CN117736273B - 一种替尔泊肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种替尔泊肽的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：用碳酸盐缓冲盐溶解替尔泊肽原料，先后进行三步提纯，然后再进行浓缩、调节pH、过滤除菌、干燥，得到替尔泊肽。本发明用碳酸盐缓冲体系溶解替尔泊肽原料，可以达到有效提高溶解度，提高分离效果，而且本发明第一次纯化为酸性条件，第二次纯化为碱性条件，其方法的适用性较强，运用较广，对极性相近的杂质去除效果比较好。即使在现有固相合成的粗肽纯度较差的条件下，该方法仍能达到纯度99.5％以上，单杂控制0.1％以下，总纯化收率高达70％以上。
Description
技术领域
本发明属于一种多肽药物的纯化技术领域，特别涉及一种替尔泊肽的纯化方法。
背景技术
替尔泊肽(Tirzepatide)是礼来公司开发的一款葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的双重激动剂，其CAS号为2023788-19-2。替尔泊肽是一种具有C20脂肪二酸部分的39个氨基酸修饰肽，能够结合白蛋白并延长半衰期。2023年7月27日，礼来公布了两项关于替尔泊肽的临床3期试验结果，结果显示，平均减重效果高达26.6％。替尔泊肽通过激活GLP-1受体，能够减少饥饿感，从而减少饮食和热量的摄入，而激活GIP受体可以减少饮食和热量的摄入并增加能量消耗。
由于替尔泊肽固相合成中的肽链过长，侧链含有较长的修饰，形成空间位阻较大，从而导致较多的缺失肽杂质，如缺失肽Ser11和缺失肽Ile12等以及缺失Gly4以及增加Gly30等常见又难以去除的杂质。
CN112661815A发明公开了一种Tirzepatide的纯化方法，该纯化方法将Tirzepatide粗肽溶于纯化水中，用氨水调pH8.0至完全溶解，获得粗肽溶液后，通过二步纯化获得Tirzepatide。该发明方法的收率为70％左右，获得的Tirzepatide纯度99.0％以上，单杂0.15％以下。但是，该发明对于特定的缺失肽Ser11和缺失肽Ile12等单杂无法完全控制至0.1％以下，去除效果较差。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种替尔泊肽的纯化方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种替尔泊肽的纯化方法，包括以下步骤：
1)用碳酸盐缓冲盐溶解替尔泊肽原料，过滤收集滤液备用；
2)对步骤1)得到的滤液进行第一步纯化，以反相填料为固定相，乙酸溶液为A相，极性有机溶剂为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于93％，单杂小于1％的组分；
3)对步骤2)得到的组分进行第二步纯化，以反相填料为固定相，乙酸缓冲盐为A相，极性有机溶剂为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于99％，单杂小于0.3％的组分；
4)对步骤3)得到的组分进行第三步纯化，以反相填料为固定相，碳酸缓冲盐为A相，极性有机溶剂为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的组分；
5)对步骤4)得到的组分进行浓缩、调节pH、过滤除菌、干燥，得到替尔泊肽。
在一些实例中，所述步骤1)和步骤4)中的碳酸缓冲盐选自碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或碳酸铵溶液。
在一些实例中，所述碳酸缓冲盐浓度为10～100mMol。
在一些实例中，所述步骤2)中的乙酸溶液的浓度的体积百分比为0.05％～3％。
在一些实例中，所述步骤3)中的乙酸缓冲盐选自乙酸铵、乙酸钠或乙酸钾溶液，所述乙酸缓冲盐的浓度为10～500mMol，pH7.5～8.5。
在一些实例中，以体积百分比计算，所述步骤2)的梯度洗脱的方法为：A％：65％～55％，B％：35％～45％，线性梯度洗脱80～90min。
在一些实例中，以体积百分比计算，所述步骤3)的梯度洗脱的方法为：A％：70％～60％，B％：30％～40％，线性梯度洗脱80～90min。
在一些实例中，以体积百分比计算，所述步骤4)的梯度洗脱的方法为：A％：73％～60％，B％：27％～40％，线性梯度洗脱60～70min。
在一些实例中，所述极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈或异丙醇中的至少一种。
