CN117721068A - 一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物领域，具体提供了一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，通过模拟血液循环的流路系统将模拟肠道微生物与肠上皮细胞之间相互作用的肠道芯片与模拟大脑中枢关键功能部分的神经‑血管单元(NVU)芯片有机结合，构成可模拟微生物、肠道和大脑之间的代谢、免疫和激素信号传导过程的MGB轴双向信号系统。在此基础上，将抑郁症患者的肠道菌群移植到MGB轴微流控芯片的肠道芯片中，构建出一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型，可以实现抑郁疾病中肠道微生物与CNS的互作研究，并挖掘与抑郁显著相关的微生物种并开发针对性治疗的精神药物及益生菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体而言，涉及一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法。
背景技术
抑郁是现代人最常见的一种心理疾病，患者临床表现情绪低落、意志消沉、自卑痛苦和厌世，严重者会出现躯体化症状(恶心呕吐、胸闷)和精神分裂症状(幻觉、思维及言语紊乱)，甚至有自杀倾向和行为。迄今，抑郁发生的分子机制尚不清楚，客观诊断和临床治疗存在困难。目前，用于抑郁症和肠道菌群相关性研究的模型仍以哺乳动物抑郁模型和临床抑郁症患者为主，且一般为体内实验。由于宿主全身系统的高度复杂性，实验难以严格控制单一变量；并且由于动物和人类本身存在物种差异，实验结果缺乏临床应用性；另外，体内实验还存在个体差异性大、实验周期长和伦理性等问题。因此，构建一种可模拟人体的体外抑郁样模型，并借助其开展抑郁症分子机制及抗抑郁药物的筛选和临床前效果评价研究，有助于突破当前研究的瓶颈。
随着微生物学的发展，人们逐渐认识到肠道微生物组在抑郁的病理生理学中发挥着重要影响。微生物-肠-脑(Microbiota-gut-brain,MGB)轴作为实现肠道与大脑双向交流的信号通路，已成为有效预防和治疗包括抑郁症在内的中枢神经系统疾病的潜在靶标。针对MGB轴的研究可以探明肠道微生物群与中枢神经系统(CNS)间相互作用的分子机制、肠道菌群与CNS疾病的因果关系。在抑郁患者体内，肠道菌群的结构和组成会发生特征性的变化，如促炎细菌增多，产短链脂肪酸菌减少。将抑郁患者的肠道微生物群移植给无菌小鼠时，小鼠会产生抑郁样行为和表型，而恢复正常的肠道菌群能改善动物的抑郁样行为和抑郁患者的情绪。这些研究表明肠道微生物群可以作为介质在不同受试者间转移，进而产生抑郁样的心理和生理症状。
微流控是一种在集成的微通道内对微量流体进行精确操控的技术，在生物医学领域得到了广泛的应用，结合运用具有可塑性强、疏水透气、透光率高和生物相容性好等优点的聚二甲基硅氧烷(PDMS)高分子材料，可以根据不同的需求灵活制备出不同构型的仿生器件。基于微流控技术制备的器官芯片，尺寸同细胞生长相匹配、环境贴近体内生理环境，能在体外进行活体组织培养，以模拟人体器官的关键功能单元，并用于药物筛选、组织分析、疾病建模和毒性测试等研究。相较于人体临床或动物实验而言，器官芯片不仅在时间和空间维度上能进行更精确的把控，在准确性、通量和成本等方面展现出巨大的优势，还能在贴近人体生理环境的同时避免伦理问题。另外，微流控器官芯片因其设计的灵活性，能够在体外结合细胞微环境实现多种微生物和细胞功能的互作研究，成为了新一代人体组织工程研究的重要平台。因此，亟待提出一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，以解决相关技术中的问题。
