CN117700546A - 一种gm-csf自身抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种GM‑CSF自身抗体及其制备方法与应用，属于GM‑CSF自身抗体制备技术领域。本发明采用自身免疫性疾病肺泡蛋白沉积症(aPAP)患者全肺灌洗术后的肺泡灌洗液，成功制备获得了GM‑CSF自身抗体，采用本发明方法制备所得的GM‑CSF自身抗体用于GM‑CSF检测试剂盒的标准品，能够定量aPAP患者体液中的GM‑CSF含量，对于aPAP的诊断和治疗具有指导意义。

Description

一种GM-CSF自身抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于GM-CSF自身抗体制备技术领域，尤其涉及一种GM-CSF自身抗体及其制备方法与应用。

背景技术

自身抗体的产生是自身免疫系统疾病的表现之一，其出现会导致体内的细胞被自身抗体攻击或相关分子被抗体封闭，引起组织、器官或系统功能紊乱。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是对中性粒细胞和巨噬细胞产生重要影响的细胞因子，深刻的影响这两类髓系来源细胞的发育和功能维持。自身免疫性肺泡蛋白沉积症(aPAP)是成人肺泡蛋白沉积症(PAP)中最常见的类型，其依赖于血清GM-CSF自身抗体的定量检测(一般是5μg/ml)，尤其对于不能获得肺活检病理或肺泡灌洗液的病人而言，CT结合GM-CSF自身抗体同样支持aPAP的诊断。因此，建立GM-CSF自身抗体标准品对精确定量GM-CSF抗体和诊断aPAP至关重要，但是目前国内尚无相关商品化可用于aPAP疑诊病人的GM-CSF标准品和定量流程。

目前，对于GM-CSF抗体的检测最可靠的定量方法是酶联免疫吸附法(ELISA)，通过标准品定量标准曲线，去定量检测样品的数值。根据文献调研发现，aPAP病人体内的GM-CSF抗体为多克隆抗体，成分复杂，但是对于GM-CSF有很强的中和作用，并且针对于GM-CSF的多个表位。本领域目前没有针对aPAP诊断的GM-CSF自身抗体的定量检测方法，因为市面上使用的标准品为实验室内质粒表达产生的单克隆抗体，aPAP病人体内产生的抗体是特殊的多克隆免疫球蛋白G(主要是IgG1和IgG2，以及少量的IgG3和IgG4)组成，靶向分布在整个GM-CSF分子中的多个表位，具有高结合亲和力(20pm，s.d.7.5pm)，在高于生理学浓度的情况下中和GM-CSF，并在体内有效阻断GM-CSF信号，而通过实验室内质粒表达出来的单抗，仅能针对于某一种抗体进行检测，因此，常规表达的抗体不能作为标准品使用，也就不能对待测品的含量进行定量。所以，目前通过实验室内质粒表达产生的抗体作为标准品的市场化试剂盒，对于GM-CSF的中和作用不等，并且结合表位不一，很难用于aPAP这种复杂的疾病病理生理状态。所以，本领域亟需一种制备GM-CSF自身抗体的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种GM-CSF自身抗体的制备方法，首次从aPAP患者肺泡灌洗液中制备获得GM-CSF自身抗体，并以此为标准品，能够准确检测GM-CSF自身抗体的表达情况，并且能够定量aPAP患者体液中GM-CSF的含量，有助于aPAP的诊断和治疗。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种制备GM-CSF自身抗体的方法，包括如下步骤：将aPAP患者肺泡灌洗液过ProteinA吸附柱，采用pH 2.2-2.5的甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱液即为肺泡灌洗液总抗体；将肺泡灌洗液总抗体过GM-CSF蛋白偶联的NHS柱，采用pH 2.0-3.0的甘氨酸溶液洗脱，待可检出峰后收集洗脱液，此洗脱液即为纯化的GM-CSF自身抗体。

