H),3.53(s,2H),3.48(s,2H),3.04(s,2H),2.79–2.63(m,2H),2.62–2.53(m,2H),2.25(d,J＝35.0Hz,1H),1.49–1.35(m,2H),1.31–1.20(m,10H),0.86(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ180.03,170.38,162.28,78.97,78.44,60.58,50.62,50.38,43.19,31.24,30.76,29.82,28.82,28.69,28.49,26.43,22.07,13.92.HRMS(ESI)calculated for C20H39Cl2N7O7Pt,[M+H]+:755.20140；found:755.19994.ppm error 1.9.
实施例3
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，Ⅰ8c的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)～(7)同实施例1，区别在于，步骤(7)中采用十二烷基异氰酸酯代替四烷基异氰酸酯。
化合物Ⅰ8c：淡黄色固体，69mg。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ6.17(s,6H),5.58(s,1H),4.80(d,J＝2.2Hz,2H),3.75(s,2H),3.67(s,2H),3.53(s,2H),3.48(s,2H),3.03(s,2H),2.81–2.65(m,2H),2.61–2.55(m,2H),2.25(s,1H),1.54–1.34(m,2H),1.31–1.19(m,18H),0.86(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(75MHz,Chloroform-d)δ182.75,171.82,163.82,77.24,76.72,61.19,50.92,50.80,43.95,31.92,30.03,29.73,29.68,29.54,29.37,27.10,22.68,14.10.HRMS(ESI)calculated for C24H47Cl2N7O7Pt,[M+H]+:811.26400；found:811.26082.ppm error 3.9.
实施例4
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，Ⅰ8d的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)～(7)同实施例1，区别在于，步骤(7)中采用十八烷基异氰酸酯代替四烷基异氰酸酯。
化合物Ⅰ8d：淡黄色固体，63mg。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ6.15(s,6H),5.54(s,1H),4.80(d,J＝2.5Hz,2H),3.75(s,2H),3.67(t,J＝3.9Hz,2H),3.54(s,2H),3.49(s,2H),3.04(s,2H),2.68(s,2H),2.60(t,J＝2.3Hz,2H),2.17(s,1H),1.50–1.35(m,2H),1.30–1.21(m,30H),0.86(t,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(75MHz,Chloroform-d)δ182.73,171.82,77.23,76.61,61.16,50.87,43.92,40.56,31.92,30.01,29.75,29.67,29.52,29.36,27.08,22.68,14.10.HRMS(ESI)calculated for C30H59Cl2N7O7Pt,[M+H]+:895.35590；found:895.35242.ppm error 3.8.
实施例5
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，Ⅰ8e的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)～(7)同实施例1，区别在于，步骤(6)中采用反式二胺二氯二羟基铂(反铂)代替顺式二胺二氯二羟基铂；步骤(7)中采用十二烷基异氰酸酯代替四烷基异氰酸酯。
化合物Ⅰ8e：淡黄色固体，39mg。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ6.12(s,6H),5.68(s,1H),4.80(s,2H),4.26(t,J＝5.0Hz,2H),3.64(t,J＝4.9,4.0Hz,2H),3.12–2.95(m,5H),2.65(s,3H),2.54(s,2H),1.49–1.34(m,2H),1.24–1.18(m,18H),0.84(t,J＝6.5,5.6Hz,3H).13C NMR(75MHz,Chloroform-d)δ181.63,173.38,163.89,77.88,76.97,61.59,61.26,52.69,42.36,41.36,31.97,31.05,30.50,30.12,29.79,29.73,29.61,29.41,27.19,22.71,14.11.HRMS(ESI)calculated for C23H46Cl2N6O8Pt,[M+H]+:800.24802；found:800.24657.ppm error 1.8.
