CN117736890A

CN117736890A - 酵母菌和菌剂和葡萄酒及其制备方法

Info

Publication number: CN117736890A
Application number: CN202311774981.0A
Authority: CN
Inventors: 庞晓娜; 李德美; 张红星; 焦梦丽; 杨萌萌; 吴兆其; 谢远红
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2023-12-21
Filing date: 2023-12-21
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了酵母菌和菌剂和葡萄酒及其制备方法。所述酵母菌为保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或者，所述酵母菌为保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。本发明提供的酵母菌应用于葡萄酒发酵可有效改善葡萄酒的风味及品质稳定性。

Description

酵母菌和菌剂和葡萄酒及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种酵母菌和一种菌剂和一种葡萄酒及其制备方法，以及酵母菌或菌剂在改善葡萄酒的风味和/或品质稳定性中的应用。

背景技术

原产于法国的酿酒葡萄品种赤霞珠，以其粒小，穗散，皮厚，晚熟，糖、酸及酚类物质含量丰富、强适应性等特点成为全世界欢迎的酿酒品种。位于北京西南方向的房山区，具有与著名的法国波尔多产区相同的纬度，北纬39度的酿酒葡萄种植黄金线为葡萄浆果果皮色素的形成和酯的积累提供了良好的条件。色泽鲜艳，香气充全，果味浓郁，含糖量高，含酸适中，品质优良的葡萄浆果保证了房山区龙徽、丰收、波龙堡、莱恩堡等葡萄酒厂的原料供应；数千亩葡萄种植基地，先进的现代化酿酒设备，严格的酿造标准保证了葡萄酒优异的品质；葡萄园土壤、葡萄表皮以及葡萄酒酿造环境中蕴藏的大量微生物保证了葡萄酒独特的风格特征。

在葡萄酒发酵过程中添加酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可以抑制其他有害微生物的生长的同时，可以更大程度上将糖转化为酒精，还会产生对葡萄酒香气有积极影响的酯类和高级醇等副产物。崔艳等(2011)使用筛选得到的酿酒酵母C508和G611，酿造的低醇葡萄酒具有独特的香气特征。段晨凯(2012)筛选获得一株发酵性能优良的酵母菌株J12，利用J12酿制的葡萄酒具有酒香浓郁，酒体协调，口感醇厚的特点。

除酿酒酵母外，非酿酒酵母(non-Saccharomyces)的参与也会影响葡萄酒的最终品质，各种香气在发酵过程中通过协同、抑制、积累等相互作用，从而构成葡萄酒独特的香气。葡萄酒发酵过程中，在自然发酵的初始阶段，毕赤酵母、汉森酵母等会占主导地位，随着发酵的继续和乙醇浓度的升高，它们通常被更强的发酵物种所取代，最后，酿酒酵母主导发酵过程，直到酒精发酵结束。因此，酵母菌种的品质直接影响到葡萄酒的风味和口感，决定葡萄酒质量的差异及典型性。

微生物在葡萄酒发酵过程中的演替与挥发性风味动态之间具有的潜在相关性(Qiu Xiangyu，2021)促使微生物在葡萄酒发酵过程中产生大量乙醇和二氧化碳的同时，还会产生少量如甘油、有机酸、酚类、挥发性物质等副产物，这些物质构成了葡萄酒独特的感官特征。研究发现，酵母、汉逊酵母、梅奇酵母、毕赤酵母和伊萨酵母等均能够促进酯类和高级醇类物质的产生，有效增加葡萄酒的复杂性和特异性(Benito，2019；IgnacioBelda，2017)。葡萄酒中酸度较高的酒石酸，具涩味的苹果酸，较清新的柠檬酸，酯香味的乳酸，咸苦味的琥珀酸等赋予葡萄酒不同的酸性特征，口感的层次性也更加丰富。

目前国内外对葡萄园环境和葡萄酒发酵过程中的微生物多样性的研究逐步展开，认识到葡萄酒生产过程中微生物对葡萄酒品质有一定的影响。但选用发酵葡萄酒的本土酵母大部分仍处于研究阶段，适用于葡萄酒生产的少之又少，且对于北京地区的葡萄园本土微生物以及葡萄酒风味相关的研究还相对欠缺。