优选的，GM-CSF蛋白偶联的NHS柱的制备方法包括如下步骤：将亲和蛋白凝胶NHS填料填充至亲和层析柱，活化液活化后用偶联液冲洗，将偶联液溶解的GM-CSF蛋白加入NHS柱进行偶联，封闭平衡后，即得GM-CSF蛋白偶联的NHS柱。

优选的，所述活化液为pH值为3.0的1mM HCl；所述偶联液为0.2M NaHCO₃和0.5MNaCl的混合液，偶联液的pH值为8.3。

优选的，所述封闭为先用封闭液进行冲洗，洗脱液洗脱后再次用封闭液冲洗；所述封闭液为0.1M Tris-HCl和0.5M NaCl的混合液，封闭液的pH值为8.3；所述洗脱液为pH值2.2-2.5的甘氨酸-HCl溶液。

优选的，所述GM-CSF蛋白为BL21菌株原核表达的GM-CSF抗原。

本发明还提供了一种上述方法制备的GM-CSF自身抗体。

本发明还提供了一种上述GM-CSF自身抗体在制备检测GM-CSF抗体试剂盒或在制备aPAP诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测GM-CSF抗体或诊断aPAP的ELISA试剂盒，包括标准品，所述标准品为上述GM-CSF自身抗体。

优选的，所述标准品的浓度为1μg/ml，按照1:50-1:200的浓度进行稀释使用。

优选的，还包括去除非特异结合的溶液，所述溶液为乙酸铵溶液。

本发明的有益效果：

本发明采用aPAP患者全肺灌洗术后的肺泡灌洗液，成功制备获得了GM-CSF自身抗体，采用本发明方法制备所得的GM-CSF自身抗体用于GM-CSF检测试剂盒的标准品，能够定量aPAP患者体液中的GM-CSF含量，对于aPAP的诊断和治疗具有指导意义。

附图说明

图1为GM-CSF抗原原核表达的page胶结果；

图2为ELISA酶标板包被不同GM-CSF蛋白的检测结果；

图3为GM-CSF自身抗体制备方法效果验证；

图4为GM-CSF自身抗体用作标准品时的使用浓度；

图5为不同浓度NHS柱洗脱液的洗脱效果。

具体实施方式

本发明提供了一种制备GM-CSF自身抗体的方法，包括如下步骤：将aPAP患者肺泡灌洗液过ProteinA吸附柱，采用pH 2.2-2.5的甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱液即为肺泡灌洗液总抗体；将肺泡灌洗液总抗体过GM-CSF蛋白偶联的NHS柱，采用pH 2.0-3.0的甘氨酸溶液洗脱，待可检出峰后收集洗脱液，此洗脱液即为纯化的GM-CSF自身抗体。

在本发明中，所述aPAP患者肺泡灌洗液优选的为全肺灌洗术治疗aPAP患者后所得。本发明对于ProteinA吸附柱的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述洗脱ProteinA吸附柱所用的甘氨酸溶液的pH值优选为2.3-2.4，优选的用盐酸调节pH。收集的洗脱液优选的需用Tris-HCl溶液(pH 8)中和，所述洗脱液和Tris-HCl溶液的体积比优选为5:1。

在本发明中，所述GM-CSF蛋白偶联的NHS柱的制备方法优选的包括如下步骤：将亲和蛋白凝胶NHS填料填充至亲和层析柱，活化液活化后用偶联液冲洗，将偶联液溶解的GM-CSF蛋白加入NHS柱进行偶联，封闭平衡后，即得GM-CSF蛋白偶联的NHS柱。

本发明对于亲和蛋白凝胶NHS填料和亲和层析柱的具体来源没有特殊限定。活化所用活化液优选的为pH值为3.0的1mM HCl，所述活化液与柱体积的比优选为10:1。在本发明中，所述偶联液优选的为0.2M NaHCO₃和0.5MNaCl的混合液，偶联液的pH值优选为8.3，所述偶联液与柱体积的比优选为10:1。

