CN112175014B - 一种一氧化氮供体型四价铂衍生物、制备方法及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一氧化氮供体型四价铂衍生物、制备方法及其作为一种的整体生物正交前药在抗肿瘤药物中的应用。本发明中的化合物可以选择性地在肿瘤细胞中被激活，其结构中的四价铂被还原为顺铂，同时顺铂作为一种新的生物正交型催化剂，催化NO供体片段部分释放出NO，后者与顺铂协同发挥抗肿瘤活性；而在正常细胞中化合物则不具有上述过程，从而具有较好的安全性。

Description

一种一氧化氮供体型四价铂衍生物、制备方法及其医药用途

技术领域

本发明属于药学技术领域，涉及一种包含四价铂配合物的一氧化氮(nitricoxide,NO)供体的制备方法和应用，具体涉及一种新的具有肿瘤选择性的结合四价铂配合物与NO供体偶氮鎓二醇盐片段的小分子。

背景技术

目前，恶性肿瘤的发病率和死亡率一直呈现显著的上升趋势，而化疗一度是肿瘤治疗的标准疗法。但传统的小分子药物由于缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时会误杀正常细胞，引起严重的毒副作用，因此在临床上的广泛应用受到限制。生物正交化学作为新兴发展的学科，通过键生成和键断裂的方式广泛应用于标记、追踪、操纵和激活目标分子。近年来，一些通过金属催化剂催化的生物正交键断裂反应已经成功应用于肿瘤治疗。相比较于传统的细胞毒药物或者依赖酶激活的抗肿瘤药物，依赖外源性催化剂的生物正交键断裂的前药激活策略可以更好地实现靶向肿瘤的目的，最大程度地降低副作用和不良反应。

生物正交金属催化剂

生物正交化学金属催化剂目前应用最广泛的包括金，铜和钯等。此类金属催化剂由于结构难以修饰，而且均需要和前药分开给药，这样就极大地限制了化合物的疗效，使得在体内缺乏选择性和靶向性，同时此类金属催化剂在体内容易蓄积，较难被代谢。因此要想解决以上的问题，发现新的催化剂对于生物正交化学来说至关重要。由于铂和钯位于元素周期表的同一主族，经过一系列验证后，从而发现了顺铂可以作为一种新的生物正交催化剂。但是由于顺铂具有较强的细胞毒性，不能直接给药，因此需要对顺铂进行改造。四价铂前药可以选择性地在肿瘤细胞还原介质的作用下还原为顺铂，从而发挥催化作用。同时顺铂可以与肿瘤细胞内DNA发生交联，发挥细胞毒性作用，因此我们选择了顺铂的四价前药作为催化剂的前体形式。

四价铂前药

四价铂前药是一类可能改善二价铂抗肿瘤药物药理性质的分子。相对于平面构型的二价铂配合物，四价铂配合物的中心铂离子为d⁶电子构型，多了两个轴向轨道，可以形成稳定的八面体配位构型。对四价铂配合物的轴向位置进行化学配体修饰可以进一步影响和调节四价铂配合物的物理和化学性能。对四价铂轴向位置进行不同配体修饰可以影响四价铂配合物的脂溶性、还原性、靶向性和其他生物活性。四价铂配合物被还原时发生两个电子的转移，被还原成具有抗肿瘤活性的二价铂，同时伴随着两个轴向配体的释放。

NO供体型药物

NO供体型药物一般是指由NO供体及相关药物或某种活性化合物通过各种连接基团而形成的前药。现已发现多种结构类型的NO供体，如亚硝基硫醇、硝酸酯、NO-金属复合物(硝普盐)、呋咱N-氧化物、偶氮鎓二醇盐等；其中，偶氮鎓二醇盐(diazeniumdiolates)在选择性和靶向性释放NO方面具有明显优势。一方面是偶氮鎓二醇盐在生理条件下极易不稳定，能自动释放1～2分子NO，其半衰期从几秒钟到几小时不等。另一方面，将偶氮鎓二醇盐的O²位(与氮鎓离子相连的O称之为O¹，与烯键氮原子相连的O为O²)烷基化后，可转化成在生理条件下稳定的前药；通过体内某些特定酶识别或特殊生理环境作用下，去除O²保护基团，转化为不稳定的偶氮鎓二醇盐阴离子，从而达到选择性和靶向性释放NO。迄今为止，已发展出多种O²保护新策略。

