CN117720502A - 化合物增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤力的用途、培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤力的用途、培养基。穿孔素、颗粒酶B是NK细胞发挥对肿瘤细胞杀伤力的关键蛋白，化合物Torgranol B可以有效促进NK细胞中穿孔素、颗粒酶B的表达，同时以乳腺癌细胞为例进一步证明了化合物Torgranol B可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。因此，化合物Torgranol B可以用于制备提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的培养基。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞领域，涉及化合物增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤力的用途、培养基。
背景技术
肿瘤的发生是体内细胞在遗传和环境因素作用下，基因结构与功能稳态失衡诱发细胞异常增殖的结果。异常增殖的肿瘤细胞与为其提供营养支持的基质细胞和肿瘤浸润性免疫细胞等共同构成了肿瘤微环境。肿瘤细胞可以通过下调主要组织相容性复合体分子表达水平，上调免疫检查点分子表达等免疫逃逸机制抑制肿瘤微环境中免疫细胞的抗肿瘤免疫反应，进而促进肿瘤的发生发展。因此，肿瘤免疫治疗是通过改变抑制性肿瘤微环境，恢复机体免疫系统活性，清除肿瘤细胞的一种治疗方法。其中，基于自然杀伤细胞(naturalkiller cells，简称NK细胞)的细胞疗法表现出较好的肿瘤免疫治疗应用前景。
NK细胞约占外周血淋巴细胞的10％～15％，主要来源于骨髓中的造血干细胞，由NK前体细胞发育分化而来，是肿瘤免疫微环境中的重要效应细胞。NK细胞是抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的主要效应细胞，对清除肿瘤细胞、控制细菌和病毒感染具有重要作用。ADCC作用的主要机制是通过IgG的抗原结合片段与靶细胞的表面特异性抗原结合，可结晶段(Fc)通过Fc受体与NK细胞结合，继而活化NK细胞，活化的NK细胞通过释放穿孔素、颗粒酶，产生细胞因子杀伤靶细胞。
因此，如何在体外获得对肿瘤细胞具有更高杀伤力的NK细胞对基于NK细胞的过继疗法至关重要。目前，常用的方法包括在NK细胞体外培养过程使用细胞因子、化合物等刺激。
化合物Torgranol B是发明人林伟先前从香榧枝叶中分离得到的一种结构新颖的天然产物(Antimicrobial abietane-type diterpenoids fromTorreya grandis，Phytochemistry，2022)，分子式为C21H32O4，其化学结构如下：
发明人在活性筛选试验中发现Torgranol B对过继疗法的一些积极作用，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供化合物增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤力的用途、培养基。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种化合物Torgranol B，化学结构式如下：
化合物Torgranol B用于免疫细胞体外培养增强其杀伤力的用途，免疫细胞为NK细胞。
化合物Torgranol B用于制备增强免疫细胞杀伤力的培养基的用途，免疫细胞为NK细胞。
化合物Torgranol B用于制备增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤力的培养基的用途，所述免疫细胞为NK细胞。
化合物Torgranol B用于制备增强免疫细胞对乳腺癌细胞杀伤力的培养基的用途，所述免疫细胞为NK细胞。
有益效果：
穿孔素、颗粒酶B是NK细胞发挥对肿瘤细胞杀伤力的关键蛋白，化合物TorgranolB可以有效促进NK细胞中穿孔素、颗粒酶B的表达，同时以乳腺癌细胞为例进一步证明了化合物Torgranol B可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
附图说明
图1为化合物Torgranol B的核磁共振氢谱图(CDCl3)；
图2为化合物Torgranol B的核磁共振碳谱图(CDCl3)；
图3为NK细胞中杀伤力关键蛋白穿孔素、颗粒酶B的Westernblot测定图。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
Torgranol B自制，具体见发明人发表的文献(Antimicrobial abietane-typediterpenoids from Torreya grandis，Phytochemistry，2022)，图1、图2分别为TorgranolB氢谱、碳谱图。
淋巴细胞分离液购自索莱宝；NK细胞培养基购自CellGro SCGM；rhIL-2购自特宝生物。
乳腺癌MCF-7细胞购自ATCC；FBS、双抗、DMEM培养基、CCK8试剂购自碧云天。
穿孔素、颗粒酶B、β-actin一抗购自Santa Cruz，其它Westernblot试剂购自碧云天。
二、实验方法
1、NK细胞的培养
取100mL健康献血者外周抗凝血，先用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(取少量用流式细胞仪检测CD3－CD56+表型比例)，再用含500U/mLrhIL-2的NK细胞培养基重悬单个核细胞(2×105/mL)，接种于培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3d半量换液，每次换液时调整细胞数量至5×104/mL。
培养14d后，收集细胞，用流式细胞仪检测CD3－CD56+表型比例。
2、肿瘤细胞的培养
将乳腺癌MCF-7细胞复苏，用含10％FBS、1％青链霉素的DMEM培养基重悬，接种于培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔2d换液1次，生长至85％左右时传代。
3、CCK-8法测定不同孵育处理的NK细胞的细胞活力
