CN117705963A - 一种2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种2,4‑二氟硝基苯中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件中选择包含三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱，在梯度洗脱过程中，控制流动相中洗脱的时间和流动相的比例，检出的杂质多、灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、2,4‑二氟硝基苯主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，对所研究的杂质均能有效分离，能快速、有效、准确的监控2,4‑二氟硝基苯中的有关物质。

Description

一种2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法。
背景技术
2,4-二氟硝基苯(2,4-Difluoro-1-nitrobenzene)，其分子式为C6H3F2NO2，分子量为159.09，其结构式如下：
2,4-二氟硝基苯(2,4-Difluoro-1-nitrobenzene)是一种医药中间体，是药物氟比洛芬中间体，也用作农药、液晶材料中间体。储存于阴凉、通风的库房。应与氧化剂、食用化学品分开存放，切忌混储。保持容器密封。远离火种、热源。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，该方法灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、2,4-二氟硝基苯主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，对研究杂质均能有效分离，能快速、有效、准确的监控2,4-二氟硝基苯中的有关物质。
本发明的技术方案如下：
一种2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法对2,4-二氟硝基苯中有关物质进行定量检测，色谱条件包括：
色谱柱为：Waters Ultimate PFP或Waters xselect Hss PFP；
流动相：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；其中，所述流动相A为包含三氟乙酸的水的混合溶液；所述流动相B为包含三氟乙酸的乙腈混合溶液；
梯度洗脱过程如下：
(1)在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；
(2)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；
(3)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变；
(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至70:30；
(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变。
具体的梯度洗脱过程如下表1所示：
表1梯度洗脱过程
本发明通过筛选合适流动相进行梯度洗脱；选择包含三氟乙酸的水混合溶液和包含三氟乙酸的乙腈混合溶液作为混合流动相进行梯度洗脱，三氟乙酸作为离子对试剂能更好的分离带有苯胺的化合物，同时与多肽相互作用，从而增强分离效果。在梯度洗脱的过程中，控制流动相中三氟乙酸的含量为0.02-0.08％，在其他条件配合下，各杂质峰之间、主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，即可快速、有效、准确监控2,4-二氟硝基苯中的有关物质。
在一种优选方案中，流动相A为包含0.02～0.08％三氟乙酸的水混合溶液，更优选的，流动相A为0.04-0.06％三氟乙酸-水溶液，进一步优选的，流动相A为包含0.05％三氟乙酸-水混合溶液。
在一种优选方案中，流动相B为包含0.02～0.08％三氟乙酸的乙腈混合溶液，更优选的，流动相B为0.04-0.06％三氟乙酸-乙腈溶液，更优选的，流动相B为包含0.05％三氟乙酸-乙腈混合溶液。
对本发明而言，色谱柱的选择极其重要，在一种优选方案中，选择Ultimate PFP或Waters xselect Hss PFP，Ultimate PFP的分离效果更佳，采用本发明的色谱柱和特定的洗脱过程，在其他条件的配合下，测出的杂质多、灵敏度高，专属性好，各杂质峰之间、2,4-二氟硝基苯主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，能快速、有效、准确的监控2,4-二氟硝基苯中的有关物质。更优选的色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm或3.5μm。
本发明提供的溶解待测样品所用的溶剂为乙腈。尝试过水与乙腈混合，但溶解效果并没有纯乙腈好。
对于本发明而言柱温选择20-45℃，具体柱温可以但不局限于25℃、35℃、40℃、45℃为了获得更好的分离效果，优选柱温为25-35℃，更优选为30℃。在其他条件的配合下，测出的杂质多、灵敏度高，专属性好，各杂质峰之间、2,4-二氟硝基苯主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，能快速、有效、准确的监控2,4-二氟硝基苯中的有关物质。
进一步地，色谱条件包括：检测波长为220～270nm，优选为230～250nm，优选为240nm。
进一步地，流速为0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min。
进一步地，色谱条件包括：进样量为5-30μl，可以但不局限于5μl、10μl、15μl、20μl、30μl，优选为5μl。
本发明提及的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，所述有关物质包括：
本发明采用高效液相色谱法，分别从色谱条件等方面进行筛选、优化，拟定有关物质的检测方法，进行方法学验证，对4-硝基间苯二酚、3-氟-4-硝基苯酚、5-氟-2-硝基苯酚、2,5-二氟硝基苯、3,4-二氟硝基苯、2-氟-4-氯苯甲腈、2,6-二氟硝基苯、4-氯-2-氟硝基苯、2-氯-4-氟硝基苯、2,4-二氯硝基苯进行了定量研究，并提供完整的验证方案，操作简单，稳定性和重现性良好。其中，杂质的校正因子为：4-硝基间苯二酚为0.94、3-氟-4-硝基苯酚为1.11、5-氟-2-硝基苯酚为1.51、2,5-二氟硝基苯为0.80、3,4-二氟硝基苯为1.23、2-氟-4-氯苯甲腈为0.21、2,6-二氟硝基苯为0.98、4-氯-2-氟硝基苯为1.27、2-氯-4-氟硝基苯为1.39、2,4-二氯硝基苯为1.21。