实施例6
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，Ⅱ7a的制备方法包括如下步骤：
(1)化合物Ⅱ2的合成：
将N-甲基-2-羟基乙胺(Ⅱ1，20mL)、甲醇钠的甲醇溶液(5.4mol/L)50.79mL混合加入到聚四氟容器中，加入无水乙醚200mL，将反应体系N2置换后，通入一氧化氮(NO)气体，使压力达到0.4-0.8MPa，温室密闭反应24h。后处理，放掉未反应的过量的NO气体，使压力降为常压，打开容器后，将反应液倒入1L的无水乙醚中析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗3次，至于真空干燥箱中室温进行干燥2h，收集白色产物即为化合物Ⅱ2。得到的化合物Ⅱ2不经纯化直接进行下一步反应。
(2)化合物Ⅱ3的合成：
取1g化合物Ⅱ2和5mL DMF加入到100mL两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行N2保护，然后取757.8mg溴丙炔缓缓滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下反应0.5h，然后将反应液移至室温继续反应12h。后处理，首先通过旋蒸除去DMF，柱层析得到无色油状物Ⅱ3。柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷与甲醇积比为20：1。
(3)化合物Ⅱ4的合成：
取700mg化合物Ⅱ3溶解于10mL无水四氢呋喃中，加入122mg的DMAP，室温搅拌15mins后加入608mg的丁二酸酐，反应液回流过夜。后处理，首先将反应液过滤，滤液浓缩后加入水，用二氯甲烷萃取5次，浓缩有机层得到化合物Ⅱ4。
(4)化合物Ⅱ5的合成：
取48mg化合物Ⅱ4(0.175mmol)于单颈反应瓶中，加入21.9mg NHS(0.19mmol)，39.2mg的DCC(0.19mmol)，并加入3mL的二氯甲烷溶解，反应液在室温下搅拌30mins。然后，过滤收集滤液，浓缩除去二氯甲烷，剩余物制砂，柱层析得到目标产物Ⅱ5。柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷与甲醇积比为50：1。
(5)化合物Ⅱ6的合成：
取85mg化合物Ⅱ5于单颈反应瓶中，加入76.8mg顺式二胺二氯二羟基铂，2mL的DMSO，反应液在80℃下避光搅拌5h。后处理，过滤得Ⅱ6的黄色DMSO溶液，直接用于下一步反应。
(6)化合物Ⅱ7a的合成：
往Ⅱ6(0.184mmol)的黄色DMSO溶液中滴加十二烷基异氰酸酯(0.368mmol)，常温避光搅拌5h。随后加入饱和氯化钠水溶液至反应液，用二氯甲烷萃取三次，浓缩除去二氯甲烷，柱层析得到目标产物Ⅱ7a。柱层析的固定相为硅胶，流动相为二氯甲烷与甲醇积比为50：1。
化合物Ⅱ7a：淡黄色固体，38mg。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ6.12(s,6H),5.68(s,1H),4.80(s,2H),4.26(t,J＝5.0Hz,2H),3.64(t,J＝4.9,4.0Hz,2H),3.12–2.95(m,5H),2.65(s,3H),2.54(s,2H),1.49–1.34(m,2H),1.24–1.18(m,18H),0.84(t,J＝6.5,5.6Hz,3H).13C NMR(75MHz,Chloroform-d)δ181.63,173.38,163.89,77.88,76.97,61.59,61.26,52.69,42.36,41.36,31.97,31.05,30.50,30.12,29.79,29.73,29.61,29.41,27.19,22.71,14.11.
实施例7
本发明所述的一氧化氮供体型四价铂前药，Ⅱ7b的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)～(6)同实施例5，区别在于，步骤(5)中采用反式二胺二氯二羟基铂代替顺式二胺二氯二羟基铂；步骤(7)中采用十二烷基异氰酸酯代替四烷基异氰酸酯。
化合物Ⅱ7b：淡黄色固体，38mg。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.82,6.72,6.45,4.52,4.25,3.79,3.76,3.72,3.69,3.10,3.01,2.86,2.70,2.64,1.47,1.34,1.28,1.27,1.25,1.25,1.25,1.23,1.22,1.22,0.89.