前期工作已搭建MGB轴的微流控器官芯片，即通过模拟血液循环的流路系统将模拟肠道微生物与肠上皮细胞之间相互作用的肠道芯片与模拟大脑中枢关键功能部分的神经-血管单元(NVU)芯片有机结合，构成可模拟微生物、肠道和大脑之间的代谢、免疫和激素信号传导过程的MGB轴双向信号系统。在此基础上，将抑郁症患者的肠道菌群移植到MGB轴微流控芯片的肠道芯片中，构建出一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型，可以实现抑郁疾病中肠道微生物与CNS的互作研究，并挖掘与抑郁显著相关的微生物种并开发针对性治疗的精神药物及益生菌，进一步，还可以借助其开展抗抑郁药物的筛选和临床前效果评价研究。另外，该模型构建的方法还能进一步拓展应用于其他与肠道微生物相关的神经精神类疾病的MGB轴微流控芯片模型建模。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，包括如下步骤：
S1：芯片使用前进行消毒处理，随后向芯片上下层通道灌注含20％胎牛血清的DMEM培养基1-3h，以去除芯片通道中的气泡，将芯片移入培养箱中，灌注0.5-1.5h以平衡芯片,向上层微通道注入ECM混合物,将芯片放置于二氧化碳培养箱中静置2-3h,再向上通道注入细胞培养基1-2h，以清除困在微通道内的气泡并冲洗未涂覆的ECM基质；
S2:细胞培养基重悬Caco-2细胞制成细胞密度为1.2×107cells/mL的单细胞悬液，用吸取约400-600μL单细胞悬液经注射泵注入芯片上层通道，显微镜观察确认细胞是否均匀分散；将芯片置于二氧化碳培养箱中静置孵育过夜,使得细胞沉降，贴附于ECM涂层的多孔膜上方；再向上、下层通道灌注细胞培养基，细胞培养4天可生长分化形成紧密连接的单层肠上皮屏障，并产生粘液层；
S3：向上下层通道注入不含抗生素的细胞培养基11-13h，将原始肠道菌群接种,离心获得细菌沉淀，PBS清洗两次，再经曝气除氧的肠道菌群培养基重悬，向肠道芯片上层通道注入40-60μL细菌悬液，于培养箱静置1-2h使菌群沉降；
S4：将无氧肠道菌群培养基持续灌注进上层通道中，芯片下层以相同速度灌注含氧细胞培养基，持续48h，从而构建抑郁症肠道体外模型；
S5：将肠道单元、BBB流入单元、大脑单元及BBB外排单元依次连接组建能够模拟体内MGB轴信号传导过程的仿生微流控芯片系统，将MGB轴系统中的肠道单元替换为上述构建的抑郁症的肠道体外模型，以相同的方式将他们进行连接、组装，基于MGB轴微流控芯片实现抑郁模型的体外构建；
S6：招募符合相应条件的志愿患者，获取他们的新鲜粪便样本并收集到足够的原始肠道菌群接种物，针对其它与肠道菌群有关的神经精神类疾病的MGB轴微流控芯片模型进行构建。
进一步地，所述S1中消毒处理为乙醇冲洗和/或紫外线照射。
进一步地，所述S1中DMEM培养基的灌注流速为800μL/min，芯片移入培养箱后降低流速至180-220μL/h，向上通道注入细胞培养基的灌注速率为200μL/h。
进一步地，所述ECM混合物为高糖DMEM培养基配置的100μg/mL鼠尾I型胶原蛋白和300μg/mL Matrigel基质胶混合而成。
进一步地，所述S2中吸取单细胞悬液采用1mL注射器吸取。
进一步地，所述S2中向上、下层通道灌注细胞培养基的灌注速率为100μL/h。
进一步地，所述S3中向上下层通道注入不含抗生素的细胞培养基的灌注速率为100μL/h。
进一步地，所述S4中将无氧肠道菌群培养基持续灌注进上层通道中的灌注速率为100μL/h。
进一步地，所述原始肠道菌群的制备方法为采集每名志愿者的晨起新鲜粪便各5g左右于无菌、无氧PBS缓冲液中，采集过程3分钟内完成，后立即在厌氧工作站中使用涡旋振荡器充分混匀，制成质量分数20％的匀浆悬液。用四层无菌纱布滤去残渣，收集滤液，即为原始肠道菌群接种物；然后将滤液与40％甘油以1:1混合，等分保存在2mL Eppendorf管中，储存在-20℃冰箱备用。
进一步地，所述无氧肠道菌群培养基配置如下：
