CN117701741A - 一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组及其应用，所述引物组包括SEQ ID NO:1‑118所示的核苷酸序列。本发明从数据库中收集并分析出了结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的鉴定基因，针对鉴定基因设计了特异性引物，结合多重PCR技术和靶向高通量测序技术，通过对靶标进行超多重PCR扩增富集提高检测灵敏度，基于基因测序平台的序列读取提高检测特异性，从而实现精准且灵敏的分枝杆菌的鉴别，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效鉴别混合感染，在结核病/NTM病的检测中具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组及其应用。
背景技术
分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)隶属放线菌门，共含5个属，分枝杆菌属(Mycobacterium)、分枝酸杆菌属(Mycolicibacter)、分枝酸棒菌属(Mycolicibacillus)、拟分枝酸杆菌属(Mycobacteroides)和分枝酸菌属(Mycolicibacterium)。分枝杆菌为形状不规则的革兰氏阳性杆菌，不能游动，通常抗酸，无气生菌丝和孢子。
非结核分枝杆菌(non-tuberculous Mycobacteria，NTM)是分枝杆菌中除结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)和麻风分枝杆菌之外的一类分枝杆菌。NTM是一种环境生长菌，目前已鉴别出190余种，对人体具有致病性的有40余种。临床上发现的NTM感染多为支气管扩张和慢性阻塞性肺疾病患者的并发感染，且NTM肺病的临床症状、X射线表现与肺结核相似，但治疗方案差别明显，临床上易误诊误治，使得患者病程迁延。随着分子诊断技术的不断改进和学科认知的普及，在世界范围内，NTM病的发病率均逐年上升。
结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌在形态学及图片抗酸染色上难以鉴别，其临床治疗差别较大，许多非结核分枝杆菌对抗结核药物天然耐药，常规化疗效果不佳。因此，目前分枝杆菌的鉴定对结核病的诊断、鉴别诊断和有效化疗具有重要意义。正确快速鉴别分枝杆菌，可避免误诊误治、漏诊、过诊，实现个体化治疗，有利于控制结核病和NTM病的传播。
目前的分枝杆菌鉴定方法多数基于多重PCR技术，包含实时荧光定量PCR技术、等温扩增技术、探针-反向杂交技术和探针-熔解曲线技术等，均较为方便、快捷，但这些试剂多基于某个特定SNP位点进行菌种鉴别，可鉴别的菌种有限，也难以做到亚种的鉴别。
目前的分枝杆菌临床常用的一代测序菌种鉴定方法多基于16S rRNA区域，但是16SrRNA区域分辨力不足，一些亲缘关系相近的菌种无法被准确鉴别。因此，开发一种高效准确的分枝杆菌鉴定的方法学和引物组在结核病/NTM病的检测中具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组及其应用。本发明结合多重PCR技术和靶向高通量测序技术(Targeted next-generation sequencing，tNGS)，通过对靶标的超多重PCR扩增富集提高检测灵敏度，基于基因测序平台(Illumina)的序列读取提高检测特异性，从而实现精准而灵敏的分枝杆菌的鉴别，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效鉴别混合感染。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，所述引物组包括SEQ ID NO:1-118所示的核苷酸序列。
优选地，所述引物组还包括特异性扩增内参基因的引物。
优选地，所述内参基因为人锌指蛋白基因。
优选地，所述特异性扩增内参基因的引物包括SEQ ID NO:119-120所示的核苷酸序列。
优选地，所述引物组中每条引物序列上还连接有公共序列。
优选地，所述公共序列包括SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
本发明中，通过查阅文献、公共数据库，收集分枝杆菌的基因组数据库及其常见鉴定基因，常见鉴定基因如结核分枝杆菌复合群的IS6110、IS1081、mtp64或rpoB等，非结核分枝杆菌的16S rRNA、rpoB、hsp65或ITS等，找到鉴定基因后并对鉴定基因设计特异性引物序列，同时设计内参特异性引物序列，得到用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组。
在菌株鉴定过程中，同一个菌种的不同菌株的序列有一定差异，其中标志性SNP(单个位点或某个区域或某几个区域)在该菌种的不同菌株或其亲缘关系相近的菌种的不同菌株都存在，一对引物序列可同时扩增多个菌种，其中可通过标志性SNP鉴别部分菌种；多对引物联合，可实现菌种的精准鉴别。
第二方面，本发明提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组。
优选地，所述试剂盒还包括测序接头和封闭引物。
本发明中，每条特异性引物序列5’端连接公共序列(5’-gactgccgctggttggatg-3’，SEQ ID NO:121)作为PCR引物序列，公共序列的作用为连接测序接头与每条特异性引物。Illumina平台的测序接头3’端连接该公共序列作为测序接头引物，公共序列的作用为连接PCR引物及扩增目标区域。