NO与癌症

NO是生物体内一种水溶性的、携带自由基的气体，具有氧化还原特性，在生理、病理方面扮演重要角色。研究表明NO是一种潜在抗肿瘤剂，可以调节肿瘤相关过程，包括血管生成、凋亡、侵袭与转移、细胞周期等。NO对肿瘤细胞的直接作用机制尚不清楚，目前报道的主要有3个方面：(1)NO与胞内超氧阴离子作用形成过氧亚硝酸根，质子化分解为NO₂和羟基自由基，羟基自由基可与肿瘤细胞的多种分子结合，从而引起肿瘤细胞损伤，如脂质过氧化、蛋白质、氨基酸交联反应；(2)NO极易与含有Fe-S中心的蛋白质Fe形成Fe-NO，从而引起线粒体呼吸链上Fe-S辅基和顺乌头酸酶的降解，因而阻止细胞内能量的合成、诱导细胞凋亡；(3)NO可以直接作用于核糖核酸还原酶，影响肿瘤细胞DNA的复制，同时还可以使DNA发生硝基化，抑制肿瘤细胞增殖。NO抗肿瘤的另一主要机制是NO介导的巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤性，具体机理是：T细胞识别抗原→T细胞分泌细胞因子→细胞因子刺激产生NO→NO杀伤肿瘤细胞。另外，有研究证明NK细胞毒性也是NO依赖性的。因此，设计和研究NO前体药物成为抗肿瘤药物创新的重要策略之一。美国国立癌症研究所(NCI)、一些世界知名医药企业如Merk、Pfizer、NicOx、NitroMed等均投资支持NO供体型药物开发。近年来，NO供体型药物的研发也取得了很大进展，NCI已将抗肿瘤药物JS-K列入快速研发计划。

发明内容

发明目的

本发明提供一种具有抗肿瘤疗效的包含四价铂配合物和偶氮鎓二醇盐片段的有机化合物。该化合物可以选择性地在肿瘤细胞中释放NO和顺铂，从而发挥协同抗肿瘤的效果。

技术方案

一种包含四价铂配合物和偶氮鎓二醇盐片段的有机化合物，该化合物是以四价铂配合物和一氧化氮供体分子为基础，通过化学偶联方法，将一氧化氮供体分子和四价铂配合物连接起来，作为一个整体分子；所述的一氧化氮供体分子为脯氨酸偶氮鎓二醇盐、哌嗪偶氮鎓二醇盐；四价铂配合物为顺式二胺三氯羟基铂或反式二胺三氯羟基铂。

第一方面，通过一种化合物，为通式A所示的化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐：

其中：R₁选自烯丙基、炔丙基；R₂选自顺式二胺三氯羟基铂、反式二胺三氯羟基铂；Linker

通式A所示的化合物选自：

在一些实施例中，化合物的结构式如式所示：

其中，R₁选自炔丙基、烯丙基。

进一步的，所述的以脯氨酸偶氮鎓二醇盐为骨架的化合物选自：

所述的以脯氨酸偶氮鎓二醇盐为骨架的化合物，合成路线如下：

其中，NOgas：一氧化氮气体，anhydrousether：无水乙醚；CH₃ONa：甲醇钠；CH₃OH：甲醇；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；THF：四氢呋喃；CHP：顺式二胺三氯羟基铂；Et₃N：三乙胺；TBTU：2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯；R₁选自炔丙基、烯丙基。

在另一些实施例中，化合物的结构式如式所示：

其中，R₂选自顺式二胺三氯羟基铂、反式二胺三氯羟基铂。

进一步的，所述的以哌嗪偶氮鎓二醇盐为骨架的化合物选自：

所述的以哌嗪偶氮鎓二醇盐为骨架的化合物，合成路线如下：

NOgas：一氧化氮气体，anhydrousether：无水乙醚；CH₃ONa：甲醇钠；CH₃OH：甲醇；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；CF₃COOHTHF：三氟乙酸；四氢呋喃；CHP：顺式二胺三氯羟基铂；FHP：反式二胺三氯羟基铂；Et₃N：三乙胺；TBTU：2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯。

第三方面，本发明还提供一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物及药学上可接受的载体。

第四方面，所述的化合物或其溶剂合物在制备预防和/或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。

有益效果：本发明将NO供体偶氮鎓二醇盐与四价铂配合物这两个片段整合在一起，设计出了整合型生物正交化学催化的NO供体药物。该类化合物在肿瘤细胞特有的还原环境下，四价铂片段被还原成顺铂，同时释放O²保护的偶氮鎓二醇盐片段。顺铂一方面发挥抗肿瘤作用，另一方面顺铂作为一种生物正交催化剂催化偶氮鎓二醇盐O²保护基的断裂，进一步释放NO，从而发挥协同抗肿瘤的疗效。这类整合型前药分子具有较高的肿瘤特异性，使得顺铂和NO在肿瘤细胞内特异性释放，避免了其单独使用时的低靶向性所造成的对正常细胞的毒副作用，解决了传统生物正交反应催化剂缺乏选择性的问题。同时，整体分子的设计理念也改善了传统的生物正交化学的催化剂与前药分开给药的方式，进一步提高了此类整体生物正交型前药的成药性。