因此，为满足人们对独具本土风格的高品质葡萄酒工业化生产的需求，提供本土具有优良发酵特性的酵母菌株以充分发挥本土优势菌株对葡萄酒风味的贡献，对酿造本土产区风格特征明显的葡萄酒具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的适用于发酵葡萄酒的本土酵母欠缺的问题，提供一种酵母菌和一种菌剂和一种葡萄酒及其制备方法，以及酵母菌或菌剂在改善葡萄酒的风味和/或品质稳定性中的应用。将该酵母菌应用于本土葡萄的发酵，可有效改善葡萄酒的风味及品质稳定性，能够满足人们对独具本土风格的高品质葡萄酒工业化生产的需求。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种酵母菌，其中，所述酵母菌为保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或者，所述酵母菌为保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。

本发明第二方面提供一种菌剂，其中，所述菌剂含有保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母和/或保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母。

本发明第三方面提供一种葡萄酒的制备方法，其中，所述制备方法包括：将本发明提供的菌剂接种至葡萄汁中进行发酵。

本发明第四方面提供一种本发明提供的制备方法制得的葡萄酒。

本发明第五方面提供一种本发明提供的酵母菌或本发明提供的菌剂在改善葡萄酒的风味和/或品质稳定性中的应用。

通过上述技术方案，本发明的有益效果至少包括：

本发明从北京地区葡萄园土壤、酿酒葡萄与葡萄酒发酵过程中分离筛选得到两种菌株，经鉴定为酿酒酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母，通过发酵性能与耐受性测试，发现酿酒酵母对36℃的高温具有强耐受性，可在200mg/L-400mg/L的SO₂浓度的环境中正常发酵，pH值1.7到3.3的范围内正常生长繁殖，可在10-40wt％葡萄糖含量的环境中正常分解代谢；葡萄汁有孢汉逊酵母的最适生长温度范围为22-33℃，对pH值的耐受达1.7，350mg/L的SO₂浓度、10-40wt％葡萄糖含量不影响该菌株的发酵性能。

本发明获得的上述菌株用于葡萄酒混菌发酵，所得葡萄酒发酵终点结果较商业菌种发酵，其固形物含量低至6.50°Brix，具有3.4的适宜pH值，酒精度高达12.35％vol，除琥珀酸外的酒石酸、苹果酸、乳酸含量均低于商业酵母发酵终点的结果；香气活性值(OAV)大于1的挥发性风味物质中，2-甲基-1-丁醇具有3.7498的OAV值，显著优于商业酵母1.8985的OAV值，乙酸异戊酯的OAV值达10.4136，显著优于商业酵母的4.6027，辛酸乙酯的OAV值为5.4946，显著优于商业酵母的4.0629，且显著增强了丁酸乙酯的OAV值，为1.0726。醇类的总含量高达15.72mg/L，酯类的总含量高达3.1mg/L。在口感、香气、清澈度和色泽上，本发明获得的上述菌株进行葡萄酒混菌发酵得到优秀的产品感官评价结果，可赋予本土葡萄酒特有的产区风格特征。

生物保藏

本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2023年04月18日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27154。

本发明的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)，于2023年04月18日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27155。

附图说明

图1是本发明实施例1中的分离纯化得到的酵母株菌的发酵效力结果示意图；

图2是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中可溶性固形物含量的变化图；

图3是本发明实施例2中的不同菌种添加方式的葡萄酒随着发酵的进行pH值变化图；

图4是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中的总酸含量(g/L)结果图；

图5是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒的酒精度(％vol)结果图；

图6a是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中酒石酸的含量结果图；

图6b是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中苹果酸的含量结果图；

图6c是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中乳酸的含量结果图；

图6d是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中琥珀酸的含量结果图；

图7是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中不同发酵时期挥发性风味物质聚类热图；

图8是本发明实施例2中的不同菌种添加方式发酵的葡萄酒的感官评价分析图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供一种酵母菌，其中，所述酵母菌为保藏号为CGMCCNO.27154的酿酒酵母；或者，所述酵母菌为保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母。

本发明中，保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母和保藏号为CGMCCNO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母均是由北京市房山区莱恩堡葡萄酒庄园的土壤、酿酒葡萄与葡萄酒发酵过程中分离筛选得到的。

保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母和保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母在YPD固体培养基上菌落呈乳白色、不透明，表面为球形凸起，且表面光滑。

通过发酵性能与耐受性测试，发现保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母对36℃的高温具有强耐受性，可在200mg/L-400mg/L的SO₂浓度的环境中正常发酵，pH值1.7-3.3的范围内正常生长繁殖，可在10-40wt％葡萄糖含量的环境中正常分解代谢；保藏号为CGMCCNO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母的最适生长温度范围为22-33℃，对pH值的耐受达1.7，350mg/L的SO₂浓度、10-40wt％葡萄糖含量不影响该菌株的发酵性能。