血红素0.005g，维生素K1 0.5μL，黏蛋白1g，果胶1g，20％FBS+1％谷氨酰胺高糖DMEM培养基1L；
培养基配制后，进行高压灭菌及曝气除氧，每试管倒入5mL培养基，吸取50μL原始菌液至试管中。于37℃、200rpm的厌氧工作站中振荡培养。
进一步地，芯片为微流控芯片，制作方法如下：
制备芯片SU-8光刻胶膜具：清洗硅片后进行光刻胶涂布，使用真空泵和光刻机进行紫外曝光，中烘冷却后显影，再以后烘增加光刻胶与硅片的粘附强度，最后于硅片上滴加三滴三甲基氯硅烷以对硅片表面进行疏水修饰，保证后续PDMS块脱模方便；
制备PDMS芯片：将PDMS聚合体与固化剂以10:1的比例配制，搅拌混合后倒入芯片模具，抽真空2h排尽气泡，放入80℃电热恒温鼓风干燥箱使PDMS交联固化，再用美工刀切割PDMS完成脱模及尺寸修整，最后根据通道设计进行打孔和利用等离子体上下键合；键合好的芯片放入65℃电热恒温鼓风干燥箱2h进行不可逆结合，得到芯片实物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明方法方便快捷、耗费少，能在较短的时间周期内大批量构建体外抑郁样模型；材料易得且对人体友好，能在不损伤机体的情况下获得多组实验样本，避免实验偶然性；高度贴合人体，构建体外抑郁样模型的实验样本来源于人体，不存在物种差异问题；特异性高，能针对特定个体建立个性化的研究、治疗方案；适用性广，本建模方法适用于其他多种神经精神类疾病的肠道相关的疾病模型建模及治疗研究，具有极高的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
本说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明抑郁症的肠道体外模型设计图；
图2为本发明芯片示意图；
图3为本发明芯片组装与运行实验图；
图4为本发明免疫荧光染色紧密连接蛋白ZO-1和粘蛋白Muc-2。(A)ZO-1，虚线显示绒毛样结构；(B)Muc-2；
图5为(A)抑郁组ZO-1免疫荧光染色；(B)健康组ZO-1免疫荧光染色；(C)健康组与抑郁组ZO-1平均荧光强度，n＝20；(D)健康组与抑郁组荧光黄Papp，n＝6。(“***”表示P<0.001，“*”表示，P<0.05)；
图6为本发明健康组和抑郁组的alpha多样性指数(n＝7，“ns”表示P>0.05)；
图7为本发明健康组和抑郁组基于Bray_curtis距离(A)和unifrac距离(B)的PCoA分析；
图8为健康组与抑郁组肠道菌群LefSe分析(A)和丰度前10的菌属(B)；
图9为健康组与抑郁组属水平链球菌属(A)、梭菌属IV簇(B)相对丰度变化图(n＝7，“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05)；
图10为抑郁组与健康组上(A)、下(B)层流出物细胞因子水平变化(n＝8，“*”表示P<0.05，“ns”表示P>0.05)；
图11为抑郁组与健康组上(A)、下(B)层流出物神经递质5-HT水平变化(n＝8，“*”表示P<0.05，“ns”表示P>0.05)；
图12抑郁组与健康组上、下层流出液PCA分析(A、D)；OPLS-DA得分(B、E)；OPLS-DA模型置换检验(C、F)图；
图12为抑郁组与健康组上、下层流出液PCA分析(A、D)；OPLS-DA得分(B、E)；OPLS-DA模型置换检验(C、F)图；
图13为抑郁组与健康组芯片上(A)、下(B)层流出液差异代谢物火山图；
图14为抑郁组与健康组芯片上层流出液差异倍数前十的代谢物图；
图15为抑郁组与健康组芯片上层流出液差异倍数前十的代谢物；
图16为抑郁组与健康组芯片上层流出液差异代谢物通路分类图；
图17为抑郁组与健康组芯片上层流出液KEGG富集点图；
图18为抑郁组与健康组芯片下层流出液差异代谢物通路分类图；