本发明首次合成了新化合物I_5a，I_5b，II_6a和II_6b，通过细胞实验验证了这些化合物具有选择性在肿瘤细胞内被激活，从而发挥抗肿瘤的疗效。相比较正常细胞，化合物会优先进入到肿瘤细胞中，然后四价铂被还原为顺铂，同时顺铂催化化合物释放NO，从而与顺铂协同发挥抗肿瘤活性。与目前存在的生物正交前药相比较，这些化合物作为整体前药分子，避免分开给药，增强了化合物的靶向性，也减少了催化剂的毒性，极大地提高了此类整合型生物正交化学催化的NO供体分子的成药性。

附图说明

图1是考察各化合物在A2780和IOSE80细胞中释放NO水平的情况。

图2是不同浓度的化合物I_5a在A2780和IOSE80细胞中释放NO的情况。

图3是在不同孵化时间条件下化合物I_5a在A2780和IOSE80细胞中释放NO的情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：

化合物I₂的合成：将脯氨醇(I₁，10g)、甲醇钠的甲醇溶液(5.4mol/L)17.8g混合加入到聚四氟容器中，加入无水乙醚200mL,将反应体系N₂置换后，通入一氧化氮(NO)气体，使压力达到0.4-0.8MPa，温室密闭反应24h。后处理，放掉未反应的过量的NO气体，是压力将为常压，打开容器后，将反应液倒入1L的无水乙醚中析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗3次，至于真空干燥箱中室温进行干燥2h，收集白色产物即为化合物I₂。得到的化合物I₂不经纯化直接进行下一步反应。

化合物I_3a和I_3b的合成：取1g化合物I₂和5mL DMF加入到100mL两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行N₂保护，然后取705.5mg溴丙炔或者溴丙烯缓缓滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下保温0.5h，后将反应液移至室温继续反应12h。后处理，首先通过旋蒸除去DMF,剩余物制砂，柱层析得到化合物I₃。

化合物I_4a和I_4b的合成：取800mg化合物I₃置于反应瓶中，加10mL丙酮室温搅拌下溶解，并在冰浴条件下滴加Jones试剂约1.5mL。加毕，室温下继续搅拌，TLC检测反应进行。反应结束，过滤掉生成的绿色沉淀物，旋干溶剂，用乙酸乙酯(3×50mL)稀释萃取，并依次用蒸馏水，饱和食盐水洗涤。分离有机相，用无水硫酸纳干燥，旋干乙酸乙醋得粗品，柱层析纯化得化合物I₄。

化合物I_5a和I_5b的合成：取213mg化合物I₄于单颈反应瓶中，加入86.6mg三乙胺，265mg的TBTU，并加入5mL的DMF溶解，反应液在室温下搅拌30mins。然后，向反应瓶中加入200mg CHP，反应液在避光条件下继续反应过夜。后处理，先浓缩出去DMF，剩余物制砂，柱层析得到目标产物I₅。

化合物I_5a,I_5b的制备

实施例1化合物的合成路线：

取213mg化合物I₄于单颈反应瓶中，加入86.6mg三乙胺，265mg的TBTU，并加入5mL的DMF溶解，反应液在室温下搅拌30mins。然后，向反应瓶中加入200mg CHP，反应液在避光条件下继续反应过夜。后处理，先浓缩出去DMF，剩余物制砂，柱层析得到目标产物I_5a或者I_5b。

化合物I_5a：淡黄色固体，126mg，收率23％。¹H NMR(ppm,300MHz,DMSO-d₆)δ6.15(m,6H),4.77(s,2H),4.51(s,1H),3.60(t,J＝20.1Hz,3H),2.10(s,2H),1.94(s,2H).ESI-MSm/z:545.1[M-H]⁺；

化合物I_5b：淡黄色固体，78mg，收率14％。¹H NMR(ppm,300MHz,DMSO-d₆)δ6.17(br,6H),6.04-5.91(m,1H),5.37-5.24(m,2H),4.57(q,J＝6.6Hz,2H),4.46(q,J＝4.5Hz,1H),3.68-3.61(m,1H),3.50(q,J＝6.3Hz,1H),2.18-2.04(m,2H),1.99-1.89(m,2H).