在本发明中，所述偶联至NHS柱的GM-CSF蛋白优选的为BL21菌株原核表达的GM-CSF抗原，所述偶联的条件优选为室温偶联1-2h或4℃偶联过夜。偶联后，进行封闭平衡，所述封闭优选的为先用封闭液进行冲洗，洗脱液洗脱后再次用封闭液冲洗。所述封闭液优选的为0.1M Tris-HCl和0.5M NaCl的混合液，封闭液的pH值优选为8.3；所述洗脱液优选的为pH值2.2-2.5的甘氨酸-HCl溶液。

本发明还提供了一种上述方法制备的GM-CSF自身抗体。

本发明还提供了一种上述GM-CSF自身抗体在制备检测GM-CSF抗体试剂盒或在制备aPAP诊断试剂盒中的应用。

采用本发明上述方法制备所得的GM-CSF自身抗体制备aPAP诊断试剂盒时，是以本发明上述方法制备所得的GM-CSF自身抗体作为标准品，对待测样本中的GM-CSF进行定量检测，若定量检测的结果能够达到5μg/ml，则可确诊为aPAP。

本发明还提供了一种检测GM-CSF抗体或诊断aPAP的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括标准品，所述标准品为上述GM-CSF自身抗体。

在本发明试剂盒中，所述标准品的浓度优选的为1μg/ml，在制备标准曲线时，优选的按照1:50-1:200的浓度进行稀释使用。采用本发明试剂盒进行ELISA检测时，检测步骤优选的为：将已知的GM-CSF抗原固著于96孔板上，完成后洗去多余的抗原；加入待测检体和梯度稀释的标准品，检体中若含有待测的抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结合；洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结合；洗去多余未结合二次抗体，加入酶底物使酶呈色，借仪器测定96孔板中的吸光值(OD值)，通过标准品绘制标准曲线，即可测量待测抗体的含量。上述洗去多余待测检体的溶液优选为乙酸铵溶液。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)肺泡灌洗液中总抗体纯化

取aPAP患者肺泡灌洗液100ml，12000rmp离心30min，取上清，使用HiTrap^TMrProteinAFF(cytiva，货号17508001)吸附柱吸附总抗体，用pH为2.2的甘氨酸溶液(盐酸调节pH)洗脱，收集流穿液和洗脱液，洗脱液即为肺泡灌洗液中的总抗体。收集的洗脱液用Tris-HCl溶液(pH 8)中和(洗脱液：Tris-HCl溶液的体积比为5:1)。

(2)GM-CSF蛋白偶联NHS柱

GM-CSF抗原原核表达：在NCBI上查找GM-CSF蛋白基因信息，根据蛋白基因(来自于NCBI，>M11220.1:33-467Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)mRNA，具体序列如SEQ ID NO.1所示)设计引物两端添加ExoRI和XhoI酶切位点(用于PCR扩增)并交由生工生物合成GMCSF基因。用合成回来的基因作为模板，用设计好的引物进行扩增，得到含有GMCSF基因的PCR产物并回收纯化。用ExoRI和XhoI两个内切酶同时对PET32a质粒和回收的PCR产物进行双酶切。将酶切之后的质粒和PCR产物跑胶，切胶回收。将回收之后的质粒片段和PCR片段用T4连接酶进行连接。将连接之后的产物转化DH5α感受态并涂氨苄平板，37℃过夜培养。第二天从平板上挑取5个左右的单克隆送测序。将测序之后的序列与GMCSF序列进行比对，将比对正确的克隆接种在2YT培养基中过夜摇菌。第二天对摇的菌液提取质粒，并将提取的质粒转化BL21(购买自thermo)感受态，涂氨苄平板过夜培养。第二天从平板上挑选5个左右单克隆送测序。将测序比对正确的单克隆保存于-80℃，后续可用于蛋白表达实验。