本发明第二方面提供一种菌剂，其中，所述菌剂含有保藏号为CGMCCNO.27154的酿酒酵母和/或保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母。

为了进一步改善葡萄酒的风味及品质稳定性，优选地，所述菌剂含有保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母和保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母；所述菌剂中，保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母和保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母的活菌数之比为(0.5-5)：1。

本发明中，葡萄汁可以以酿酒葡萄为原料，采用本领域常规的处理方法获得。在优选情况下，可以先将酿酒葡萄进行破碎除梗，然后将破碎除梗后的酿酒葡萄与焦亚硫酸钾、果胶酶进行混合。得到的葡萄汁分装后用于发酵制备葡萄酒。其中焦亚硫酸钾的作用是抑菌和抗氧化；果胶酶的作用是使葡萄汁澄清。酿酒葡萄可以为赤霞珠。

根据本发明，优选地，以破碎除梗后的酿酒葡萄的总体积为1L计，焦亚硫酸钾和果胶酶的用量分别为60-80mg和15-30mg。

在本发明的优选实施方式中，在破碎除梗后的酿酒葡萄中先添加焦亚硫酸钾，再添加果胶酶。

本发明对焦亚硫酸钾和果胶酶的添加方式没有特别限制，根据本发明的一种优选实施方式，先将焦亚硫酸钾以焦亚硫酸钾固体的形式加入破碎除梗后的酿酒葡萄中，然后将果胶酶以果胶酶水溶液的形式加入破碎除梗后的酿酒葡萄中，果胶酶水溶液中果胶酶和水的重量比为1：(4-6)。本发明中，果胶酶的用量不包括水的用量。

根据本发明，优选地，所述菌剂的接种量使得葡萄汁中的总活菌数为10⁵-10⁷CFU/mL。

根据本发明，优选地，所述发酵的条件包括：温度为20-25℃，时间为300-400h。

本发明中，所述菌剂的形态可以是本领域常规的菌剂形态，比如可以为固体、液体或半固体形态。

本发明中，所述菌剂中的活菌体数量可以在较宽的范围内选择，只要满足相关标准的要求即可。以液体菌剂为例，所述菌剂中活菌体的含量在10⁷CFU/mL及以上。

根据本发明，优选地，葡萄酒的制备方法还包括：将所述发酵得到的发酵液进行皮渣分离。

以下将通过实施例和对比例对本发明进行详细描述。以下实施例中，如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本实施例用于说明酵母菌的筛选与鉴定的方法和结果。

YPD固体培养基：葡萄糖20g，蛋白质20g，酵母粉10g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 5.8；121℃灭菌20min；

YPD液体培养基：葡萄糖20g，蛋白质20g，酵母粉10g，蒸馏水1L，pH5.8；121℃灭菌20min。

1、筛选与鉴定的方法

(1)酵母菌株分离纯化的方法

分别取北京市房山区莱恩堡葡萄酒庄园中的土壤、酿酒葡萄以及发酵过程中的酒样，分别进行系列梯度稀释，分别取10^-3-10^-5梯度的稀释溶液在YPD固体培养基上涂布，在28℃下培养48h。挑取培养后的单菌落，在YPD固体培养基上分离划线，在28℃培养48h，取单菌落分离划线培养3代，得到乳白色、不透明，表面为球形凸起、光滑的酵母菌株，用美兰染色后在显微镜下进行镜检，再将分离得到的单菌落挑至YPD液体培养基中培养12h，将纯化后的酵母菌液甘油保存在-80℃冰箱中以备后续筛选。

(2)初筛与鉴定的方法

将分离得到的菌株接种于含杜氏小管的YPD液体培养基中，确保管内无气体，于28℃恒温箱静置培养24h，观察杜氏小管内气体充盈程度，判断各菌株的发酵速率及产气能力，筛选出产气速度快且产气量充足的菌株。

使用购自天根生化科技有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒，从筛选出的酵母菌中提取DNA进行PCR扩增，25μL的PCR反应体系包含：2.5μL的10×PCR buffer，1.5μL的MgCl₂(25mM)，2μL的dNTPs(10mM)，1μL的稀释后的基因组DNA(10ng/μL)，1μL的上游引物(10μm)，1μL的下游引物(10μm)，0.25μL的Ex Taq DNA聚合酶，无菌的重蒸水补齐至25μL。上游引物：NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)；下游引物：NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸1min(进行30个循环)；72℃延伸7min；4℃forever。