本发明提供的检测方法的具体步骤为：分别配制供试品溶液、对照溶液、混合杂质定位溶液并进样，通过加校正因子的主成分自身对照法进行杂质含量检测。
供试品溶液：取2,4-二氟硝基苯适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg2,4-二氟硝基苯的溶液。
对照品溶液：1％供试品溶液。
混合杂质定位溶液：精密称取各杂质各100mg，分别置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的各杂质储备液，精密移取各杂质储备液1ml于20ml量瓶中，另精密称取2,4-二氟硝基苯200mg于该量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯10mg的混合杂质溶液。
本发明提供的检测方法，在配制上述溶液时，所选择溶解样品的溶剂为乙腈。
本发明通过筛选合适的流动相并优化流动相中各组分比例，选择合适的供试品溶剂、杂质定位用溶剂，筛选合适的其他色谱条件，对2,4-二氟硝基苯及有关杂质进行色谱分析，确定了本发明的分析方法，进行了专属性、重复性、精密度、准确的、线性范围、校正因子、耐用性验证，确证方法的可行性。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，通过筛选合适的色谱柱和柱温，以及包含三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱，优化洗脱的时间和流动相的比例，使得检出的杂质多、灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、2,4-二氟硝基苯主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，对研究杂质均能有效分离，能快速、有效、准确的监控2,4-二氟硝基苯中的有关物质。
附图说明
图1是杂质及2,4-二氟硝基苯定位溶液的高效液相色谱图；
图2是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；
图3是2,4-二氟硝基苯及其各杂质的线性图；
图4是对比例1中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图5是对比例2中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图6是对比例3中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图7是对比例4中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图8是对比例5中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图9是对比例6中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图10是实施例2中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图11实施例3中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.05％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；(2)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；(3)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变。(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至70:30；(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变。
样品配制：
称取2,4-二氟硝基苯供试品适量，加适量乙腈使溶解制成每1ml中约含2,4-二氟硝基苯10mg的溶液，作为供试品溶液。
试验操作：取供试品溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图2。
取2,4-二氟硝基苯样品配制供试品溶液，进样并记录色谱图，以主成分自身对照法计算供试品中杂质的含量，结果见表1。
表1 2,4-二氟硝基苯中主要杂质的含量测定结果
杂质 5-氟-2硝基苯酚 2,6-二氟硝基苯 其他最大单杂 总杂
含量(％) 0.06 0.16 0.03 0.25
由表1和图2可以看出，2,4-二氟硝基苯供试品中检出已知杂质5-氟-2硝基苯酚和2,6-二氟硝基苯，其他最大单杂为0.03％，总杂为0.25％。杂质个数为3个。
本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，对2,4-二氟硝基苯以及10个杂质进行色谱检测，确定了本发明实施例1的检测方法。
对该有关物质检测方法进行验证，如下：
1、专属性
通过对各杂质和2,4-二氟硝基苯的峰定位试验，干扰试验对本发明进行专属性验证。
杂质及2,4-二氟硝基苯定位溶液的配制：取各杂质和2,4-二氟硝基苯样品，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质100μg和2,4-二氟硝基苯10mg的溶液，作为杂质及2,4-二氟硝基苯的定位溶液。
取杂质和2,4-二氟硝基苯定位溶液，按实施例1中的高效液相色谱条件和方法进行检测，结果见表2和图1。
表2专属性验证结果
结论：由表2和图1可以看出，主成分色谱峰与相邻峰的分离度大于1.5，已知组分与相邻色谱峰之间的最小分离度均大于1.2。说明本发明的专属性好。
2、检测限定量限
供试品溶液：称取2,4-二氟硝基苯供试品适量，加适量乙腈使溶解并制成每1ml中约含2,4-二氟硝基苯10mg。
各杂质储备液：分别称取各个杂质适量，加适量乙腈使溶解并制成每1ml中约含各个杂质1mg的溶液。
2,4二氟硝基苯储备溶液：移取供试品溶液适量，加适量乙腈稀释制成每1ml中约含2,4-二氟硝基苯1mg。