将GM-CSF表达BL21菌株常温解冻，按照1:1000的比例接种于灭菌后的含100ug/ml氨苄青霉素的2YT培养基中，接种约10ml。将接种好的培养基放在恒温摇床中37℃，220rpm，过夜摇菌。过夜摇的菌液拿出，按照1:1000的比例(可适当增加菌液的比例，缩短摇菌时间)接种于含100ug/ml氨苄青霉素的2YT培养基中，接种体积按照预期收获蛋白量设计，一般至少接种1L。恒温摇床37℃，220rpm，培养。当菌液的OD₆₀₀达到0.5-0.6时(摇动培养基可见菌液成云雾状)，向培养基中添加IPTG至终浓度为1mM，继续培养3-4h。培养结束收集菌液，8000rpm，4℃离心30min，弃上清，细菌沉淀PBS重悬。重悬的菌液倒入小烧杯中，冰上超声破碎(超声4s，间隔4s，功率400-600w，次数100-200次)，超声至菌液变澄清。8000rpm，4℃离心30min，收集沉淀用包涵体溶解液复溶，吹打均匀，4℃冰箱过夜。次日10000rpm，4℃离心30min，收集上清。使用仪器蛋白纯化系统AKTAAvant进行蛋白纯化，使用镍柱特异性吸附GM-CSF蛋白，平衡液：20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，10％甘油，8M尿素pH8.0。洗脱液：20mMTris-HCl，0.5M NaCl，10％甘油，500mM咪唑，浓缩洗脱液得到纯化的GM-CSF蛋白。将获得的纯化GM-CSF蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(获得的纯化GM-CSF蛋白的上样量分别为5μg和10μg)，结果如图1所示。由图1的page胶结果可以看出，上述构建的GM-CSF原核表达质粒表达的GM-CSF蛋白大小为32.5KD，与预期蛋白的大小一致且纯度较高。

将上述纯化获得的GM-CSF蛋白偶联至NHS柱(北京慧德易，货号：HZ1002100)，具体步骤为：将亲和蛋白凝胶NHS 4FF填料填充至1mL亲和层析柱，取用前摇匀，1mL移液枪搅拌吸取1-2mL装柱，静置分层，不断加填料直至填料加满。以10倍柱体积活化液(1mM HCl，pH3.0，使用前4℃预冷)活化填料，10倍柱体积偶联液(0.2M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH 8.3)冲洗填料，1mL偶联液(同上)溶解GM-CSF蛋白加入NHS柱，室温偶联1-2h(或4℃偶联过夜)。10倍柱体积封闭液(0.1M Tris-HCl，0.5MNaCl，pH 8.3)冲洗，10倍柱体积洗脱液(甘氨酸-HClpH 2.2-2.5)洗脱，10倍柱体积封闭液冲洗，室温静置1h，重复此步骤一遍(洗脱-封闭-洗脱)，PBS平衡NHS柱，即得GM-CSF蛋白偶联NHS柱。GM-CSF蛋白偶联NHS柱填装好即时可用。

(3)肺泡灌洗液总抗体中的GM-CSF抗体纯化

将步骤(1)中肺泡灌洗液总抗体样品过步骤(2)的GM-CSF蛋白偶联NHS柱，GM-CSF抗体结合至GM-CSF蛋白偶联柱，收集流穿液，然后100％甘氨酸溶液(pH2.0，盐酸调pH)洗脱，待(蛋白纯化系统AKTAAvant)仪器出峰后收集洗脱液，此洗脱液即为纯化的GM-CSF自身抗体。收集的洗脱液用Tris-HCl溶液(pH8)中和(洗脱液：Tris-HCl溶液5:1)。本步骤使用甘氨酸梯度洗脱时，出现两个洗脱峰，分别收集两个峰的洗脱液，ELISA检测收集的抗体均能结合GM-CSF蛋白，说明本发明方法制备的为与GM-CSF结合力不同的抗体，为多克隆抗体，能够收集与NHS柱结合的所有GM-CSF抗体。