将PCR产物送到华大基因公司进行纯化并测序，将测序的结果在NCBI中进行BLAST比对，得到菌株鉴定结果。

(3)复筛的方法

将上述筛选且鉴定得到的菌株进行酒精、SO₂、pH、温度及葡萄糖耐受性测试。

酒精耐受性的测定方法：分别按10％、12％、14％、16％、18％体积分数的乙醇加入有10mL的YPD液体培养基中，放入杜氏小管，以2％(体积比例)的酵母菌株接种量接到试管中，于28℃恒温培养箱培养72h，观察杜氏小管内的产气情况及酵母菌的生长情况。

SO₂耐受性的测定方法：分别按200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L的质量浓度将SO₂加入有10mL的YPD液体培养基中，放入杜氏小管，以2％(体积比例)的酵母菌株接种量接到试管中，于28℃恒温培养箱培养72h，观察杜氏小管内的产气情况及酵母菌的生长情况。

pH值耐受性的测定方法：分别用10mol/L的盐酸溶液将有10mL的YPD液体培养基pH值调节为1.7、2.3、2.8、3.3，放入杜氏小管，以2％(体积比例)的酵母菌株接种量接到试管中，于28℃恒温培养箱培养72h，观察杜氏小管内的产气情况及酵母菌的生长情况。

温度耐受性的测定方法：在有10mL的YPD液体培养基中放杜氏小管，将活化后的酵母菌以2％(体积比例)的菌株接种量接到不同的试管中，分别在10℃、14℃、18℃、22℃、30℃、33℃、36℃进行培养72h，观察杜氏小管内的产气情况及酵母菌的生长情况。

葡萄糖耐受性的测定方法：按10％、20％、30％、40％的质量浓度将葡萄糖加入有10mL的YPD液体培养基中，放入杜氏小管，以2％(体积比例)的酵母菌株接种量接到试管中，于28℃恒温培养箱培养72h，观察杜氏小管内的产气情况及酵母菌的生长情况。

2、筛选与鉴定的结果

(1)酵母菌株分离纯化结果

从北京市房山区莱恩堡葡萄酒庄园土壤样品、葡萄果实和发酵酒样中共分离得到23株菌，这23株菌包含有酿酒酵母和非酿酒酵母。

(2)初筛与鉴定结果

图1是分离纯化得到的23株酵母菌的发酵效力结果示意图，根据图1中各菌株的发酵效力的结果，初选出发酵效力较好的酿酒酵母菌株和非酿酒酵母菌株共5株，菌株编号分别为TF6、LP2、LP7、FQ19、CKJ20。这5株菌的鉴定结果如表1所示。

表1

菌株编号	菌株名称(中文)	菌株名称(拉丁名)
			TF6	异常威克汉姆酵母	Wickerhamomyces anomalus
LP2	葡萄汁有孢汉逊酵母	Hanseniaspora uvarum
			LP7	美极梅奇酵母	Metschnikowia pulcherrima
FQ19	酿酒酵母	Saccharomyces cerevisiae
			CKJ20	酿酒酵母	Saccharomyces cerevisiae

(3)复筛结果

对5株菌进行酒精耐受性、SO₂耐受性、pH耐受性、温度耐受性以及葡萄糖耐受性筛选，结果如表2所示。

表2

表2(续)

注：“-”表示杜氏小管内无气体产生；“+”表示杜氏小管内产生1/3气体；“++”表示杜氏小管内产生2/3气体；“+++”表示杜氏小管内气体全部充满。

由表2可知，酒精耐受性的结果：非酿酒酵母中，TF6和LP7的最大酒精浓度耐受量为12％vol，LP2的最大酒精浓度耐受量为14％vol。酿酒酵母中，FQ19的最大酒精浓度耐受量为16％vol，CKJ20在酒精浓度为18％vol时仍可产气。

SO₂耐受性的结果：所有菌株均可以在200mg/L-400mg/L的SO₂浓度的培养基中发酵。非酿酒酵母中LP7在300mg/L时产气量充足，TF6和LP2在350mg/L时产气量充足；酿酒酵母FQ19和CKJ20耐受SO₂能力均较强，在400mg/L时产气量充足。

pH耐受性的结果：非酿酒酵母中，菌株TF6和LP7可耐受2.3的pH值，LP2在pH值1.7-3.3时均可生长。酿酒酵母FQ19和CKJ20在pH值1.7-3.3时均可生长。