优选地，所述封闭引物包括SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列。
本发明中，将公共序列的反向互补序列作为封闭引物(5’-catccaaccagcggcagtc-3’，SEQ ID NO:122)，在PCR引物序列扩增样本目标区域过程中，避免接头引物与特异性引物进行连接。
优选地，所述测序接头还连接有公共序列。
第三方面，本发明提供一种鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的装置，所述装置包括：
建库单元：采用第二方面所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒配制建库引物体系，对模板DNA进行超多重PCR扩增，获得超多重PCR文库；
测序单元：对所述超多重PCR文库进行纯化和高通量测序；
分析单元：根据高通量测序测序结果鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。
优选地，所述建库引物体系包括：引物组、测序接头和封闭引物。
优选地，所述建库引物体系中引物组、测序接头和封闭引物按照(4-5):(2-2.5):(0.8-1.2)的比例进行混合，比例例如可以是4:2:0.8、4:2.5:0.8、4:2.5:1.2、5:2:0.8、5:2.5:0.8或5:2.5:1.2等。
优选地，所述超多重PCR文库的结构为Illumina测序接头-公共序列-目标区域-公共序列-Illumina测序接头。
本发明中，采用一步法进行超多重PCR文库的构建，Illumina平台的常规的PCR建库步骤为使用引物组进行核酸扩增，扩增产物末修后再进行接头连接，需要进行两轮PCR扩增，一般口头表述为两步法建库；我们的一步法建库是在扩增的同时进行接头连接，只需要进行一轮PCR扩增，因此称为一步法建库。整个文库构建过程无需开盖，避免污染；节省人工操作。
第四方面，本发明提供一种以非疾病诊断或治疗为目的的鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的方法，所述方法包括：
采用第二方面所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒配制建库引物体系，对模板DNA进行超多重PCR扩增，获得超多重PCR文库；对超多重PCR文库进行纯化和高通量测序；根据高通量测序测序结果鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。
优选地，所述建库引物体系包括：引物组、测序接头和封闭引物。
优选地，所述建库引物体系中引物组、测序接头、封闭引物按照(4-5):(2-2.5):(0.8-1.2)的比例进行混合，比例例如可以是4:2:0.8、4:2.5:0.8、4:2.5:1.2、5:2:0.8、5:2.5:0.8或5:2.5:1.2等。
优选地，所述超多重PCR文库的结构为Illumina测序接头-公共序列-目标区域-公共序列-Illumina测序接头。
第五方面，本发明提供第一方面所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组和/或第二方面所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒在制备结核病/NTM病检测产品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明结合多重PCR技术和靶向高通量测序技术(Targeted next-generationsequencing，tNGS)，通过对靶标的超多重PCR扩增富集提高检测灵敏度，基于基因测序平台(Illumina)的序列读取提高检测特异性，从而实现精准而灵敏的分枝杆菌的鉴定，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效鉴别混合感染。
(2)本发明中所述引物组以及试剂盒在分枝杆菌的鉴定中呈现较高的灵敏度，能稳定检出至少40菌/mL的结核分枝杆菌，能稳定检出65～73菌/mL的除土分枝杆菌以外的非结核分枝杆除菌，能稳定检出118.9菌/mL的土分枝杆菌。此外，所述引物组或试剂盒对结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的混合感染能进行准确的区分，在结核病/NTM病的检测中具有重要的应用价值。
(3)本发明所述鉴别方法还可以防止样本在检测过程中的批内气溶胶污染。在常规PCR过程中，先扩增再转移扩增产物进行第二轮PCR以连接测序接头，在转移过程中存在样本间第一轮PCR产物的气溶胶相互污染的可能性；相比之下，本发明的鉴别方法能够防止批内气溶胶污染，将模板加入反应体系后，在同一个反应体系中同时进行扩增和接头连接，完成PCR后的文库已经连上对应测序接头，避免了转移过程中的潜在污染。
附图说明
图1为对结核分枝杆菌不同浓度参考品的测定结果。
图2为结核分枝杆菌95％检测限测定结果。
图3为4种非结核分枝杆菌95％检测限测定结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组
本实施例提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，引物序列如表1所示。所述引物组中，一对引物序列可同时扩增多个菌种，其中可通过标志性SNP鉴别部分菌种；多对引物联合，可实现菌种的精准鉴别。
表1
实施例2一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒
本实施例提供了一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒中包括实施例1中的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组。所述试剂盒中还包括进行一步建库所用的试剂，所述试剂包括：测序接头、封闭引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液。
实施例3分枝杆菌鉴别
用实施例2中的试剂盒对结核分枝杆菌以及数种非结核分枝杆菌(NTM)的梯度稀释样品进行测定，从而评估其检测性能。
其中，结核分枝杆菌待测样品采用结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品(购自中国食品药品检定研究所，产品编号230030)中的最低检出量参考品(S1，1×103个菌/mL、S2，1×102个菌/mL、S3，1×101个菌/mL、S4，1×10个菌/mL)。
NTM待测菌种选用：(1)耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、土分枝杆菌(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)；(2)新金色分枝杆菌(购自广东省保藏中心)。
(1)稳定性评估：以参考品S1、S2、S3、S4为材料，提取核酸后，按技术重复20个进行建库测序。
建库步骤如下所示：配制一步法建库引物体系，体系中各组分及其浓度如表2所示。
表2
| 组分 | 浓度 |
| 酶 | 1U/μL |
| 引物 | 20pmol/μL |
| 缓冲液 | 2×缓冲液 |
| 模板 | 40ng/μL |
对模板DNA进行超多重PCR扩增进行PCR扩增，PCR扩增程序设置如表3所示。
表3
扩增后获得超多重PCR文库，最终获得文库结构为“Illumina测序接头-公共序列-目标区域-公共序列-Illumina测序接头”。其中，不同模板DNA使用不同的测序接头。
对每个超多重PCR文库进行纯化，纯化后将各文库混合，获得分枝杆菌鉴别的文库。
对所述超多重PCR文库进行高通量测序，使用生物信息分析方法对测序数据进行分析，最终获得分枝杆菌鉴别结果。
测定结果如图1和表4，图1为对结核分枝杆菌不同浓度参考品的测定结果。从图中可知，除最低浓度的S1以外的标准品均为100％检出，而S1仅有6个样品检出(阳性检出率30％)。S1同时随着浓度升高，S1、S2、S3、S4的变异系数(CV)呈现逐渐降低的趋势，S3和S4的CV分别为20.37％和18.52％，在1×103菌/mL及以上浓度下呈现较为稳定的检出表现。表4为基于结核分枝杆菌标准品的稳定性评估结果。
表4
(2)灵敏性评估：进一步对试剂盒的检测灵敏性进行评估。以结核分枝杆菌和上述4种非结核分枝杆菌为研究素材，按表5所示用生理盐水稀释为相应的浓度梯度。经建库测序后，利用观察法和Probit分析法计算各菌的LoD95％(95％检测限)。最终按观察法测得的结核分枝杆菌LoD95％为40.0菌/mL，而拟合法推断的LoD95％为30.8菌/mL(图2，表5)。图2为结核分枝杆菌95％检测限测定结果，基于Probit回归法和观察法测得的检测限分别用垂直虚线和垂直直线标记。表5为本试剂盒检测结核分枝杆菌标准品的稳定性评估。
表5
| 菌种 | 浓度梯度 | 技术重复 | LoD95％ |
| 结核分枝杆菌 | 1,2,4,8,10,20,40,80,100,200,400,800,1000 | 20 | 30.8/40.0 |
| 耻垢分枝杆菌 | 1,5,10,50,100,500,1000 | 5 | 72.5 |
| 脓肿分枝杆菌 | 1,5,10,50,100,500,1000 | 5 | 72.0 |
| 土分枝杆菌 | 1,5,10,50,100,500,1000 | 5 | 118.9 |
| 新金色分枝杆菌 | 1,5,10,50,100,500,1000 | 5 | 65.7 |
图3为4种非结核分枝杆菌95％检测限测定结果，耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、土分枝杆菌、新金色分枝杆菌通过拟合法推断的LoD95％分别为72.5菌/mL、72.0菌/mL、118.9菌/mL、65.7菌/mL。据此可知，本试剂盒对结核分枝杆菌至少在40菌/mL能稳定检出，除土分枝杆菌以外非结核分枝杆除菌均在65～73菌/mL能稳定检出，土分枝杆菌在118.9菌/mL能稳定检出。本试剂盒总体呈现较高的灵敏度。
实施例4分枝杆菌混合感染的鉴别
用实施例2中的试剂盒进行按比例梯度混合样品测定，从而评估其对混合感染的检测性能。建库步骤参照实施例3进行。
其中，结核分枝杆菌待测样品采用结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品(购自中国食品药品检定研究所)中的阳性参考品P1、P2(1×103个菌/mL)。NTM待测菌种选用脓肿分枝杆菌、土分枝杆菌(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。
将NTM待测菌种以生理盐水进行梯度稀释，结核分枝杆菌复合群参考品和脓肿分枝杆菌分别按(1×103个菌/mL：1×102个菌/mL、1×103个菌/mL：1×103个菌/mL、1×103个菌/mL：1×104个菌/mL、1×103个菌/mL：1×105个菌/mL、1×103个菌/mL：1×106个菌/mL)的比例进行混合，模拟结核与非结核的不同程度的混合感染。