LOQ储备溶液：向100ml量瓶中，加入适量乙腈，移取2,4二氟硝基苯储备溶液2.5ml，2,6-二氟硝基苯储备溶液5ml，3,4-二氟硝基苯储备溶液5ml，2,5-二氟硝基苯储备溶液2.5ml，3-氟-4-硝基苯酚储备溶液2.5ml，5-氟2-硝基苯酚储备溶液5ml，2-氟-4-氯苯甲腈储备溶液1ml，4-氯-2-氟硝基苯储备溶液10ml，2-氯-4氟硝基苯储备溶液10ml，2,4-二氯硝基苯储备溶液1ml和4-硝基间苯二酚储备溶液2ml，用乙腈稀释并定容至刻度，混匀，即得。
LOQ溶液：精密移取LOQ储备溶液1ml，置50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，混匀，即得。
LOD溶液：精密移取LOQ溶液1ml，置10ml量瓶中，再加入稀释剂2ml，摇匀，即得。
取LOQ溶液及LOD溶液5μl，进样分析，以信噪比S/N≈3、S/N≈10分别测定检测限及定量限。结果见表3及表4。
表3 2,4-二氟硝基苯及各杂质定量限及检测限结果
表4定量限精密度结果
结论：从表3及表4可以看出，在本品有关物质浓度及色谱条件下，主成分及各已知杂质的定量限均在供试品浓度的0.05％(0.05μg/ml)以下，检测限均在供试品浓度的0.015％(0.015μg/ml)以下，检测灵敏度高，供试品溶液浓度选择合理，采用上述色谱条件可有效地检出上述杂质。定量限6次进样保留时间RSD均小于1.0％，峰面积RSD均小于15.0％，精密度良好。
3、线性
供试品溶液：按照“2、定量限检测限”配制供试品溶液。
各杂质储备液：按照“2、定量限检测限”配制各杂质储备液。
线性储备溶液：移取供试品溶液及各杂质储备液适量，加乙腈稀释制成每1ml中约含有2,4-二氟硝基苯和2,6-二氟硝基苯约为0.25mg，其他各杂质均约含0.1mg。
线性溶液：精密量取线性储备溶液2.5ml、1ml、1ml、1.5ml、2ml分别置100ml、20ml、10ml、10ml、10ml，作为线性25％、50％、100％、150％、200％的溶液。
LOQ溶液：使用“2、定量限检测限”所配的LOQ溶液。
取LOQ溶液及各浓度线性溶液5μl进行进样分析，设进样浓度(μg/ml)为横坐标(X轴)，峰面积为纵坐标(Y轴)，2,4-二氟硝基苯及杂质的线性范围及线性方程见表5。
表5 2,4-二氟硝基苯及杂质的线性范围及线性方程
结论：由上述试验结果可看出：2,4-二氟硝基苯及各个杂质在一定范围内均呈良好的线性，各线性回归系数均大于0.999，Y轴截距偏差均在25％以内。
4、校正因子测定
同线性项下配制一系列线性水平浓度的溶液，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程。以2,4-二氟硝基苯回归方程的斜率与杂质的回归方程的斜率之比作为校正因子，在不同时间、不同仪器，由不同人员进行测定。测定结果见表6。
表6校正因子测试结果
结论：由以上结果可知，4-硝基间苯二酚、3-氟-4-硝基苯酚、5-氟-2-硝基苯酚、2,5-二氟硝基苯、3,4-二氟硝基苯、2-氟-4-氯苯甲腈、2,6-二氟硝基苯、4-氯-2-氟硝基苯、2-氯-4-氟硝基苯、2,4-二氯硝基苯的校正因子分别为0.94、1.11、1.51、0.80、1.23、0.21、0.98、1.27、1.39、1.21，其中，4-硝基间苯二酚和2,6-二氟硝基苯不需按照上表得出的校正因子带入计算，其他杂质校正因子不在0.9～1.1之间，需带入校正因子计算。
5、准确度
供试品溶液：按照“2、定量限检测限”配制供试品溶液。
对照混合溶液：采用线性溶液中100％水平线性溶液。
各杂质储备溶液：按照“2、定量限检测限”配制各杂质储备液。
准确度储备溶液：向50ml量瓶中，加入适量溶剂，移取2,6-二氟硝基苯储备溶液2.5ml，3,4-二氟硝基苯储备溶液1ml，2,5-二氟硝基苯储备溶液1ml，3-氟-4-硝基苯酚储备溶液1ml，5-氟2-硝基苯酚储备溶液1ml，2-氟-4-氯苯甲腈储备溶液1ml，4-氯-2-氟硝基苯储备溶液1ml，2-氯-4氟硝基苯储备溶液1ml，2,4-二氯硝基苯储备溶液1ml和4-硝基间苯二酚储备溶液1ml，用溶剂稀释并定容至刻度，混匀，即得。(混合溶液中含有2,4-二氟硝基苯和2,6-二氟硝基苯的浓度均约为0.25mg/mL，其他各杂质浓度均约为0.1mg/mL)
50％水平准确度溶液：向20ml量瓶中，加入适量溶剂，精密称取2,4-二氟硝基苯100mg，精密移取准确度储备溶液1ml于该量瓶中，用溶剂稀释并定容至刻度，混匀，即得。(混合溶液中含有2,4-二氟硝基苯5mg/ml，2,6-二氟硝基苯的浓度均约为0.0125mg/mL，其他各杂质浓度均约为0.005mg/mL)，平行配制三份。
100％水平准确度溶液：向20ml量瓶中，加入适量稀释剂，精密称取2,4-二氟硝基苯100mg，精密移取准确度储备溶液2ml于该量瓶中，用稀释剂稀释并定容至刻度，混匀，即得。(混合溶液中含有2,4-二氟硝基苯5mg/ml，2,6-二氟硝基苯的浓度均约为0.025mg/mL，其他各杂质浓度均约为0.01mg/mL)，平行配制三份。
200％水平准确度溶液：向20ml量瓶中，加入适量稀释剂，精密称取2,4-二氟硝基苯100mg，精密移取准确度储备溶液4ml于该量瓶中，用稀释剂稀释并定容至刻度，混匀，即得。(混合溶液中含有2,4-二氟硝基苯5mg/ml，2,6-二氟硝基苯的浓度均约为0.05mg/mL，其他各杂质浓度均约为0.02mg/mL)，平行配制三份。
取对照混合溶液、供试品溶液及各准确度溶液5μl进行进样分析，进行回收率测定，结果统计见表7～表16。
表7 2,4-二氟硝基苯杂质4-硝基间苯二酚有关物质准确度试验结果
表8 2,4-二氟硝基苯杂质3-氟-4-硝基苯酚有关物质准确度试验结果
表9 2,4-二氟硝基苯杂质5-氟-2-硝基苯酚有关物质准确度试验结果
表10 2,4-二氟硝基苯杂质2,5-二氟硝基苯有关物质准确度试验结果
表11 2,4-二氟硝基苯杂质3,4-二氟硝基苯有关物质准确度试验结果
表12 2,4-二氟硝基苯杂质2-氟-4-氯苯甲腈有关物质准确度试验结果
表13 2,4-二氟硝基苯杂质2,6-二氟硝基苯有关物质准确度试验结果
表14 2,4-二氟硝基苯杂质4-氯-2-氟硝基苯有关物质准确度试验结果
表15 2,4-二氟硝基苯杂质2-氯-4-氟硝基苯有关物质准确度试验结果
表16 2,4-二氟硝基苯杂质2,4-二氯硝基苯有关物质准确度试验结果
结论：各浓度水平的平均回收率范围为98.6％～102.4％，符合预设标准应在80.0％～120.0％；9个加样回收率的RSD最大为2.38％，符合预设标准RSD应≤10.0％。
6、精密度
6.1进样精密度
对照混合溶液：按照“线性溶液”中100％水平线性溶液配制。
取对照混合溶液5μl连续进样6针进行进样分析，进样精密度测试结果见表17、表18。
表17进样精密度测试结果(保留时间)