性能测试
(1)药物在大鼠血浆中的稳定性测试
化合物11(ZL202011077271.9中化合物类似物，不包含烷基长链结构)、Ⅰ8a、Ⅰ8b、Ⅰ8c、Ⅰ8d、Ⅱ7a在大鼠血浆中的稳定性，及Ⅰ8c在大鼠血浆中的半衰期测定。
使用HPLC(Innovai ODS-2柱5μm、1250×4.60mm)测定化合物在大鼠血浆中的稳定性。将化合物(0.5mM)在37℃下大鼠血浆中孵育，并在2小时时记录HPLC谱图。对于I8c，在0、12、24、48和72小时记录谱图以测定半衰期。
测试结果如图1所示，图lA是用HPLC测定化合物11(ZL202011077271.9中化合物的类似物，不包含烷基长链结构)、I8a、I8b、I8c、I8d、II7在大鼠血浆中2小时的稳定性数据，具有长烷基链的化合物显示出稳定性的显着改善。图1B-C是I8c在大鼠血浆中半衰期的测定结果图，结果显示I8c半衰期约为30小时。
(2)药物对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性测试
测定化合物I8a、I8b、I8c、I8d、II7、顺铂(DDP)在10μM浓度下对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性。
利用MTT法测定化合物I8a、I8b、I8c、I8d、II7a、顺铂(DDP)在10μM浓度下对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性。包括三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-23l，MDA-MB-468，乳腺癌细胞MCF-7，MCF7/DDP，非小细胞肺癌细胞A549，A549/DDP，卵巢癌细胞A2780，和结肠癌细胞HCT116。
测试结果如图2所示，所有化合物均对不同的肿瘤细胞显示处一定的抗肿瘤活性。其中化合物I8b、I8c、I8d、II7活性均显著优于顺铂。
根据以上的初筛结果，选择I8c进一步测定MDA-MB-231，MCF-7，A549/DDP，MCF-7/DDP，MCF-10A细胞的IC50值，同时选择顺铂(DDP)和11作为对照。
测试结果如Table1所示，在所测试细胞中，化合物I8c活性均显著优于顺铂和11，表明I8c具有更加优秀的抗肿瘤活性。
Table·1.·IC50·(μM)·of·2，·10c·and·DDP·against·MDA-MB-231，·MCF-7，·A549/DDP，·MCF-7/DDP·and·MCF-10A·cells.·a
a·Cells·were·treated·with·the·indicated·compounds·tor·72·h，·and·the·cell·viability·and·IC50·values·were·determined·by·MTT·assay.·Data·were·expressed·as·the·mean·±·SD·from·three·individual·experiments.
b·FI·values，·fold·increase，·calculated·as·IC50·(DDP)·/·IC50·(I8c).
c·ND：·not·determined.
(3)药物对对人血清白蛋白的结合情况测试
利用SPR测定I8c与化合物11对人血清白蛋白的结合常数(KD)，及I8c与人血清白蛋白结合情况的计算机对接结果。
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)和PBS-P运行缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，含有2.7mM KCl、137mM NaCl和0.05％表面活性剂P20)，温度为25℃。利用标准胺偶联程序(10mM乙酸钠(pH 5.5))，将人血清白蛋白固定到传感器CM5芯片上。所研究的化合物经过连续稀释，然后在接触阶段以30μL/min的流速经过传感器芯片上120秒，随后在解离阶段注入120秒的缓冲液。KD值使用Biacore T200评估软件1.0版(GE Healthcare)计算。
测试结果如图3A所示，Ⅰ8c与人血清白蛋白的KD值为15.35μM。与此形成鲜明对比的是，化合物11(图3B)是专利ZL202011077271.9中化合物类似物，其不包含烷基长链部分，其KD值超出检测限而无法确定，这强调了长烷基链在人血清白蛋白结合亲和力中的关键作用。
(4)Ⅰ8c、DDP在MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞中的Pt摄取情况。