为证实采用本发明上述方法制备所得的GM-CSF自身抗体的活性，特进行下述试验：

将TF-1细胞按8×10⁴个细胞接种至96孔板中，其培养基内含有2ng/ml GM-CSF。设置不同的GM-CSF自身抗体浓度，用于中和GM-CSF，以不含GM-CSF自身抗体的完全培养基培养细胞作为阳性对照，以不含GM-CSF和GM-CSF自身抗体的培养基培养细胞作为阴性对照，每孔设置3个复孔。培养72h后，加入6×Celltiter Blue染液，继续培养3h，用酶标仪以560nm激发，收集590nm处发射光。以阳性对照和阴性对照组校正数据，计算IC₅₀。本发明上述方法制备所得的GM-CSF自身抗体经体外实验和生物方法验证得TF-1细胞生长抑制率IC₅₀＝0.1620μg/ml，表明本发明上述方法制备所得的GM-CSF自身抗体具有显著活性。

实施例2

一种检测GM-CSF抗体或诊断aPAP的ELISA试剂盒

直接购买：包被缓冲液(G-CLONE，PN4600-500mL)、乙酸铵(赛尔斯)、显色液TMB(G-CLONE，PN3212-100ml×2)、ELISA终止液(G-CLONE PN4620-500ml)、酶标板(博士伦)、BSA(西格玛Sigma，V900933-100G)、TWEEN20(索莱宝，T8220-100)、脱脂奶粉(coolaber，CN7861-100G)、加样槽(G-CLONE)。

自配：使用前24h以内配制，现配现用

样品稀释液：PBS+1％wt/vol BSA+0.1％v/vTween20；洗液PBST：PBS+0.05％Tween20；封闭液(3％脱脂奶粉):0.3g脱脂奶粉+10ml PBST。

仪器：37℃恒温箱；酶标仪；200μl排枪；1ml移液枪；200μl移液枪；20μl移液枪；2μl移液枪。

实施例1步骤(2)制备的GM-CSF 500μg/ml；实施例1制备所得的Anti-GM-CSF(GM-CSF自身抗体)50μg/ml(使用浓度1μg/ml)；二抗(羊抗兔，sigma)稀释比例1:10000(样品稀释液稀释)

(1)将实施例1步骤(2)制备的GM-CSF经稀释后分装，用包被缓冲液稀释成1μg/ml，然后在ELISA板(博士伦)上每孔加入100μl含有GM-CSF的包被液，封口后4℃过夜。

(2)使用时将板恢复室温，弃去包被液，PBST洗板3次后，每孔加入100μl封闭液(3％脱脂奶粉)，37℃下封闭2小时；

(3)封闭结束后将板取出，PBST洗板3次后加肺泡灌洗液待测样品和实施例1制备所得的Anti-GM-CSF标准品，样品经稀释液稀释后加到孔内，血清稀释10000倍检测。每孔100μl，加样后将板置于37℃下孵育1小时；

(4)孵育结束后将板取出，PBST洗板3次后每孔加入100μl乙酸铵缓冲液(浓度为10mM，pH为5-6，4℃保存)，室温下水平摇床作用15分钟；

(5)洗板3次后，每孔加入100μl第二抗体稀释液(1:10000)(sigma)，置于37℃下孵育1小时；

(6)洗板5次后，每孔加入100μl显色液，置于37℃下避光作用15分钟，每孔加100μl终止液后酶标仪(thermo)读数。

标准曲线制备：

取Anti-GM-CSF标准品(实施例1制备所得，1μg/ml)分别按照稀释成40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0ng/ml，每孔100μl，加入封闭液封闭之后的96孔板(步骤3)。

对比例1

与实施例2不同之处在于酶标板包被的GM-CSF蛋白为从义翘神州购买的商品化GM-CSF蛋白，其余均同实施例2。以PBS溶液为NC组，对相同的肺泡灌洗液进行ELISA检测，结果如图2所示。由图2可以看出，在包被相同量的蛋白(1μg/ml，100μl/孔)的情况下，实施例1步骤(2)原核表达制备的GM-CSF蛋白与义翘神州购买的商品化GM-CSF蛋白具有相同的与肺泡灌洗液中抗体的结合能力。