实施例2：

化合物II₂的合成：将Boc-哌嗪(II₁，20mL)、甲醇钠的甲醇溶液(5.4mol/L)50.79mL混合加入到聚四氟容器中，加入无水乙醚200mL,将反应体系N₂置换后，通入一氧化氮(NO)气体，使压力达到0.4-0.8MPa，温室密闭反应24h。后处理，放掉未反应的过量的NO气体，使压力降为常压，打开容器后，将反应液倒入1L的无水乙醚中析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗3次，至于真空干燥箱中室温进行干燥2h，收集白色产物，即为化合物II₂。得到的化合物II₂不经纯化直接进行下一步反应。

化合物II₃的合成：取1g化合物II₂和5mL DMF加入到100mL两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行N₂保护，然后取1.76g溴丙炔缓缓滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下反应0.5h，然后将反应液移至室温继续反应12h。后处理，首先通过旋蒸除去DMF,剩余物制砂，柱层析得到无色油状物II₃。

化合物II₄的合成：取化合物II₃溶解于适量的二氯甲烷中，然后慢慢滴加适量的三氟乙酸，反应在室温下继续反应12h。后处理，首先通过旋蒸出去溶剂，剩余物制砂，柱层析得到化合物II₄。

化合物II₅的合成：取700mg化合物II₄溶解于10mL无水四氢呋喃中，加入122mg的DMAP,室温搅拌15mins后加入608mg的丁二酸酐，反应液回流过夜。后处理，首先将反应液过滤，滤液浓缩后加入水，用二氯甲烷萃取5次，干燥，浓缩得到化合物II₅。

化合物II_6a和II_6b的合成：取284mg化合物II₅于单颈反应瓶中，加入101mg三乙胺，321mg的TBTU，并加入5mL的DMF溶解，反应液在室温下搅拌30mins。然后，向反应瓶中加入292mg CHP或者FHP，反应液在避光条件下继续反应过夜。后处理，先浓缩除去DMF，剩余物制砂，柱层析得到目标产物II₆。

化合物II_6b,II_6b的合成。

实施例2化合物的合成路线：

取284mg化合物II₅于单颈反应瓶中，加入101mg三乙胺，321mg的TBTU，并加入5mL的DMF溶解，反应液在室温下搅拌30mins。然后，向反应瓶中加入292mg CHP或者FHP，反应液在避光条件下继续反应过夜。后处理，先浓缩除去DMF，剩余物制砂，柱层析得到目标产物II_6a或者II_6b。

化合物II_6a：淡黄色固体，263mg，收率43％。¹H NMR(ppm,300MHz,DMSO-d₆)δ6.14-5.65(m,6H),4.86(s,2H),3.64(d,J＝9.6Hz,5H),3.38(s,4H),2.58-2.52(m,4H).ESI-MSm/z:616.1[M-H]⁺.

化合物II_6b:淡黄色固体，146mg，收率24％。¹H NMR(ppm,300MHz,DMSO-d₆)δ6.00(br,6H),4.85(s,2H),3.62(s,5H),3.39(d,J＝7.2Hz,4H),2.60-2.52(m,4H).ESI-MS m/z:616.1[M-H]⁺.

实施例3：化合物I_5a对人卵巢肿瘤细胞A2780和人卵巢正常细胞IOSE80的增殖抑制活性研究

将对数生长期细胞以1×10⁵cells/孔接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂条件下培养，直至细胞90％融合后，用无血清的DMEM培养基孵育2h使细胞同步化。随后，弃去上清，分别加入含有不同浓度的CDDP,CHP,I_4a,I_5a的DMEM孵育72h，孵育结束前4h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)。孵育结束后，弃去各孔上清液，每孔加入150μL DMSO，细胞振荡仪上振荡10min，待结晶物充分溶解后用酶标仪测定OD₅₇₀。.结果以mean±SD表示，之后根据抑制率通过GraphPad Prism 6拟合得出IC₅₀。

实施例4：研究化合物在A2780和IOSE80细胞中释放NO的情况。

A2780细胞和IOSE80细胞经各给药组处理，用不含EDTA的胰酶消化后，1500rpm，4℃离心5min收集细胞。每个样中加入1.5mL浓度为5μM的DAF-FMDA工作液，于37℃避光孵育20min。孵育完毕后，1500rpm离心10min，小心弃染色反应液，每孔加入200μL PBS清洗2次，每次离心5min，后再用200μL PBS重悬细胞。半个小时内用BD小型流式细胞仪FL1通道检测10000个细胞中细胞的荧光信号值，得出峰移曲线(细胞内NO多时，荧光信号强，峰右移)，进而测定细胞内NO水平。