在一些实例中，所述反相填料选自四烷基硅烷键合硅胶填料、八烷基硅烷键合硅胶填料或十八烷基硅烷键合硅胶填料。
本发明的有益效果是：
替尔泊肽固相合成后含有大量的三氟乙酸，常用氨水或乙腈增加其溶解度，但其pH值比较难控制以及溶液的缓冲能力较弱，本发明用碳酸盐缓冲体系溶解粗肽，溶解体积小，粗肽浓度高，可以达到20-50g/L，提高分离效果。
本发明的方法中第一次纯化为酸性条件，第二次纯化为碱性条件，其方法的适用性较强，运用较广，对极性相近的杂质去除效果比较好。即使在现有固相合成的粗肽纯度较差的条件下，该方法仍能达到纯度99.5％以上，单杂控制0.1％以下，总纯化收率高达70％以上。
本发明的一些实施例中，第一步纯化采用八烷基硅烷键合硅胶填料，稀乙酸作为缓冲体系A相，100％乙腈为B相，进行梯度洗脱，可以去除替尔泊肽很多杂质，特别是极性与主峰很相近的缺失肽杂质，如缺失肽Ser11和缺失肽Ile12以及缺失肽Ser11-Ile12，该缺失肽在现有的替尔泊肽合成工艺中，特别容易产生，为替尔泊肽的常见杂质。
本发明的一些实施例中，第二步纯化采用八烷基硅烷键合硅胶填料，乙酸钠作为缓冲体系A相，100％乙腈为B相，进行梯度洗脱，对于缺失肽Gly4和缺失肽Gly30以及加Gly4或Gly30等杂质具有较好的除杂效果。
本发明的一些实施例中，第三步纯化采用八烷基硅烷键合硅胶填料，碳酸氢铵作为缓冲体系A相，100％乙腈为B相，进行梯度洗脱，一方面可以进一步提高纯度，控制单杂在0.1％以下的同时，另一方面还可以将前面的乙酸钠盐除，碳酸氢铵在后续的旋蒸与冻干中得以挥发，转化为无盐形式，方便后续根据需求转化为所需的盐形式。
替尔泊肽在本发明的一些实施例中，采用了标定其含量后，加入氢氧化钠形成钠盐形式，可以增加其溶解度，方便后续剂型的开发与改进，优于乙酸盐形式。
附图说明
图1为实施例1替尔泊肽粗品色谱图；
图2为实施例1替尔泊肽第一步纯化合格组分色谱图；
图3为实施例2替尔泊肽第二步纯化合格组分色谱图；
图4为实施例3替尔泊肽第三步纯化合格组分色谱图；
图5为实施例5制备的替尔泊肽的质谱图。
具体实施方式
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
实施例1：替尔泊肽粗肽的溶解以及第一步纯化
1)固相合成替尔泊肽，粗肽纯度为56％(附图1)。将20g固体替尔泊肽粗肽溶于800mL的50mMol的碳酸氢铵中，搅拌超声使样品完全溶解后用0.45μm的滤膜过滤，收集滤液备用。
2)第一步纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，柱子直径和长度为150mm*250mm。流速：500mL/min，检测波长：210nm和254nm。线性梯度洗脱80min。
纯化过程：上样量为20g，上样完毕后进行线性洗脱，收集目的峰，收集纯度大于93％，单杂小于1％的组分(附图2)，加组分等体积的水稀释一倍后作为第二步纯化样品。
3)不同乙腈梯度洗脱
流动相A相：2％的乙酸水溶液；流动相B相：100％乙腈。采用四种不同乙腈梯度洗脱，试验结果如下表1所示。
表1有机溶剂梯度纯化检测结果
| 实验名称 | A相 | B相 | 检测纯度 |
| 实验1 | 50％-48％ | 50％-62％ | 80％ |
| 实验2 | 65％-55％ | 35％-45％ | 93％ |
| 实验3 | 67％-58％ | 33％-42％ | 91％ |
| 实验4 | 84％-72％ | 16％-28％ | 72％ |
实验1由于乙腈的洗脱比例过高，在杂质没有充分分离的情况下，洗脱下来，纯度较差。实验4由于B相乙腈比例过低，难以洗脱下来，后面由冲高浓时洗脱，洗脱后检测纯度为72％。故B相有机溶剂的体积百分比为30％-50％的条件下，具有较好的杂质分离效果和收率。
4)不同浓度的乙酸洗脱
固定洗脱梯度为：A％：65％-55％，B％：35％-45％。流动相A相为乙酸水溶液，采用四种不同浓度的稀乙酸洗脱，流动相B相为100％乙腈。试验结果如下表2所示。
表2不同乙酸浓度纯度检测结果
| 实验名称 | A相乙酸浓度 | 粗肽载样量 | 检测纯度 |
| 实验5 | 0.04％ | 20g | 87％ |
| 实验6 | 0.04％ | 10g | 90％ |
| 实验7 | 0.5％ | 20g | 92％ |
| 实验8 | 2％ | 20g | 93％ |
| 实验9 | 2％ | 25g | 93％ |
| 实验10 | 4％ | 20g | 90％ |