温度耐受性的结果：非酿酒酵母中，LP2耐低、高温能力较强，在10℃-36℃可以发酵产气，TF6的温度耐受范围为18℃-33℃，LP7的最低耐受温度为14℃。酿酒酵母FQ19和CKJ20耐低、高温能力较强，在10℃-36℃均可以发酵产气。

葡萄糖耐受性的结果：各菌株均能耐受10-40wt％的葡萄糖含量。非酿酒酵母中，LP2在40wt％的葡萄糖含量中产气量充足。酿酒酵母FQ19和CKJ20在40wt％的葡萄糖含量中产气量充足。

综合各项发酵性能，筛选出的一株优良非酿酒酵母为LP2(CGMCCNO.27155)，一株优良酿酒酵母为FQ19(CGMCC NO.27154)。这两株菌较筛选出的其它菌有显著较好的发酵性能，对酒精、SO₂、pH、温度及高糖耐受性优于其他菌株。对菌株LP2和菌株FQ19进行命名，LP2命名为葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2，FQ19命名为酿酒酵母Sc-19。

实施例2

本实施例用于说明添加不同菌种制备葡萄酒的方法，以及对葡萄酒的评价方法和评价结果。

1、制备葡萄酒的方法

先将酿酒葡萄(赤霞珠，总含糖量220g/L)进行破碎除梗，然后在破碎除梗后的酿酒葡萄中先加入焦亚硫酸钾，然后再加入果胶酶水溶液(果胶酶水溶液中果胶酶和水的重量比为1：5)，以破碎除梗后的酿酒葡萄的总体积为1L计，焦亚硫酸钾和果胶酶的用量分别为60mg/L和20mg/L(用量中不包括水)。得到葡萄汁。将得到的葡萄汁进行分装。

菌株活化：将保藏在-80℃的各菌株取出，划线于YPD固体培养基，28℃培养48h，然后挑取单菌落，接种于10mL的YPD液体培养基中活化，于恒温摇床中培养(28℃，150r/min)至对数末期。将初次活化的酵母菌液转接于100mL的YPD液体培养基的锥形瓶中进行活化，于恒温摇床培养(28℃，150r/min)至菌株生长对数末期。

分别在葡萄汁中接种不同的酵母菌设置为不同的发酵组。不接种任何菌株的样品为自然发酵组，标记为S。在葡萄汁中接种购自法国LAFFORT公司的商业酿酒酵母ZYMAFLOREX16的样品标记为SC，在葡萄汁中只接种酿酒酵母Sc-19的样品标记为Sc-19，在葡萄汁中只接种葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2的样品标记为Hu-2，在葡萄汁中同时接种酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混合发酵的样品标记为Sc-19+Hu-2(Sc-19和Hu-2的接种活菌比例为1：1)；除不接种任何菌株自然发酵的样品外，其他发酵组的接种量均使得葡萄汁中总活菌数为10⁶CFC/mL。将未接种菌液和接种有不同菌液的葡萄汁分别在温度为22℃的条件下进行发酵，发酵约360h后(在葡萄酒发酵过程中每隔72h取一次发酵酒样，在比重低于1.0时，酒精发酵结束)，得到发酵液。然后将发酵液进行皮渣分离，得到葡萄原酒，将葡萄原酒灌装后在10℃的冰箱中存储备用。

2、葡萄酒的评价方法

(1)葡萄酒发酵过程中及发酵终点理化指标测定方法

可溶性固形物用便携式手持糖量计测定；pH值用pH计测定；总酸含量和酒精度分别参照国标GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酸碱滴定法和密度瓶法测定。

(2)葡萄酒发酵过程中有机酸测定方法

样品处理：取1mL葡萄酒于25mL离心管，加pH＝2.5的磷酸水溶液9mL，混匀，10000r/min，4℃离心15min，取上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液置于2mL的进样瓶中待色谱测定。

色谱准备：流动相为体积比为3：97的甲醇：磷酸水溶液(pH＝2.5)，色谱级甲醇购自德国默克公司，磷酸购自国药集团化学试剂有限公司，C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。色谱柱柱温30℃，流动相流速0.7mL/min，进样体积10μL，在λ＝210nm时检测。流动相在使用前进行过滤处理，其中甲醇用0.45μm有机相滤膜过滤，磷酸水用0.45μm水相滤膜过滤，并进行超声脱气处理30min。