图19为抑郁组与健康组芯片下层流出液KEGG富集点图；
图20为MGB轴体外模型的组装及运行示意图；
图21为NVU构成细胞的体外培养(A)hCMEC-D3细胞；(B)U-87MG细胞；
图22为免疫荧光染色紧密连接蛋白ZO-1和胶质纤维酸性蛋白GFAP。(A)ZO-1(B)GFAP；
图23为GV-971对抑郁患者肠道菌群的影响。(A)PCA结果分析；(B)属水平上物种差异；(C)火山图结果；
图24为(A)PCA图；(B)GV-971组与对照组的火山图；
图25为肠道菌群差异代谢物对BBB的通透性分析。(A)GV-971组与对照组差异代谢物经BBB作用前后的PCA图(B)GV-971组与对照组差异代谢物经BBB作用前后的火山图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)招募符合条件的抑郁症志愿者，要求条件如下：
入选标准：患有中度或重度抑郁症的患者，抑郁诊断符合ICD-10标准且有明确的医院诊断证明；年龄18-28周岁，体重指数BMI在18.5-23.9范围内。
排除标准：除抑郁症以外没有其他精神疾病；近2周内连续服用肠道微生态制剂如益生菌、益生元或抗生素药物超过3天；呼吸道、消化道、泌尿系统等部位感染或相关手术史；妊娠、哺乳期妇女和女性月经期间的样品；严重的心、肝、肺、肾、血液、内分泌、神经系统疾病及自身免疫疾病；吸烟、饮酒等嗜好。
(2)抑郁患者肠道菌群的收集
采集每名志愿者的晨起新鲜粪便各5g左右于无菌、无氧PBS缓冲液中，采集过程3分钟内完成。后立即在厌氧工作站中使用涡旋振荡器充分混匀，制成质量分数20％的匀浆悬液。用四层无菌纱布滤去残渣，收集滤液，即为原始肠道菌群接种物；然后将滤液与40％甘油以1:1混合，等分保存在2mL Eppendorf管中，储存在-20℃冰箱备用。
(3)肠道菌群的体外培养
前期工作确定了能在肠道芯片中实现肠道菌群与肠细胞共培养的肠道菌群培养基，该培养基既不显著影响Caco-2细胞生长又能最大程度维持肠道菌群生长且菌群结构、物种组成不变，其配制如下：
血红素0.005g，维生素K1 0.5μL，黏蛋白1g，果胶1g，20％FBS+1％谷氨酰胺高糖DMEM培养基1L。
培养基配制后，进行高压灭菌及曝气除氧，每试管倒入5mL培养基，吸取50μL原始菌液至试管中。于37℃、200rpm的厌氧工作站中振荡培养。
(4)微流控芯片的制作、组装
制备芯片SU-8光刻胶膜具：清洗硅片后进行光刻胶涂布，使用真空泵和光刻机进行紫外曝光，中烘冷却后显影，再以后烘增加光刻胶与硅片的粘附强度，最后于硅片上滴加三滴三甲基氯硅烷以对硅片表面进行疏水修饰，保证后续PDMS块脱模方便。
制备PDMS芯片：将PDMS聚合体与固化剂以10:1的比例配制，搅拌混合后倒入芯片模具，抽真空2h排尽气泡，放入80℃电热恒温鼓风干燥箱使PDMS交联固化，再用美工刀切割PDMS完成脱模及尺寸修整，最后根据通道设计进行打孔和利用等离子体上下键合。键合好的芯片放入65℃电热恒温鼓风干燥箱2h进行不可逆结合，得到芯片实物。
芯片制作后，将芯片的上、下微通道的出、入口管道进行组装，检测芯片是否有渗漏、膜是否多孔，将芯片连接注射器和注射泵，芯片和流出液收集部分放入二氧化碳培养箱中，完成芯片组装。
(5)基于肠道芯片的抑郁症肠道体外模型的构建
芯片前处理：芯片使用前进行乙醇冲洗和紫外线照射等消毒处理，随后向芯片上下层通道以800μL/min流速灌注含20％胎牛血清的DMEM培养基2h，以去除芯片通道中的气泡，随后将芯片移入培养箱中，降低流速至200μL/h，灌注1h以平衡芯片。向上层微通道注入ECM混合物(高糖DMEM培养基配置的100μg/mL鼠尾I型胶原蛋白和300μg/mL Matrigel基质胶)，将芯片放置于二氧化碳培养箱中静置3h。Caco-2细胞可在ECM涂层的多孔膜上表面有较强的结合性。再向上通道以200μL/h流速注入细胞培养基1h，以清除困在微通道内的气泡并冲洗未涂覆的ECM基质。