实验结果如表2所述，实验5与实验7相比较，产品在流动相中的缓冲能力下降，分离效果变差。实验6和实验7相比较，乙酸浓度低于0.04％时，其分离效果和柱子的载样量也下降了。实验10中，乙酸浓度过大，柱子吸附能力变强也会导致分离效果变差，同时乙酸的用量变大，纯化成本也会提高。根据实验7，8，9，乙酸浓度体积百分比在0.05％-3％内，产品不仅在乙酸中的缓冲能力较好，在柱子上的吸附力合适，而且纯化的载样量较高以及纯化的效果最好。
实施例2：第二步纯化
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，柱子直径和长度为150mm*250mm。
纯化过程：上样完毕后进行线性洗脱，收集目的峰，收集纯度大于99％，单杂小于0.3％的组分(附图3)；加组分等体积的水稀释一倍后作为第三步纯化样品。
梯度：A％：70％-60％，B％：30％-40％，线性梯度洗脱80min。
流动相A相为不同浓度的乙酸钠，流动相B相：100％乙腈，流速：500mL/min，检测波长：210nm和254nm。实验结果如表3所述。
表3不同乙酸钠浓度纯化检测结果
| 实验名称 | 乙酸钠浓度 | 最大单杂 | 检测纯度 |
| 实验11 | 5mMol | 0.7％ | 95.2％ |
| 实验12 | 25mMol | 0.4％ | 98.2％ |
| 实验13 | 50mMol | 0.2％ | 99.2％ |
| 实验14 | 100mMol | 0.2％ | 98.8％ |
| 实验15 | 200mMol | 0.3％ | 99.1％ |
实验11中，乙酸钠浓度过低时，替尔泊肽在流动相中的缓冲能力下降，产品于柱子上的吸附能力变弱，从而导致分离效果变差，产品的载样量下降，实验15中，乙酸钠的浓度高于100mMol时，在冲洗柱子时，高比例的乙酸钠难溶于乙腈，容易析出，造成柱子堵塞，同时最大单杂也偏大些，根据实验12，13和14的结果，乙酸钠的浓度为10-100mMol时，产品不仅在乙酸钠中的缓冲能力较好，而且纯化的载样量较高以及与杂质的分离效果较好。
实施例3：第三步纯化
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，柱子直径和长度为150mm*250mm。
流动相A相：20mM碳酸氢铵溶液；流动相B相：100％乙腈，流速：500mL/min，检测波长：210nm和254nm。A％：73％-60％，B％：27％-40％，线性梯度洗脱60min；
纯化过程：上样完毕后进行线性洗脱，收集目的峰，纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的组分(附图4)。
实施例4：转盐后将纯化馏分浓缩
根据标品计算组分，加入50mMol的氢氧化钠溶液后，将合格馏分混合后于水温30℃，真空度为-0.09Mbar的条件下进行减压浓缩。
实施例5：冷冻干燥
将样品放进冻干盘，进行冷冻干燥，冷冻干燥解吸附温度为35℃，真空压力为0.1Pa，得到大于99.5％，最大单杂小于0.1％的替尔泊肽6.85g(附图5)，纯化总收率为71.5％。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种替尔泊肽的纯化方法，其特征在于，梯度洗脱中使用的反相填料为八烷基硅烷键合硅胶填料，包括以下步骤：
1）用50 mM碳酸氢铵溶液溶解替尔泊肽原料，过滤收集滤液备用；
2）对步骤1）得到的滤液进行第一步纯化，反相填料为固定相，以体积浓度为0.05％～3％的乙酸溶液为A相，体积浓度为100%的乙腈为B相，梯度洗脱方法为A相体积百分比为65%～55%，B相体积百分比为35%～45%，进行线性梯度洗脱80～90min，收集纯度大于93%，单杂小于1%的组分；
3）对步骤2）得到的组分进行第二步纯化，反相填料为固定相，以浓度10～100mM，pH7.5～8.5的乙酸钠溶液为A相，体积浓度为100%的乙腈为B相，梯度洗脱方法为A相体积百分比为70%～60%，B相体积百分比为30%～40%，进行线性梯度洗脱80～90min，收集纯度大于99%，单杂小于0.3%的组分；
4）对步骤3）得到的组分进行第三步纯化，反相填料为固定相，以20 mM碳酸氢铵溶液为A相，体积浓度为100%的乙腈为B相，梯度洗脱方法为A相体积百分比为73%～60%，B相体积百分比为27%～40%，进行线性梯度洗脱60～70min，收集纯度大于99.5%，单杂小于0.1%的组分；
5）对步骤4）得到的组分进行浓缩、调节pH、过滤除菌、干燥，得到替尔泊肽。
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