用相同浓度(1μmol/L)的Ⅰ8c和顺铂与MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞孵育24h(如图4A所示)、48h(如图4B所示)，然后通过ICP-MS观察不同细胞的Pt摄取情况，测试结果如图4所示。
由图4可得，在所有细胞中化合物Ⅰ8c都远比顺铂Pt摄取更高。一部分原因是化合物Ⅰ8c的脂溶性和稳定性远高于顺铂。另一方面则可能是由于Ⅰ8c所释放的NO引起了金属转运蛋白Atox1和ATP7a的亚硝化并造成其活性降低，使得肿瘤细胞中金属转运蛋白对铂的外排减少。
(5)化合物Ⅰ8c的细胞内NO释放情况。
利用DAF-FM DA荧光探针检测化合物Ⅰ8c在不同细胞内NO释放的情况(流式)，测试结果如图5所示。
由图5可得，Ⅰ8c在肿瘤细胞MDA-MB-231、MCF-7/DDP中的NO释放大于正常乳腺上皮细胞MCF-10A，表明化合物Ⅰ8c选择性在肿瘤细胞中降解催化释放NO，并对正常细胞具有良好的生物相容性。
(6)化合物Ⅰ8c对MDA-MB-231细胞的迁移能力的影响
接下来研究化合物Ⅰ8c对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响，为了防止化合物的抗增殖活性对迁移能力产生较大的影响，首先，参照前述计算化合物对肿瘤细胞的IC50值的计算方法(MTT法)，先测试计算出了化合物的IC10值为84.477nM。
其次，通过transwell迁移实验证明了化合物Ⅰ8c能够显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力。transwell迁移实验通过计数迁移的细胞量测定细胞的迁移能力，细胞数量越多则迁移能力越强。如图6A所示，实验结果表明化合物Ⅰ8c能够显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力。
然后我们继续使用85nM的Ⅰ8c进行划痕实验，结果如图6B所示，化合物Ⅰ8c的划痕闭合程度低于对照组，表明I8c显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力。
(7)化合物I8c在体内的代谢性质
为了进一步评价化合物I8c在体内的代谢性质，测定了化合物I8c的原药和总铂的大鼠体内药代动力学(PK)性质。选择雄性SD大鼠3只，分别静脉注射给予I8c(5mg/kg)，于给药前和给药后5min、15min、30min、60min、2h、4h、6h、8h、24h，眼底静脉丛取血，离心取上层血浆于-20℃保存备用。测试结果如Table 2所示。
Tabie·2.·PK·Parameters·of·I8c·(iv·5·mg/kg).·a
a·Values·are·the·average·of·three·determinations.
由Table 2可得，I8c在体内半衰期为0.29h，Tmax为0.08h，其AUC(0-t)为2210.10ug/L*h。大鼠体内总铂半衰期为23.58h，Tmax为0.08h，其AUC(0-t)为14720.28ug/L*h。
(8)化合物I8c的急性毒性情况
进行了化合物I8c急性毒性实验，观察化合物I8c急性毒性情况，以制定安全用药范围。首先进行了预实验，预实验显示受试药物有一定毒性。药物静脉注射70mg/kg剂量可引起4/4只小鼠死亡，而在静脉注射30mg/kg剂量下引起0/4只小鼠死亡。根据预实验的实验结果，我们选择如下剂量63mg/ml，56.7mg/ml，51.03mg/ml，45.93mg/ml，41.34mg/ml进行LD50实验。将药物按上述剂量静脉注射给药1次，记录各组小鼠中毒症状及死亡情况，死亡动物进行尸检。
实验结果如下：
异常反应：小鼠静脉注射药物后，各剂量组动物出现萎靡，瘫软至死亡，且给药剂量越高，症状越显著，死亡时间越短。本实验结果显示，化合物I8c对小鼠有一定毒性，较高剂量下给药后会引起小鼠死亡。I8c静脉注射给药的LD50值为53.2507(48.3854～58.6053)mg/kg。
(9)化合物I8c的MDA-MB-23l小鼠体内移植瘤药效评价
对MDA-MB-231细胞小鼠体内移植瘤药效进行测试。在小鼠右侧第二对乳腺垫处接种MDA-MB-231细胞，待肿瘤实体建立并生长至100mm3左右，对小鼠进行随机分组。设定三个I8c治疗组，一个只给与溶媒的阴性对照组和一个DDP组。实验组接受不同剂量的I8c(5、2.5和1.25mg/kg，静脉注射，每三天一次)，DDP组为5mg/kg，静脉注射，每三天一次。
结果如图7所示。图7A是每隔一天测量和计算肿瘤体积结果；图7B是每隔一天测量小鼠体重结果；图7C是小鼠瘤重称量结果；图7D是小鼠肿瘤图片。由图可得，化合物Ⅰ8c剂量依赖性地抑制肿瘤细胞的生长，其中Ⅰ8c组(5mg/kg)的抑瘤率为71.08％，而顺铂组(5mg/kg)抑瘤率仅为58.51％，Ⅰ8c的体内药效活性显著优于顺铂。此外，Ⅰ8c的高、中、低剂量组对小鼠体重的影响程度均低于顺铂组，表明化合物Ⅰ8c相比顺铂具有更好的安全性。