细胞接种：细胞培养基重悬Caco-2细胞制成细胞密度为1.2×107cells/mL的单细胞悬液，用1mL注射器吸取约500μL经注射泵注入芯片上层通道，显微镜观察确认细胞是否均匀分散。将芯片置于二氧化碳培养箱中静置孵育过夜(～12h),使得细胞沉降，贴附于ECM涂层的多孔膜上方。再以100μL/h流速向上、下层通道灌注细胞培养基，细胞培养4天可生长分化形成紧密连接的单层肠上皮屏障，并产生粘液层。
肠道菌群接种：细菌接种前，以100μL/h流速向上下层通道注入不含抗生素的细胞培养基12h。将原始肠道菌群接种物5000rpm离心5min获得细菌沉淀，PBS清洗两次，再经曝气除氧的肠道菌群培养基重悬(1:100)，向肠道芯片上层通道注入50μL细菌悬液，于培养箱静置2h使菌群沉降。
细胞-肠道菌群共培养：将无氧肠道菌群培养基以100μL/h流速持续灌注进上层通道中，芯片下层以相同速度灌注含氧细胞培养基，该过程持续48h，从而构建抑郁症肠道体外模型。
(6)构建MGB轴的体外抑郁样模型
前期工作已成功构建了肠道单元、BBB流入单元、大脑单元及BBB外排单元，并将它们依次连接成功组建了能够模拟体内MGB轴信号传导过程的仿生微流控芯片系统。基于前期工作，将MGB轴系统中的肠道单元替换为上述构建的抑郁症的肠道体外模型，以相同的方式将他们进行连接、组装，可以基于MGB轴微流控芯片实现抑郁模型的体外构建。
(7)其它与肠道菌群有关的神经精神类疾病的MGB轴微流控芯片模型构建
此类疾病模型的构建方法都是基于特定疾病患者的肠道菌群，只需要招募符合相应条件的志愿患者，获取他们的新鲜粪便样本并收集到足够的原始肠道菌群接种物，便能针对特定的疾病构建各种与肠道单元相关的仿生微流控芯片模型，并展开疾病相关的应用研究。
抑郁症的肠道体外模型
如图1所示，肠芯片模型具有双通道、双腔室，它包含了两层紧密对应的微流体通道，由涂有ECM的多孔膜隔开，形成上、下两个腔室。在中间的聚碳酸酯多孔膜(孔径1μm)上接种肠上皮细胞，模拟肠道屏障，进行吸收代谢，可以分泌粘液并具有免疫功能；上层通道模拟肠道空腔，其中生长着肠道微生物；下层通道模拟血管层的血液流动提供营养物质以及交换代谢废物。每个微通道都有专门的出入口，入口用于接种人体细胞或微生物，并通过层流灌注合适的培养基以精确控制物理化学参数、模拟流体流动和剪切应力；出口用于从各个腔室收集流出液以进行下游分析。同时，为了重现肠道和血液的不同氧气条件，向上层灌注无氧培养基而向下层灌注含氧培养基，溶解在下层培养基的氧气从“血管”向“肠腔”扩散，形成生理氧梯度，以实现好氧宿主细胞和厌氧肠道微生物的共培养。芯片的实物制作如图2所示，芯片的组装与运行如图3所示。
肠道芯片形成肠屏障和粘液层的表征
通过免疫荧光染色ZO-1蛋白，对肠上皮细胞屏障进行表征。如图4A所示，在芯片中流动培养4天后，Caco-2细胞形成了融合的多边形上皮单层，具有良好的紧密连接，其紧密连接蛋白ZO-1着色均匀且规则地分布于上皮细胞周围。通过免疫荧光染色粘蛋白Muc-2，对肠道粘液层进行表征。图4B结果显示，在芯片中流动培养4天后，Caco-2细胞成功分化出杯状细胞，有少量粘蛋白的分泌，可以形成肠道粘液层。
抑郁肠道模型的肠屏障功能表征
共培养48h后，肠道菌群会扰乱ZO-1蛋白在细胞边界的分布，使其在Caco-2细胞中出现明显的细胞质积累而使细胞轮廓呈模糊状。如图5A、B所示，抑郁组相比与健康组ZO-1染色表现出更明显的不连续、不完整及不清晰的形态，红色荧光分布不均匀且强度较弱，表明抑郁组相比于健康组可能存在肠上皮细胞紧密连接的缺陷或屏障功能的降低。利用ImageJ统计两组芯片ZO-1染色平均荧光强度以半定量地估计蛋白的相对表达水平，如图5C所示，抑郁组ZO-1蛋白表达显著性降低(P<0.05)。肠道通透性用荧光黄的渗透性系数表征，如图5D所示，抑郁组肠道通透性相比于健康组显著性升高(P<0.05)，即抑郁症患者肠道细菌对肠道上皮屏障的破坏作用更明显。以上结果表明，研究构建的抑郁症体外模型重现了抑郁症患者肠屏障功能的降低和肠通透性升高的生理现象。