将NTM待测菌种以生理盐水进行梯度稀释，脓肿分枝杆菌、土分枝杆菌之间分别按(1×106个菌/mL：1×103个菌/mL、1×105个菌/mL：1×103个菌/mL、1×104个菌/mL：1×103个菌/mL、1×103个菌/mL：1×103个菌/mL、1×102个菌/mL：1×103个菌/mL、1×103个菌/mL：1×102个菌/mL、1×103个菌/mL：1×104个菌/mL、1×103个菌/mL：1×105个菌/mL、1×103个菌/mL：1×106个菌/mL)的比例进行混合，模拟不同非结核的混合感染。
对混合后的样品进行核酸提取，对提取的核酸进行文库构建及测序。模拟混合样品检测结果如表6所示。
表6
结果显示：该引物组对结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的混合感染能进行准确的区分；对于非结核分枝杆菌的混合感染，在某个菌浓度介于检测限附近(如1×102个菌/mL)、另一个菌浓度高于1×105个菌/mL时，低载量的非结核分枝杆菌可能无法检出；对于高于1×103个菌/mL的非结核分枝杆菌的混合感染，引物组能进行准确的区分。
综上，本发明提供了一种采用一步法进行建库测序的分枝杆菌鉴别的方法和引物组，所述方法通过对靶标序列的超多重PCR扩增富集提高检测灵敏度，基于基因测序平台的序列读取提高检测特异性，从而实现精准而灵敏的分枝杆菌的鉴别，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效鉴别混合感染，在结核病/NTM病的检测中具有重要应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID NO:1-118所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组还包括特异性扩增内参基因的引物；
优选地，所述内参基因为人锌指蛋白基因；
优选地，所述特异性扩增内参基因的引物包括SEQ ID NO:119-120所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组中每条引物序列上还连接有公共序列；
优选地，所述公共序列包括SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
4.一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-3中任一项所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组。
5.根据权利要求4所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序接头和封闭引物；
优选地，所述封闭引物包括SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列；
优选地，所述测序接头还连接有公共序列。
6.一种鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的装置，其特征在于，所述装置包括：
建库单元：采用权利要求4或5所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒配制建库引物体系，对模板DNA进行超多重PCR扩增，获得超多重PCR文库；
测序单元：对所述超多重PCR文库进行纯化和高通量测序；
分析单元：根据高通量测序测序结果鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。
7.根据权利要求6所述的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的装置，其特征在于，所述建库引物体系包括：引物组、测序接头和封闭引物；
优选地，所述建库引物体系中引物组、测序接头和封闭引物按照(4-5):(2-2.5):(0.8-1.2)的比例进行混合；
优选地，所述超多重PCR文库的结构为Illumina测序接头-公共序列-目标区域-公共序列-Illumina测序接头。
8.一种以非疾病诊断或治疗为目的的鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求4或5所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒配制建库引物体系，对模板DNA进行超多重PCR扩增，获得超多重PCR文库；对超多重PCR文库进行纯化和高通量测序；根据高通量测序测序结果鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。
9.根据权利要求8所述的以非疾病诊断或治疗为目的的鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的方法，其特征在于，所述建库引物体系包括：引物组、测序接头和封闭引物；
优选地，所述建库引物体系中引物组、测序接头、封闭引物按照(4-5):(2-2.5):(0.8-1.2)的比例进行混合；
优选地，所述超多重PCR文库的结构为Illumina测序接头-公共序列-目标区域-公共序列-Illumina测序接头。
10.权利要求1-3中任一项所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组和/或权利要求4或5所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒在制备结核病/NTM病检测产品中的应用。
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