实施例3

用实施例2的ELISA试剂盒检测实施例1步骤(1)中ProteinA流穿液和洗脱液和步骤(2)中GM-CSF蛋白偶联NHS柱流穿液和洗脱液中GM-CSF抗体的含量。以aPAP患者肺泡原液为对照组，以甘氨酸洗脱液为NC组，结果如图3所示。由图3可以看出，ProteinA流穿液不显色，说明ProteinA柱可以将肺泡灌流液中的抗体全部纯化出来，GM-CSF抗体纯化至ProteinA柱洗脱液中的总抗体中；NHS流穿液不显色，说明偶联了GM-CSF蛋白的NHS柱子可以将ProteinA纯化后总抗体溶液中的抗GM-CSF抗体全部纯化出来。

实施例4

采用实施例2的ELISA试剂盒检测不同稀释浓度实施例1制备所得anti-GM-CSF抗体的吸光度值，以确定将实施例1制备所得的GM-CSF自身抗体用作标准品时，标准品的使用浓度。以PBS溶液为NC组。结果如图4所示。在包被相同量的蛋白(1μg/ml，100ul/孔)的情况下，本发明制备的anti-GM-CSF抗体在1:50-1:200的稀释度下有高的吸光度，可以用做使用浓度，在1:500-1:2000稀释度下虽然有吸光度，但是吸光度值不高，为了确保检测结果的准确性，确定GM-CSF自身抗体用作标准品时的稀释使用浓度为1:50-1:200。

实施例5

与实施例1的不同之处在于步骤(3)中洗脱液甘氨酸溶液的pH值分别为3、4、5，其余均同实施例1。采用实施例2的ELISA试剂盒对同一稀释浓度的GM-CSF自身抗体进行检测，结果如图5所示。在包被相同量的蛋白(1μg/ml，100ul/孔)的情况下，甘氨酸溶液pH为2-3时洗脱NHS柱，纯化的anti-GM-CSF抗体有较高的吸光度，提取的浓度和纯度较高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种制备GM-CSF自身抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：将aPAP患者肺泡灌洗液过ProteinA吸附柱，采用pH 2.2-2.5的甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱液即为肺泡灌洗液总抗体；将肺泡灌洗液总抗体过GM-CSF蛋白偶联的NHS柱，采用pH 2.0-3.0的甘氨酸溶液洗脱，待可检出峰后收集洗脱液，此洗脱液即为纯化的GM-CSF自身抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，GM-CSF蛋白偶联的NHS柱的制备方法包括如下步骤：将亲和蛋白凝胶NHS填料填充至亲和层析柱，活化液活化后用偶联液冲洗，将偶联液溶解的GM-CSF蛋白加入NHS柱进行偶联，封闭平衡后，即得GM-CSF蛋白偶联的NHS柱。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述活化液为pH值为3.0的1mM HCl；所述偶联液为0.2M NaHCO₃和0.5M NaCl的混合液，偶联液的pH值为8.3。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述封闭为先用封闭液进行冲洗，洗脱液洗脱后再次用封闭液冲洗；所述封闭液为0.1M Tris-HCl和0.5MNaCl的混合液，封闭液的pH值为8.3；所述洗脱液为pH值2.2-2.5的甘氨酸-HCl溶液。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述GM-CSF蛋白为BL21菌株原核表达的GM-CSF抗原。

6.权利要求1-5任意一项所述方法制备的GM-CSF自身抗体。

7.权利要求6所述GM-CSF自身抗体在制备检测GM-CSF抗体试剂盒或在制备aPAP诊断试剂盒中的应用。

8.一种检测GM-CSF抗体或诊断aPAP的ELISA试剂盒，其特征在于，包括标准品，所述标准品为权利要求6所述GM-CSF自身抗体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的工作浓度为1μg/ml，按照1:50-1:200的浓度进行稀释使用。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括去除非特异结合的溶液，所述溶液为乙酸铵溶液。