肠道菌群结构组成的变化评估
收集健康组和抑郁组芯片(n＝7)上层通道的流出液进行16S rDNA测序，共鉴定出371个操作分类单元(OTUs)，其中每个样本间共享约190个唯一的OUTs，尽管具有不同的分布但在规模上与之前在人类肠道提取物中观察到的OTUs数量(280OTUs)相似。初步判断构建的芯片体外模型可以实现复杂肠道菌群的共培养，重现人体肠道微生物物种数目。如图6所示，对于健康组和抑郁组的α多样性分析表明，richness、ACE、Chao1和Simpson指数无显著性差异(P>0.05)。
为了研究健康组与抑郁组的群落结构差异，采用Bray_curtis距离和unifrac距离进行PCoA分析，并通过ANOSIM分析检验组间差异，结果如图7所示，不管是基于Bray_curtis距离还是unifrac距离计算得到的健康组和郁抑症组组间微生物群落的差异均具有统计学意义。LEfSe(LDA Effect Size)进一步对健康组和抑郁组的差异物种注释结果进行差异分析，如图8A所示，相比健康组，抑郁组中Streptococcace和Streptococcus(P＜0.05)丰度较高，在属水平上筛选相对丰度排名前10的细菌分类进行注释，如图8B所示，其中与健康组相比，抑郁组链球菌属相对丰度升高。图9显示抑郁组梭菌属IV簇(Clostridium_IV)相对丰度显著性降低(P＜0.05)。
体外模型的免疫反应和神经递质表征
利用ELISA实验分析免疫标记物表征抑郁症肠道体外模型的免疫反应，比较健康组和抑郁组两组芯片上、下层流出液，如图10所示，抑郁症肠道菌群与细胞作用后，IL-8的极化分泌增加，使得上皮细胞分泌(下层通道)的IL-8水平显著高于健康组(P<0.05)；而其他细胞因子的分泌几乎不变，结果无统计学意义。在神经递质的测试中，检测到芯片下层通道抑郁组与健康组流出物中5-HT水平的变化，如11B所示，抑郁组5-HT含量显著性降低(P<0.05)。
体外模型的代谢组学分析
对共培养过程中收集的上、下层流出物进行非靶向代谢组学分析(n＝7)，比较抑郁组与健康组肠道菌群与肠上皮细胞间的相互作用。PCA分析如图12A、D所示，组内样本在主成分空间中分布较为密集，代谢组成分比较相似；而两组样本间置信椭圆明显分离，几乎无重叠，具有显著的差异性。OPLS-DA统计模型结果如图12B、E所示，两组间样品分布在不同区域，显示出代谢模式差异，且模型可靠。对OPLS-DA模型的置换检验显示出模型的有效性和统计显著性，如图12C、F所示，Q2Y拟合回归线斜率为正，说明模型有意义，蓝点普遍位于红点上方说明建模训练集和测试集的独立性较好。以上结果表明不同组肠道菌群与肠上皮细胞间相互作用会对芯片上、下层流出液代谢物产生显著影响。
基于OPLS-DA模型的VIP值和单因素t检验P值选择差异代谢物，如图13所示，最终于健康组与抑郁组在芯片上层流出液筛选出194种差异代谢物、芯片下层流出液筛选出127种差异代谢物。其中芯片上层流出液中，抑郁组相比于健康组有41种代谢物显著下调，153种代谢物显著上调；芯片下层流出液中，抑郁组相比于健康组有58种代谢物显著下调，69种代谢物显著上调。图14、15分别展示芯片上下层流出液差异代谢物中上调及下调差异倍数前10的代谢物质。图16-19分别展示了芯片上下层通道流出液差异代谢物富集分析排名前20的富集通路及KEGG富集点图。
MGB轴微流控芯片的组装
模拟体内MGB轴信号传导过程的仿生微流控芯片系统包含肠道单元、BBB流入单元、大脑单元及BBB外排单元，如图20所示，将它们依次连接可研究肠道菌群与大脑神经中枢的分子互作机制。该模型示意了构建MGB轴微流控芯片抑郁模型的最终呈现效果。