将NK细胞接种于96孔板中(5×104/mL)，每孔100μL，分为对照组、低浓度孵育组和高浓度孵育组，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h后，低浓度孵育组、高浓度孵育组分别更换为含有5μM、10μM Torgranol B的DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)，对照组更换为DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)，孵育48h，各孔加入10μL CCK8试剂，继续培养4h后，在酶标仪上测定各孔OD450值，以对照组细胞活力为100％，根据公式计算低浓度孵育组、高浓度孵育组NK细胞的细胞活力：
细胞活力＝孵育组OD值/对照组OD值×100％。
4、Westernblot法测定不同孵育处理的NK细胞中杀伤力关键蛋白表达水平
将NK细胞接种于培养皿中(1×105/mL)，分为对照组、低浓度孵育组和高浓度孵育组，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h后，低浓度孵育组、高浓度孵育组分别更换为含有5μM、10μM Torgranol B的DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)，对照组更换为DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)，孵育48h，收集细胞，用Western blot法测定NK细胞中颗粒酶B、穿孔素表达水平，具体方法为：用细胞裂解液裂解细胞，离心收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，取50μg蛋白上样，经10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉的封闭液中室温封闭2h，分别加入穿孔素、颗粒酶B、β-actin(内参)一抗，4℃过夜，洗膜，加入二抗室温孵育1h，ECL法显色、曝光，拍照分析。
5、CCK-8法测定不同孵育处理的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力
将NK细胞接种于培养皿中(1×105/mL)，分为对照组、低浓度孵育组和高浓度孵育组，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h后，低浓度孵育组、高浓度孵育组分别更换为含有5μM、10μM Torgranol B的DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)，对照组更换为DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)，孵育48h。
收集孵育处理的NK细胞，PBS洗涤，用DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)制成2×106/mL的细胞悬液，作为效应细胞；取对数生长期的MCF-7细胞，用DMEM培养基(含10％FBS、1％青链霉素)制成2×105/mL的细胞悬液，作为靶细胞。分别取效应细胞悬液和靶细胞悬液各100μL(效靶比10:1)接种于96孔培养板，同时设单独效应细胞孔和单独靶细胞孔，每组5个复孔，在37℃、5％CO2条件下培养12h，各孔加入20μL CCK8试剂，继续培养4h后，在酶标仪上测定各孔OD450值，根据公式计算各组NK细胞对MCF-7细胞的杀伤率：杀伤率＝[1-(实验组OD值-单独效应细胞组OD值)/单独靶细胞OD值]×100％。
6、统计学处理
采用SPSS17.0统计软件包处理数据，用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、NK细胞培养结果
NK细胞为CD3－CD56+表型细胞，流式细胞仪检测显示CD3－CD56+表型细胞比例从单个核细胞中的5.37％提高到培养14d后的86.49％，说明NK细胞培养获得预期效果。
2、不同孵育处理的NK细胞的细胞活力
0μM(对照组)、5μM、10μM Torgranol B孵育48h后的细胞活力如表1所示，各组无明显差异，说明5μM、10μM Torgranol B对NK细胞无明显细胞毒性。
表1各组NK细胞的细胞活力
| 细胞活力 | |
| 0μM | 100％ |
| 5μM | (98.69±1.55)％ |
| 10μM | (99.25±1.83)％ |
3、不同孵育处理的NK细胞中杀伤力关键蛋白表达水平
0μM(对照组)、5μM、10μM Torgranol B孵育48h后的穿孔素、颗粒酶B表达水平如图3所示，不同浓度Torgranol B孵育48h后均明显促进了NK细胞中杀伤力关键蛋白穿孔素、颗粒酶B的表达。
4、不同孵育处理的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力
0μM(对照组)、5μM、10μM Torgranol B孵育48h后的NK细胞对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤力如表2所示，不同浓度Torgranol B孵育48h后均明显增强了NK细胞对MCF-7细胞的杀伤力。
表2各组NK细胞对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤力
| 杀伤率 | |
| 0μM | (35.82±2.77)％ |
| 5μM | (49.65±2.36)％ |
| 10μM | (73.18±2.59)％ |
由此可见，Torgranol B用于NK细胞体外培养时可以有效增强其杀伤力。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (5)
1.一种化合物Torgranol B，化学结构式如下：
2.权利要求1所述的化合物Torgranol B用于免疫细胞体外培养增强其杀伤力的用途，所述免疫细胞为NK细胞。
3.权利要求1所述的化合物Torgranol B用于制备增强免疫细胞杀伤力的培养基的用途，所述免疫细胞为NK细胞。
4.权利要求1所述的化合物Torgranol B用于制备增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤力的培养基的用途，所述免疫细胞为NK细胞。
5.权利要求1所述的化合物Torgranol B用于制备增强免疫细胞对乳腺癌细胞杀伤力的培养基的用途，所述免疫细胞为NK细胞。
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