表1展示的是化合物对人卵巢癌细胞A2780和人卵巢正常细胞IOSE80的增殖抑制活性研究。

表1

从表1可以看出，单独的NO供体片段化合物I_4a，I_4b和II₅对肿瘤细胞A2780和正常细胞IOSE80的IC₅₀均较大，说明没有催化剂存在的条件下O²保护基是较为稳定的。各目标化合物包括I_5a，I_5b，II_6a和II_6b对A2780表现出比CDDP和CHP更强的增殖抑制活性，比如I_5a,IC₅₀＝0.44±0.02μM；CDDP,IC₅₀＝1.08±0.06μM；CHP,IC₅₀＝1.69±0.09μM)。更为重要的是各目标化合物包括I_5a，I_5b，II_6a和II_6b对正常细胞IOSE80的IC50均再100μM，表现出较高的选择性。这些数据表明，该类化合物在正常细胞中较为稳定，而肿瘤细胞特有的还原环境下，四价铂片段被还原成顺铂，同时释放O²保护的偶氮鎓二醇盐片段。顺铂一方面发挥抗肿瘤作用，另一方面顺铂作为一种生物正交催化剂催化偶氮鎓二醇盐O²保护基的断裂，进一步释放NO，从而发挥协同抗肿瘤的疗效。

图1是考察各化合物在A2780和IOSE80细胞中释放NO水平的情况。从图1中可以看出,I_5a和I_4a+CHP联合给药能够促进A2780细胞中NO的产生，表明顺铂催化O-丙炔基断裂可选择性在肿瘤细胞中进行，且I_5a和I_4a+CHP联合给药与阳性对照JS-K相比，存在显著差异(P<0.001)，而对人正常卵巢癌细胞IOSE80中NO的产生没有明显差异。实验表明化合物I_5a和I_4a+CHP联合给药促进A2780细胞中NO产生效果强，而对人正常卵巢癌细胞IOSE80几乎没有作用，说明化合物I_5a和I_4a+CHP的靶向性良好，并且效果优于阳性药物JS-K。

图2是不同浓度的化合物I_5a在A2780和IOSE80细胞中释放NO的情况。从图2可以看出，在化合物I_5a中，不同剂量组对A2780细胞NO的释放具有不同程度的刺激作用，呈剂量依赖关系，其中高剂量组作用最显著，与对照组相比呈显著差异(P<0.001)。而不同浓度I_5a对人正常卵巢癌细胞IOSE80作用不呈剂量依赖关系。

图3是在不同孵化时间条件下化合物I_5a在A2780和IOSE80细胞中释放NO的情况。图3可知，I_5a在16h、24h、48h和72h对A2780细胞NO的释放具有刺激作用，呈时间依赖关系，从16h开始，呈显著差异。其中72h作用达到顶峰。而不同时间对正常卵巢癌细胞IOSE80作用不呈时间依赖关系。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种化合物，其特征在于，为通式A所示的化合物，或其药学上可接受的盐：

其中：R₁选自烯丙基、炔丙基；R₂选自顺式二胺三氯羟基铂、反式二胺三氯羟基铂；Linker代表

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，通式A所示的化合物选自：

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R₁代表烯丙基、炔丙基，R₂代表顺式二胺三氯羟基铂、反式二胺三氯羟基铂。

4.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，通式A所示的化合物选自：

5.权利要求2或3所述化合物的制备方法，其特征在于，通式I所示的化合物的合成路线如下：

CH₃ONa：甲醇钠；CH₃OH：甲醇；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；THF：四氢呋喃；CHP：顺式二胺三氯羟基铂；Et₃N：三乙胺；TBTU：2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯。

6.根据权利要求2或3所述化合物的制备方法，其特征在于，通式II所示的化合物的合成路线如下：

CH₃ONa：甲醇钠；CH₃OH：甲醇；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；THF：四氢呋喃；CHP：顺式二胺三氯羟基铂；FHP：反式二胺三氯羟基铂；Et₃N：三乙胺；TBTU：2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯。

7.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1-4任一项所述的化合物及药学上可接受的载体。

8.权利要求1-4任一项所述的化合物在制备预防和/或治疗肿瘤疾病药物中的应用。

9.权利要求7所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。

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