神经血管单元(NVU)微流控芯片的搭建及功能表征
芯片的结构及制作同肠道芯片，如图2所示。
构建NVU微流控芯片所用的细胞为人脑微血管内皮细胞hCMEC-D3和星形胶质细胞U-87MG，体外培养如图21所示，经胰酶消化和培养基重悬后均制成5×106cells/ml密度的单细胞悬液。芯片经消毒处理后，上通道接种hCMEC-D3细胞，下通道接种U-87MG细胞。细胞接种后于培养箱静置12h促进细胞贴壁，再将芯片与流路系统连接动态培养3天，上下通道分别灌注内皮细胞完全培养基与星形胶质细胞培养基。分别对上通道hCMEC-D3细胞的紧密连接蛋白ZO-1和下通道U-87MG细胞的胶质纤维酸性蛋白GFAP及细胞核进行免疫荧光染色，通过共聚焦荧光显微镜观察细胞在芯片上的生长情况，评价NVU芯片上内皮层形成的紧密完整度，如图22所示。镜下观察到内皮细胞间紧密连接，蛋白ZO-1有较好的表达。内皮细胞在芯片中形成了紧密完整的屏障；星形胶质细胞在芯片中附着于多孔膜上且生长状态良好，通过GFAP蛋白染色观察到细胞呈现星形形态，两种细胞可通过多孔膜实现细胞间相互作用。
甘露特钠(GV-971)对微生物-肠-脑轴微流控芯片抑郁模型的用药实施效果
微生物-肠-脑轴微流控芯片抑郁模型构建后，为了探究GV-971在肠道微环境中与抑郁患者肠道菌群的相互作用，对肠道芯片的上、下流出液取样分别进行16S rDNA的菌群测序分析和代谢物检测分析。甘露特钠对抑郁患者肠道菌群的影响结果如图23所示。图23A和B显示，GV-971并未对抑郁患者的整体肠道菌群结构产生显著影响，而火山图23C显示加入GV-971显著降低了Endozoicomonas、Clostridium_sensu_stricto和Ligilactobacillus属的丰度。根据代谢物检测分析，经GV-971用药的肠道菌群与对照组相比，有38种代谢物质存在显著差异，如图24所示，25种代谢物表达上调，13种代谢物表达下调。其中代表性的甘氨酸、咖啡因、多巴胺含量的变化可能与抑郁患者的神经活动改变有紧密联系。
对NVU芯片的下通道流出液取样进行代谢物检测分析，表征GV-971组与对照组肠道菌群差异代谢物对血脑屏障(BBB)的通透性。如图25所示，在38种差异代谢物中，有3种物质显著不能透过BBB，有11种代谢物较容易透过。神经活性物质甘氨酸、咖啡因、多巴胺均显示可以透过BBB，推测这三种物质经GV-971作用抑郁患者肠道菌群后，在血液中的水平上调并顺利通过BBB进入中枢神经系统，最终可能影响抑郁患者的神经活动和病理发生发展。但还需要进一步开展更多的实验进行验证。
为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：芯片使用前进行消毒处理，随后向芯片上下层通道灌注含20％胎牛血清的DMEM培养基1-3h，以去除芯片通道中的气泡，将芯片移入培养箱中，灌注0.5-1.5h以平衡芯片,向上层微通道注入ECM混合物,将芯片放置于二氧化碳培养箱中静置2-3h,再向上通道注入细胞培养基1-2h，以清除困在微通道内的气泡并冲洗未涂覆的ECM基质；
S2:细胞培养基重悬Caco-2细胞制成细胞密度为1.2×107cells/mL的单细胞悬液，用吸取约400-600μL单细胞悬液经注射泵注入芯片上层通道，显微镜观察确认细胞是否均匀分散；将芯片置于二氧化碳培养箱中静置孵育过夜,使得细胞沉降，贴附于ECM涂层的多孔膜上方；再向上、下层通道灌注细胞培养基，细胞培养4天可生长分化形成紧密连接的单层肠上皮屏障，并产生粘液层；
S3：向上下层通道注入不含抗生素的细胞培养基11-13h，将原始肠道菌群接种,离心获得细菌沉淀，PBS清洗两次，再经曝气除氧的肠道菌群培养基重悬，向肠道芯片上层通道注入40-60μL细菌悬液，于培养箱静置1-2h使菌群沉降；
S4：将无氧肠道菌群培养基持续灌注进上层通道中，芯片下层以相同速度灌注含氧细胞培养基，持续48h，从而构建抑郁症肠道体外模型；