有机酸标准曲线绘制：称取购自上海源叶生物科技有限公司的酒石酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸四种有机酸标准品，用流动相pH＝2.5的磷酸水溶液溶解并定容，摇匀，得到200.00mg/mL的有机酸标准品母液；吸取上述标准品母液，加pH＝2.5的磷酸水溶液配制成不同质量浓度的酒石酸、柠檬酸、苹果酸系列混合标准溶液；用0.45μm滤膜过滤到2mL的进样瓶中待色谱测定。将系列浓度梯度的标准溶液注入HPLC仪器确定相应的峰面积。以横坐标为标准工作溶液的浓度、以纵坐标为峰值的高度或面积来绘制标准曲线。

样品定量：将处理后的样品注入进样量为10μL的高速液相色谱仪中，测定峰高或峰面积，由标准曲线确定待测液体中有机酸的浓度，根据有机酸计算公式：“有机酸含量＝标曲求得有机酸浓度×样品稀释倍数”确定葡萄酒中有机酸的含量(g/L)。

(3)葡萄酒发酵过程中挥发性风味物质的测定方法

酒样前处理：在20mL顶空瓶中加入2.5g NaCl(购自北京北化精细化学有限责任公司)和磁力转子，量取10mL葡萄酒样和20μL内标(2-辛醇，200mg/L)，然后用带有聚四氟乙烯隔垫的样品盖拧紧。在45℃条件下，平衡10min，然后采用巩义市英峪予仪器公司DF-101S型号的恒温磁力搅拌器，持续搅拌萃取45min，采用美国Supelco公司57330-U型的SPME手动进样手柄和PDMS/CAR/DVB型号的固相微萃取头。

萃取完成后在GC进样口解析，解析时间5min。气相色谱条件：色谱柱为TG-WAXMS(30m×0.25mm，0.25μm)；载气为氦气(He)，升温程序为：40℃保持5min，以5℃/min升温至70℃保持1min，再以10℃/min升温至90℃保持3min，再以3℃/min升温至110℃，再以10℃/min升温至230℃，保持8min。气相色谱仪购自美国安捷伦公司，型号为Agilent 5975C。

质谱条件:电子轰击源(electron ionization，EI)；电离能量70eV；离子源温度230℃；传输线温度250℃；四级杆温度150℃；选择SCAN模式进行全扫描。质谱仪购自美国安捷伦公司，型号为7890A。

风味物质定性分析：利用质谱全离子扫描图谱，对检测到的风味物质用NIST 08.L进行检索和定性分析。

风味物质定量分析：由以下公式计算得出(mg/L)，

香气活力值(odor activity value，OAV)：用OAV值评价香气物质实际的气味贡献，通常OAV大于1时被认为该物质具有香气贡献，由以下公式计算得出，

(4)葡萄酒感官评价方法

依据GB/T 15038-2006标准制定葡萄酒的评分标准，葡萄酒的评分标准如表3所示。由10名接受过专业葡萄酒感官品评培训的学生组成评价小组，分别从葡萄酒的外观、香气、滋味以及典型性4个方面进行品鉴，总分100分。

表3

3、不同菌种添加方式葡萄酒的评价结果

(1)不同菌种添加方式发酵的葡萄酒的理化指标变化

可溶性固形物含量：图2为不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中可溶性固形物含量的变化图，由图2可以看出，不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中可溶性固形物含量随着发酵的进行，总体呈现下降趋势。在0-9d内下降速率最快，酵母菌在此期间通过大量的生长、繁殖将糖转化成酒精，使可溶性固形物的含量较显著地降低；发酵至9天时糖度变化开始变缓慢；发酵至15d结束。第15d发酵终点时，自然发酵葡萄酒的糖度为7.37°Brix；添加商业酵母发酵的葡萄酒糖度为7.03°Brix；添加酿酒酵母Sc-19发酵的葡萄酒糖度为7.33°Brix；添加葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2发酵的葡萄酒糖度为6.83°Brix；添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒糖度为6.50°Brix。相较其它方式，添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2进行混菌发酵可获得较为彻底的发酵结果。说明混菌发酵的酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2在发酵过程中具有较优的代谢转化能力。

pH值：图3是不同菌种添加方式的葡萄酒随着发酵的进行pH值变化图。由图3可以看出，随着发酵的进行，各发酵葡萄酒以3.57的起始pH值缓慢下降。由于各菌株的发酵效力不同，促进产酸能力也各不相同，不同菌种添加方式在15d发酵终点时的pH值不一样。15d发酵终点时，自然发酵葡萄酒的pH值为3.42；添加商业酵母发酵的葡萄酒的pH值为3.40；添加酿酒酵母Sc-19发酵的葡萄酒的pH值为3.40；添加葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2发酵的葡萄酒的pH值为3.41；添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒的pH值为3.40。

