CN117701446A - 一种肺炎球菌发酵培养基及其应用 - Google Patents
一种肺炎球菌发酵培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种肺炎球菌的发酵培养基及其应用，本发明筛选到合适的碳源、氮源组分以及浓度的培养基，对肺炎球菌发酵培养后可获得产糖率高的发酵液，进一步可以获得抗原性更高的肺炎球菌疫苗。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种肺炎球菌发酵培养基及其应用。
背景技术
肺炎链球菌简称肺炎球菌，革兰染色为阳性，有α溶血性，链球菌属下的一种菌。在自然界中分布广泛。至于能否致病则与荚膜有密切关系，因荚膜能抵抗人体内吞噬细胞的吞噬作用从而大量繁殖，是细菌性大叶性肺炎的主要病原体，也是引发肺炎、脑膜炎等疾病的首要致病菌。在现有培养条件下，肺炎球菌荚膜多糖的收率较低，因此，有必要对其发酵工艺进行进行优化以提高多糖的产率。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种肺炎球菌发酵培养基及其应用，具体的，
本发明第一方面，提供一种肺炎球菌的培养基，所述培养基包括葡萄糖25-45g/L，蛋白胨10-18g/L，酵母粉3-5g/L。
优选的，所述葡萄糖可以是25-45g/L中的任意范围或者数值，例如25、28、30、32、35、38、40、45g/L等等。
优选的，所述蛋白胨可以是10-18g/L中的任意范围或者数值，例如10、12、15、18g/L等等。更优选的，所述蛋白胨来自大豆蛋白胨。
优选的，所述酵母粉可以是3-5g/L中的任意范围或者数值，例如3、4、5g/L等等。
优选的，所述培养基还包括无机盐和微量元素，更优选的，所述无机盐包括钠盐、镁盐、钾盐，所述微量元素包括铁盐、锌盐和锰盐。
进一步优选的，所述钠盐来自碳酸钠、所述镁盐来自七水硫酸镁；所述钾盐来自磷酸氢二钾；所述铁盐来自硫酸亚铁、锌盐来自七水硫酸锌和锰盐来自硫酸锰。
优选的，所述培养基还包括腺嘌呤和尿嘧啶。
在一个具体的实施方式中所述培养基包括葡萄糖40g/L、大豆蛋白胨15g/L、酵母粉5g/L、磷酸氢二钾12g/L、腺嘌呤0.1g/L、尿嘧啶0.1g/L、碳酸钠3g/L、七水硫酸镁1.0g/L、硫酸亚铁0.05g/L、七水硫酸锌0.05g/L、硫酸锰一水合物0.02g/L。
在一个具体的实施方式中所述培养基包括葡萄糖30g/L、大豆蛋白胨15g/L、酵母粉3g/L、磷酸氢二钾12g/L、腺嘌呤0.1g/L、尿嘧啶0.1g/L、碳酸钠3g/L、七水硫酸镁1.0g/L、硫酸亚铁0.05g/L、七水硫酸锌0.05g/L、硫酸锰一水合物0.02g/L。
在一个具体的实施方式中所述培养基包括葡萄糖40g/L、大豆蛋白胨10g/L、酵母粉3g/L、磷酸氢二钾12g/L、腺嘌呤0.1g/L、尿嘧啶0.1g/L、碳酸钠3g/L、七水硫酸镁1.0g/L、硫酸亚铁0.05g/L、七水硫酸锌0.05g/L、硫酸锰一水合物0.02g/L。
优选的，所述培养基pH 7.0-7.2。
优选的，所述肺炎球菌为任一血清型肺炎球菌。例如：血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F等等。
本发明第二方面，提供一种上述培养基在培养肺炎球菌中的应用。
本发明第三方面，提供一种肺炎球菌的发酵培养方法，所述方法包括将上述任一的培养基对肺炎球菌进行发酵培养。
优选的，所述方法包括：
(1)、菌种活化；
(2)固体培养基扩大培养；
(3)摇瓶培养；
(4)发酵罐培养；
(5)发酵液离心、过滤、去核酸、去蛋白、除菌保存。
优选的，所述步骤(1)
优选的，所述步骤(4)的培养基为上述第一方面定义的培养基。
优选的，所述步骤(5)包括：5-1)肺炎球菌发酵液，灭活后离心收集上清液，经超滤浓缩；5-2)浓缩液经醇沉、酸沉和钙沉，浓缩后收集上清液；5-3)过滤除菌，获得多价荚膜多糖原液。
更优选的，所述步骤5-2)采用乙醇进行醇沉、采用乙酸进行酸沉和/或采用氯化钙溶液进行钙沉。
更优选的，所述荚膜多糖储存在-20℃。
本发明第四方面，提供一种肺炎球菌的发酵液，所述发酵液由上述发酵培养方法获得。
所述发酵液包括肺炎球菌的荚膜多糖。
优选的，所述发酵液包含大于2.0g/L的荚膜多糖。
本发明第五方面，提供一种上述肺炎球菌的发酵液在制备疫苗中的用途。
本发明第六方面，提供一种肺炎球菌疫苗，所述疫苗包括上述任一的发酵液。
优选的，所述疫苗包括荚膜多糖10-50μg/ml，可以是上述范围内的任意数值或范围，例如12、15、20、25、30、35、40、45或50μg/ml。
优选的，所述疫苗可以包括多种血清型肺炎球菌的发酵液。