(10)化合物Ⅰ8c体内抗MDA-MB-231-luc肺转移
对Ⅰ8c抗MDA-MB-231细胞小鼠体内肺转移活性进行测试。通过尾静脉给予六周龄雌性BALB/c小鼠MDA-MB-231/luc细胞(5×107个细胞)。一周后，将动物随机分为三组，每组六只小鼠。化合物Ⅰ8c治疗组每三天尾静脉注射2.5mg/kg。DDP治疗组也每三天尾静脉注射2.5mg/kg。阴性对照组仅以相同频率给予溶媒。成像时用2％吸入异氟烷麻醉小鼠并腹腔注射D-荧光素。10分钟后使用IVIS Lumina成像系统采集信号。测试结果如图8所示；其中图8A是3张具有代表性的小动物荧光成像图像；图8B是各组小鼠肺部荧光强度定量计算的统计图。
由图8可得，与对照组和DDP组相比，用Ⅰ8c治疗的小鼠在第12天表现出明显较低的荧光强度，表明Ⅰ8c治疗在体内显著抑制了MDA-MB-231的肺转移。
(11)Ⅰ8c引起肿瘤细胞内Atox1和ATP7a亚硝化水平的变化测试
将化合物Ⅰ8c与MDA-MB-231细胞孵育，随后利用Biotin-Switch法进行Atox1和ATP7a的亚硝化水平检测。
测试结果如图9所示，其中，图9A是利用Biotin-Switch法验证Ⅰ8c所释放的NO造成MDA-MB-231细胞内Atox1和ATP7a亚硝基化升高的实验结果图；图9B是其条带灰度统计图。由图可得，与DDP相比，Ⅰ8c释放的NO显著增加了Atox1和ATP7a的S亚硝化作用。这两个转运蛋白的亚硝化升高可导致金属结合活性降低并提高铂在癌细胞中的保留，从而使整合的前药Ⅰ8c具有更有效的抗肿瘤作用。

Claims (10)

1.一种一氧化氮供体型四价铂前药，其特征在于，其结构式为：
其中，R1为哌嗪基或N-甲基乙醇胺基，为顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂，R2选自C4～C18。
2.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型四价铂前药，其特征在于，所述R2选自C6～C12。
3.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型四价铂前药，其特征在于，所述R2为十二烷基。
4.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型四价铂前药，其特征在于，所述为顺式二胺二氯二羟基铂。
5.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型四价铂前药，其特征在于，所述R1为哌嗪基。
6.一种权利要求1所述的一氧化氮供体型四价铂前药的制备方法，其特征在于，当R1为哌嗪基，包括以下步骤：
(1)化合物I4与丁二酸酐发生酰胺缩合反应得到化合物I5；
(2)化合物I5与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应得到化合物I6；
(3)化合物I6与顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂发生酯交换反应得到化合物I7；
(4)化合物I7与R2-N＝C＝O发生胺基化反应得到化合物I8；
合成路线如下：
其中，R2选自C4～C18。
7.一种权利要求1所述的一氧化氮供体型四价铂前药的制备方法，其特征在于，当R1为N-甲基乙醇胺基，包括以下步骤：
(1)化合物Ⅱ3与丁二酸酐发生酰胺缩合反应得到化合物Ⅱ4；
(2)化合物Ⅱ4与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应得到化合物Ⅱ5；
(3)化合物Ⅱ5与顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂发生酯交换反应得到化合物Ⅱ6；
(4)化合物Ⅱ6与R2-N＝C＝O发生胺基化反应得到化合物Ⅱ7；
合成路线如下：
其中，R2选自C4～C18。
8.根据权利要求6或7所述的一氧化氮供体型四价铂前药的制备方法，其特征在于，所述化合物I6或Ⅱ5与顺式二胺二氯二羟基铂或反式二胺二氯二羟基铂发生酯交换反应中，所用溶剂为无水DMSO，反应条件为避光，反应温度为75～80℃。
9.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～5任一所述一氧化氮供体型四价铂前药及药学上可接受的载体。
10.权利要求1～5任意一项所述一氧化氮供体型四价铂前药或其溶剂合物在预防或治疗抗肿瘤药物中的应用。
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