总酸含量：图4是不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中的总酸含量结果图。由图4可以看出，不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中的总酸含量差异显著。15d发酵终点时，自然发酵葡萄酒的挥发酸和固定酸的总含量为6.18g/L；添加商业酵母发酵的葡萄酒的挥发酸和固定酸的总含量为4.78g/L；添加酿酒酵母Sc-19发酵的葡萄酒的挥发酸和固定酸的总含量为5.04g/L；添加葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2发酵的葡萄酒的挥发酸和固定酸的总含量为5.28g/L；添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒的挥发酸和固定酸的总含量为4.48g/L。总酸含量直接影响果实的风味与口感，合适的糖酸比是酿造高品质葡萄酒的必要条件之一，葡萄酒的色调也深受酸含量的影响，酸度越高，红葡萄酒的红色越亮，酸度越低，红葡萄酒的颜色越偏蓝紫色。

酒精度：图5是不同菌种添加方式发酵的葡萄酒的酒精度结果图。由图5可以看出，发酵前期，酵母菌迅速繁殖，将可发酵糖转化为酒精，使得葡萄酒中的酒精度迅速提升；发酵终点时不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中的酒精度差异显著。15d发酵终点时，自然发酵葡萄酒的酒精度为8.17％vol；添加商业酵母发酵的葡萄酒的酒精度为10.72％vol；添加酿酒酵母Sc-19发酵的葡萄酒的酒精度为11.65％vol；添加葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2发酵的葡萄酒的酒精度为10.45％vol；添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒的酒精度为12.35％vol。在8％vol-15％vol的酒精度范围要求内，本发明的两株菌株(酿酒酵母Sc-19、葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2)都可应用于葡萄酒发酵；添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵较显著促进了葡萄酒中乙醇的产生。

(2)不同菌种添加方式发酵过程中葡萄酒中的有机酸

图6a、图6b、图6c和图6d分别为不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中酒石酸、苹果酸、乳酸和琥珀酸的含量结果图。由图6a、图6b、图6c和图6d可以看出，不同菌种添加方式发酵葡萄酒所得葡萄酒中有机酸含量差异显著，在发酵过程中酒石酸和苹果酸的含量逐渐下降，乳酸和琥珀酸的含量微弱上升。15d发酵终点时，自然发酵葡萄酒的酒石酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸的含量分别为4.12g/L、2.65g/L、5.09g/L、1.18g/L，四种有机酸总含量为13.04g/L；添加商业酵母发酵的葡萄酒的酒石酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸的含量分别为3.63g/L、2.48g/L、5.64g/L、1.26g/L，四种有机酸总含量为13.01g/L；添加酿酒酵母Sc-19发酵的葡萄酒的苹果酸、乳酸、琥珀酸的含量分别为2.54g/L、5.5g/L、1.56g/L，三种有机酸总含量为9.6g/L；添加葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2发酵的葡萄酒的酒石酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸的含量分别为3.22g/L、2.4g/L、5.37g/L、1.46g/L，四种有机酸总含量为12.45g/L；添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒的酒石酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸的含量分别为2.75g/L、2.25g/L、5.34g/L、1.44g/L，四种有机酸总含量为11.78g/L。

添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒中四种有机酸的总含量均明显低于自然发酵的葡萄酒和添加商业酵母发酵的葡萄酒，酒石酸、苹果酸含量为这5种酵母菌株添加方式中最低的。说明筛选所得酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2在葡萄酒发酵中有可观的应用。

(3)不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中的挥发性风味物质

不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中的挥发性风味物质OAV值结果如表4所示。

表4

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注：“-”表示未查阅到相关文献；“ND”表示在发酵末期的酒样中未检出该化合物；S：自然发酵；SC：商业酵母；Sc-19：酿酒酵母；Hu-2：葡萄汁有孢汉逊酵母

图7是不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中不同发酵时期挥发性风味物质聚类热图。聚类热图通过颜色的变化来反应不同风味物质的含量，红色表示所代表的风味物质含量高，蓝色表示代表的风味物质含量低。不同发酵组的样品均随着发酵的进行，风味物质的种类与浓度逐渐增多。自然发酵的样品中风味物质的种类和浓度较高，香气复杂，但是也导致香气不协调。接种Sc-19的样品、混菌发酵的样品与商业酵母的相似度较高。