例如：血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F等等。
优选的，所述疫苗还包括佐剂。
更优选的，所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。在本发明的一个或多个实施方案中，所述佐剂为氢氧化铝佐剂(Al(OH)3佐剂)、CpG1018佐剂(购自广州锐博生物技术有限公司，批号0210426)、CpG-cjx1佐剂(本公司)、CpG7909佐剂(本公司)中的至少任一种。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明选择合适的碳源、氮源以及相应的浓度使其适合肺炎球菌的发酵工艺，产糖率得到显著的提高，最高可达3.24g/L。
(2)本发明获得的发酵液也用于制备肺炎球菌疫苗，由于其具有较高的荚膜多糖可减少疫苗制备的成本，提高疫苗的抗原性。
附图说明
图1：肺炎球菌发酵流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或者可通过已知方法制备得到。
实施例1：3型多糖发酵培养基的制备：
按照表1的配方组成，根据发酵液体积需求，计算获得表1的含量称取葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二钾、腺嘌呤、尿嘧啶、碳酸钠、七水硫酸镁等成分溶于一定体积的纯化水中，混匀溶解，将七水硫酸镁、硫酸亚铁、七水硫酸锌、硫酸锰一水合物按照组分含量配成100倍母液，使用时吸取加入，调整至pH 7.0-7.2待用。
表1：培养基配方
| 成分 | A | B | C | D | E | F | G | H | I |
| 葡萄糖 | 20 | 20 | 20 | 30 | 30 | 30 | 40 | 40 | 40 |
| 大豆蛋白胨 | 5 | 10 | 15 | 5 | 10 | 15 | 5 | 10 | 15 |
| 酵母粉 | 3 | 5 | 7 | 5 | 7 | 3 | 7 | 3 | 5 |
| 磷酸氢二钾 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| 腺嘌呤 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 尿嘧啶 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 碳酸钠 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 七水硫酸镁 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 硫酸亚铁 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 七水硫酸锌 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 硫酸锰 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
实施例2肺炎球菌发酵方法
肺炎球菌发酵流程图见图1。
1、3型肺炎球菌发酵用菌种制备
菌种活化
取出冻干菌种，加入200μL无菌生理盐水复溶，混匀菌悬液，吸取200μl菌悬液加入MH羊血平皿上，涂布器涂布均匀后，倒置于CO2培养箱35-37℃，5-8％CO2条件下培养24-48h。
2、固体培养基扩大培养
刮取活化菌溶于菌生理盐水中，混匀菌悬液。分别吸取200μL菌悬液加入6个MH羊血平皿上，涂布均匀，置于CO2培养箱35-37℃，5-8％CO2条件下培养24-48h。
3、摇瓶培养
刮取培养好的肺炎链球菌MH羊血平皿，加入600mL摇瓶培养基中，置恒温培养振荡器中，在37℃，100-300rpm条件下培养。菌体摇瓶培养至OD6003-5时，转入含有表1中的培养基的发酵罐中。
4、发酵罐培养
接种后按已经确定的工艺参数培养，溶氧20％，温度37℃，转速100rpm，pH 7.2，罐压为0.05MPa。发酵完毕，加入脱氧胆酸钠量，使脱氧胆酸钠终浓度为0.1％灭活60min后，转交纯化组处理。
灭活肺炎球菌发酵液经离心、过滤、超滤浓缩后，按体积加入0.5mol/L CaCl2、3％(m/V)CH3COONa搅拌溶解后，加23％的无水乙醇，静置离心去沉淀除去核酸，上清液加入乙酸去除蛋白，10倍体积洗滤，过滤除菌保存。
结果：
各种培养基的效果比对见表2：
表2各培养基发酵后产糖量
| 成分 | A | B | C | D | E | F | G | H | I |