名称 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD(％)
4-硝基间苯二酚 11.966 11.970 11.967 11.968 11.964 11.965 11.967 0.02％
3-氟-4-硝基苯酚 15.256 15.260 15.258 15.257 15.254 15.253 15.256 0.02％
5-氟-2-硝基苯酚 18.853 18.858 18.855 18.855 18.852 18.853 18.854 0.02％
2,4-二氟硝基苯 22.700 22.706 22.700 22.702 22.698 22.698 22.701 0.02％
2,5-二氟硝基苯 24.202 24.210 24.202 24.203 24.201 24.199 24.203 0.02％
3,4-二氟硝基苯 25.623 25.631 25.621 25.623 25.623 25.619 25.623 0.02％
2-氟-4-氯苯甲腈 29.007 29.011 29.001 29.000 29.003 28.999 29.004 0.02％
2,6-二氟硝基苯 30.430 30.434 30.422 30.420 30.423 30.420 30.425 0.02％
4-氯-2-氟硝基苯 34.087 34.093 34.081 34.077 34.078 34.081 34.083 0.02％
2-氯-4-氟硝基苯 35.451 35.460 35.444 35.442 35.445 35.446 35.448 0.02％
2,4-二氯硝基苯 43.226 43.229 43.225 43.225 43.223 43.266 43.232 0.04％
表18进样精密度测试结果(峰面积)
名称 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD(％)
4-硝基间苯二酚 167.585 170.057 167.111 167.979 166.861 167.181 167.796 0.71％
3-氟-4-硝基苯酚 138.08 140.062 138.151 138.567 137.255 137.324 138.240 0.75％
5-氟-2-硝基苯酚 101.957 103.093 101.762 101.962 102.320 102.071 102.194 0.47％
2,4-二氟硝基苯 399.035 404.899 397.913 400.209 398.936 397.702 399.782 0.67％
2,5-二氟硝基苯 201.942 205.322 202.058 203.353 202.318 201.391 202.731 0.71％
3,4-二氟硝基苯 123.155 125.581 123.837 124.872 123.941 123.685 124.179 0.72％
2-氟-4-氯苯甲腈 718.377 728.155 715.808 719.75 716.110 715.106 718.884 0.68％
2,6-二氟硝基苯 374.594 379.135 373.205 374.961 373.886 371.943 374.621 0.66％
4-氯-2-氟硝基苯 122.859 124.852 124.685 123.553 121.927 122.434 123.385 0.98％
2-氯-4-氟硝基苯 116.709 118.508 117.562 117.454 116.362 115.842 117.073 0.82％
2,4-二氯硝基苯 129.969 131.649 129.406 130.196 129.624 129.451 130.049 0.65％
结论：从上述实验结果可以看出，连续进样6次对照混合溶液中各已知组分的保留时间的RSD均小于1.0％；连续进样6次对照混合溶液中各已知组分的面积的RSD均小于10.0％，进样精密度良好。
6.2重复性
准确度储备溶液：按照“5、准确度”项下准确度储备溶液配制。
重复性溶液：精密称取100mg 2,4-二氟硝基苯于20ml容量瓶(先加适量稀释剂)中，精密移取准确度储备溶液2ml于该量瓶中，加稀释剂适量使之溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含2,4-二氟硝基苯浓度约为5.0mg/ml的溶液，平行配制6份。
对照混合溶液：按照“3、线性”项下100％水平线性溶液配制。
取对照混合溶液、6份重复性溶液5μl进行进样分析，分别按加校正因子的自身对照法、外标法以峰面积计算样品溶液中各杂质的回收率。结果见表19。
表19重复性下各杂质回收率测定结果对比(加校正因子的自身对照法与外标法)
结论：以上结果表明，已知杂质采用外标法和加校正因子的自身对照法计算的结果基本一致，且RSD均小于6.0％；表明，本品有关物质样品制备方法和检测方法重复性良好。
6.3中间精密度
取本品，照“6.2重复性”项下方法(采用外标法)，由不同的分析人员使用不同的仪器在不同的时间进行检测。结果见表20。
表20中间精密度测试结果
结论：以上结果表明，由不同分析人员使用不同的仪器在不同时间进行检测，各杂质检测结果基本一致，表明本品有关物质样品制备方法和检测方法中间精密度良好。
7、耐用性
为考察本方法对条件发生微小变化时的耐受程度，进行耐用性实验。考察项目包括流动相中三氟乙酸比例、流动相初始比例、同型号不同批号色谱柱、柱温、波长、流速。考察指标为主峰与相邻峰最小分离度、杂质与相邻峰最小分离度符合系统适用性条件要求。系统适用性条件要求：主成分色谱峰与相邻峰的分离度应≥1.5，各已知杂质与相邻色谱峰之间的最小分离度均应≥1.2。结果见表21。
表21耐用性测试结果
结论：由表21可以看出当条件发生微小变化时，主成分色谱峰与相邻峰的分离度均≥1.5，各已知杂质与相邻色谱峰之间的最小分离度均≥1.2，均符合系统适用性条件要求。表明本方法耐用性良好。
对比例1
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.05％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-10分钟内，流动相A和流动相B的体积比为90:10匀速渐变至70:30；(2)在10-30分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；(3)在30-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90。(4)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变；(5)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至90:10。(6)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持90:10不变。