S5：将肠道单元、BBB流入单元、大脑单元及BBB外排单元依次连接组建能够模拟体内MGB轴信号传导过程的仿生微流控芯片系统，将MGB轴系统中的肠道单元替换为上述构建的抑郁症的肠道体外模型，以相同的方式将他们进行连接、组装，基于MGB轴微流控芯片实现抑郁模型的体外构建；
S6：招募符合相应条件的志愿患者，获取他们的新鲜粪便样本并收集到足够的原始肠道菌群接种物，针对其它与肠道菌群有关的神经精神类疾病的MGB轴微流控芯片模型进行构建。
2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述S1中消毒处理为乙醇冲洗和/或紫外线照射。
3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述S1中DMEM培养基的灌注流速为800μL/min，芯片移入培养箱后降低流速至180-220μL/h，向上通道注入细胞培养基的灌注速率为200μL/h。
4.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述ECM混合物为高糖DMEM培养基配置的100μg/mL鼠尾I型胶原蛋白和300μg/mL Matrigel基质胶混合而成。
5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述S2中向上、下层通道灌注细胞培养基的灌注速率为100μL/h。
6.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述S3中向上下层通道注入不含抗生素的细胞培养基的灌注速率为100μL/h。
7.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述S4中将无氧肠道菌群培养基持续灌注进上层通道中的灌注速率为100μL/h。
8.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述原始肠道菌群的制备方法为采集每名志愿者的晨起新鲜粪便各5g左右于无菌、无氧PBS缓冲液中，采集过程3分钟内完成，后立即在厌氧工作站中使用涡旋振荡器充分混匀，制成质量分数20％的匀浆悬液。用四层无菌纱布滤去残渣，收集滤液，即为原始肠道菌群接种物；然后将滤液与40％甘油以1:1混合，等分保存在2mL Eppendorf管中，储存在-20℃冰箱备用。
9.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述无氧肠道菌群培养基配置如下：
血红素0.005g，维生素K1 0.5μL，黏蛋白1g，果胶1g，20％FBS+1％谷氨酰胺高糖DMEM培养基1L；
培养基配制后，进行高压灭菌及曝气除氧，每试管倒入5mL培养基，吸取50μL原始菌液至试管中。于37℃、200rpm的厌氧工作站中振荡培养。
10.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抑郁样体外模型构建方法，其特征在于，所述芯片为微流控芯片，制作方法如下：
制备芯片SU-8光刻胶膜具：清洗硅片后进行光刻胶涂布，使用真空泵和光刻机进行紫外曝光，中烘冷却后显影，再以后烘增加光刻胶与硅片的粘附强度，最后于硅片上滴加三滴三甲基氯硅烷以对硅片表面进行疏水修饰，保证后续PDMS块脱模方便；
制备PDMS芯片：将PDMS聚合体与固化剂以10:1的比例配制，搅拌混合后倒入芯片模具，抽真空2h排尽气泡，放入80℃电热恒温鼓风干燥箱使PDMS交联固化，再用美工刀切割PDMS完成脱模及尺寸修整，最后根据通道设计进行打孔和利用等离子体上下键合；键合好的芯片放入65℃电热恒温鼓风干燥箱2h进行不可逆结合，得到芯片实物。
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