由表4和图7可以看出，这两株菌均能够很好的促进酯类、醇类、醛酮类等挥发性风味物质的形成。这几种不同菌种添加方式发酵的葡萄酒中的挥发性风味物质有38种，醇类7种，酸类4种，酯类21种，其他类6种；其中OAV>1的风味物质有9种：3种醇类物质(异戊醇、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇)，5种酯类物质(乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯)，1种醛类物质(苯乙醛)。

在添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒中，具奶酪味的2-甲基-1-丁醇OAV值为3.7498，具香蕉气味的乙酸异戊酯OAV值为10.4136，具白兰地酒香的辛酸乙酯OAV值为5.4946，具强烈甜果香的丁酸乙酯OAV值为1.0726。这四种风味成分对添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒的风味贡献比其它酵母添加方式发酵的葡萄酒更具有典型性，尤其是与添加商业酵母发酵的葡萄酒相比。对葡萄酒风味有重要意义的醇类物质与酯类物质在添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒中的含量分别为15.72mg/L和3.10mg/L，显著优于添加商业酵母发酵的葡萄酒中的含量，15.07mg/L的醇类物质和1.74mg/L的酯类物质。

添加酿酒酵母Sc-19单一发酵的葡萄酒中辛酸乙酯、苯乙醇、异戊醇含量显著较高，添加葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2单一发酵的葡萄酒中乙酸乙酯的含量显著较高，添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混菌发酵的葡萄酒中丁酸乙酯、异戊醇的含量显著高于单菌发酵的含量。

酿酒酵母Sc-19、葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2与商业酵母相比，发酵生成挥发性风味物质的种类和含量没有明显缺陷，适合应用于发酵葡萄酒，体现葡萄酒独特风味。

(4)不同菌种添加方式发酵的葡萄酒的感官评价

图8是不同菌种添加方式发酵的葡萄酒的感官评价分析图，由图8可以看出，添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混合发酵的葡萄酒具有一定的典型性，在口感、香气、清澈度、色泽方面均优于其它四种菌种添加方式发酵得到的葡萄酒。

不同菌种添加方式发酵的葡萄酒酒体均呈清澈的紫红色。自然发酵的葡萄酒(总分48.3分)有光泽，但口感整体不协调，偏酸，无明显的花香、果香及酒香，余味较短；添加商业酵母发酵的葡萄酒(总分59.7分)酒香最为突出，且伴有微坚果香气，回味较自然发酵葡萄酒长，但花香、果香弱，单宁的结构感较强，平衡性一般；添加酿酒酵母Sc-19发酵的葡萄酒(总分61.3分)澄清有光泽，酒香较丰富、果香较突出，有黑加仑等水果香气，整体较为协调，但尾味较短；添加葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2发酵的葡萄酒(总分61.2分)具橙子香气及淡淡花香，风味优雅，酒香果香平衡较好，但回味较短；添加酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2混合发酵的葡萄酒(总分66.4分)澄清有光泽，香气优雅，伴有烘烤香气，花香、果香及酒香更加协调，口感纯正，回味绵延。

综上所述，分离筛选所得酿酒酵母Sc-19和葡萄汁有孢汉逊酵母Hu-2在葡萄酒发酵过程中能促进风味物质的产生，根据香型以及生产的需要选择不同的菌株进行发酵，或采取多种菌株混合发酵的形式，可改善葡萄酒的风味及品质稳定性，突出本土优良菌株发酵葡萄酒的风格特征。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或者，所述酵母菌为保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母和/或保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有保藏号为CGMCC NO.27154的酿酒酵母和保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母；所述菌剂中，保藏号为CGMCCNO.27154的酿酒酵母和保藏号为CGMCC NO.27155的葡萄汁有孢汉逊酵母的活菌数之比为(0.5-5)：1。

4.一种葡萄酒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将权利要求2或3所述的菌剂接种至葡萄汁中进行发酵。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述菌剂的接种量使得葡萄汁中的总活菌数为10⁵-10⁷CFU/mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件包括：温度为20-25℃，时间为300-400h。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄汁的制备方法包括：将酿酒葡萄进行破碎除梗，然后将破碎除梗后的酿酒葡萄与焦亚硫酸钾、果胶酶进行混合。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，以破碎除梗后的酿酒葡萄的总体积为1L计，焦亚硫酸钾和果胶酶的用量分别为60-80mg和15-30mg。

9.一种权利要求4-8中任意一项所述的制备方法制得的葡萄酒。

10.一种权利要求1所述的酵母菌或权利要求2或3所述的菌剂在改善葡萄酒的风味和/或品质稳定性中的应用。