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图4。
由图4可知，杂质4-氯-2-氟硝基苯与2-氯-4-氟硝基苯未达到基线分离，分离度较差。
对比例2
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.05％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-30分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；(2)在30-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；(3)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变。(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至70:30；(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变。
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图5。
由图5可知，杂质4-氯-2-氟硝基苯与2-氯-4-氟硝基苯未达到基线分离，分离度不佳。显然当检测波长、流速和梯度洗脱的过程不合适时，即使是采用了相同的色谱柱、流动相以及其他合适的条件，也难以将2,4-二氟硝基苯中的有关物质都准确地检测出来。
对比例3
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.05％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持60:40不变；(2)在40-40.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至50:50；(3)在40.1-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持50:50不变。(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由50:50匀速变至10:90；(5)在50.1-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变。(6)在55-55.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速变至60:40；(7)在55.1-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持60:40不变。
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图6。
由图6可知，2-氟-4-氯苯甲腈与2,6-二氟硝基苯分离度较差；4-氯-2-氟硝基苯与2-氯-4-氟硝基苯分离度较差。
对比例4
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.05％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-15分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持50:50不变；(2)在15-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由50:50匀速渐变至10:90；(3)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积保持10:90不变。(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速变至50:50；(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持50:50不变。
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图7。
由图7可知，由于洗脱较快，各峰总体前移，且各峰分离度较差。
对比例5
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.05％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-30分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持65:35不变；(2)在30-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由65:35匀速渐变至40:60；(3)在40-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至10:90。(4)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变；(5)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持由10:90匀速变至65:35；(6)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持65:35不变。
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图8。
由图8可知，4-氯-2-氟硝基苯与2-氯-4-氟硝基苯分离度较差。
对比例6
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.05％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-30分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；(2)在30-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；(3)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变。(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至70:30；(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变。