| 葡萄糖 | 20 | 20 | 20 | 30 | 30 | 30 | 40 | 40 | 40 |
| 大豆蛋白胨 | 5 | 10 | 15 | 5 | 10 | 15 | 5 | 10 | 15 |
| 酵母粉 | 3 | 5 | 7 | 5 | 7 | 3 | 7 | 3 | 5 |
| 磷酸氢二钾 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| 腺嘌呤 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 尿嘧啶 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 碳酸钠 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 七水硫酸镁 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 硫酸亚铁 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 七水硫酸锌 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 硫酸锰 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 产糖量(g/L) | 0.55 | 0.83 | 1.76 | 1.28 | 1.54 | 2.05 | 1.86 | 2.43 | 3.24 |
结论是：
其中F组、H组以及I组的产糖量都大于2.0g/L，而I组(葡萄糖40g/L、大豆蛋白胨15g/L、酵母粉5g/L、磷酸氢二钾12g/L、腺嘌呤0.1g/L、尿嘧啶0.1g/L、碳酸钠3g/L、七水硫酸镁1.0g/L、硫酸亚铁0.05g/L、七水硫酸锌0.05g/L、硫酸锰一水合物0.02g/L，pH7.0-7.2)培养基最好，获得产量最高，3型多糖产量可达3.24g/L(其与H组的P＝0.0135)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种肺炎球菌的培养基，其特征在于，所述培养基包括葡萄糖25-45g/L，蛋白胨10-18g/L，酵母粉3-5g/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括无机盐、微量元素、腺嘌呤和/或尿嘧啶，更优选的，所述无机盐包括钠盐、镁盐、钾盐，所述微量元素包括铁盐、锌盐和锰盐。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，培养基包括
(1)葡萄糖40g/L、大豆蛋白胨15g/L、酵母粉5g/L、磷酸氢二钾12g/L、腺嘌呤0.1g/L、尿嘧啶0.1g/L、碳酸钠3g/L、七水硫酸镁1.0g/L、硫酸亚铁0.05g/L、七水硫酸锌0.05g/L、硫酸锰一水合物0.02g/L；
(2)葡萄糖30g/L、大豆蛋白胨15g/L、酵母粉3g/L、磷酸氢二钾12g/L、腺嘌呤0.1g/L、尿嘧啶0.1g/L、碳酸钠3g/L、七水硫酸镁1.0g/L、硫酸亚铁0.05g/L、七水硫酸锌0.05g/L、硫酸锰一水合物0.02g/L；或，
(3)葡萄糖40g/L、大豆蛋白胨10g/L、酵母粉3g/L、磷酸氢二钾12g/L、腺嘌呤0.1g/L、尿嘧啶0.1g/L、碳酸钠3g/L、七水硫酸镁1.0g/L、硫酸亚铁0.05g/L、七水硫酸锌0.05g/L、硫酸锰一水合物0.02g/L。
4.权利要求1-3任一所述的培养基在培养肺炎球菌中的应用。
5.一种肺炎球菌的发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-3任一所述的培养基对肺炎球菌进行发酵培养。
6.根据权利要求5所述的发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)菌种活化；
(2)固体培养基扩大培养；
(3)摇瓶培养；
(4)发酵罐培养；
(5)发酵液离心、过滤、去核酸、去蛋白、除菌保存。
7.一种肺炎球菌的发酵液，所述发酵液由权利要求5或6所述的发酵培养方法获得。
8.权利要求7所述的发酵液在制备疫苗中的用途。
9.一种肺炎球菌疫苗，所述疫苗包括权利要求8所述的的发酵液。
10.根据权利要求9所述的肺炎球菌疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌包括多种血清型肺炎球菌。
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