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图9。
由图9可知，杂质2-氯-4-氟硝基苯出峰位置不易积分。
实施例2
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.04％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.04％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；(2)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；(3)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变。(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至70:30；(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变。
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图10。
由图10可知，主成分与相邻杂质以及各杂质之间均能够达到基线分离，分离度较好，与实施例1中分离度相当。
实施例3
高效液相色谱条件：用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Ultimate PFP，4.6mm×250mm，5μm)；以包含0.06％三氟乙酸的水溶液为流动相A；以包含0.06％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积5μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；(2)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；(3)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变。(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至70:30；(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；
样品配制：
取供试品2,4-二氟硝基苯以及各杂质，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质50μg和2,4-二氟硝基苯50μg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液5μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图11。
由图11可知，主成分与相邻杂质以及各杂质之间均能够达到基线分离，分离度较好，与实施例1中分离度相当。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：
色谱柱：为Waters Ultimate PFP或Waters xselect Hss PFP；
流动相：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；其中，所述流动相A为包含三氟乙酸的水的混合溶液；所述流动相B为包含三氟乙酸的乙腈混合溶液；
梯度洗脱过程如下：
(1)在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；
(2)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；
(3)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持10:90不变；
(4)在50-50.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至70:30；
(5)在50.1-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变。
2.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A为包含0.02～0.08％三氟乙酸的水混合溶液，优选为包含0.04～0.06％三氟乙酸的水混合溶液，更优选为包含0.05％三氟乙酸的水混合溶液。
3.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B为包含0.02～0.08％三氟乙酸的乙腈混合溶液，优选为包含0.04～0.06％三氟乙酸的乙腈混合溶液，更优选为包含0.05％三氟乙酸的乙腈混合溶液。
4.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm或3.5μm。
5.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为20-45℃，优选为25-35℃，更优选为30℃。
6.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测波长为220～270nm，优选为230～250nm，优选为240nm。
7.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流速为0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min。
8.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为5-30μl，优选5μl。
9.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，溶解样品的溶剂为乙腈。
10.根据权利要求1所述的2,4-二氟硝基苯中有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质包括以下组分：
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