CN117683714A - 一种记忆性t细胞高效体外扩增体系的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种记忆性T细胞高效体外扩增体系的构建方法，其中，将T细胞与中空纳米管阵列上高表达共刺激分子低表达PD‑L1的BMDC进行共培养。本发明还提供了中空纳米管系统在促进记忆性T细胞体外扩增方面的应用。本发明目的在于构建体外抗原特异性CD8+T，包含记忆性Tscm亚群细胞的快速扩增体系。本发明能显著促进抗原特异性CD8+T细胞的增殖。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种记忆性T细胞高效体外扩增体系的构建方法及其应用。
背景技术
基于肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrated lymphocytes,TILs)的过继性T细胞治疗(adoptive T-cell therapy,ACT)在宫颈癌、转移性乳腺癌、转移性结直肠癌和非小细胞肺癌(NSCLC)患者中获得了良好的疗效。TILs的ACT，首先需要将TILs从切除的肿瘤组织中分离出来，随后进行体外的扩增，达到一定数量后再回输至患者体内。TILs具有高度异质性，由T细胞(包括CD4+T细胞、CD8+T细胞)、B细胞、NK细胞等多种组成成分，由于CD8+T细胞高特异性的杀伤作用，是TILs过继性治疗的关键成分和主要目标。因此肿瘤特异性CD8+T细胞在回输的TILs中的比例极大地影响TILs ACT的疗效。此外，效应性CD8+T细胞的杀伤反应往往只能维持较短的时间，因此，TILs体外扩增过程中记忆性CD8+T细胞的诱导和维持决定了ACT疗效的持久性。最近越来越多的证据表明，干细胞样记忆T细胞(Stem cell-likememory T cell，Tscm)由于其在体内能长时间地维持和更新，与ACT的持久反应性密切相关。
目前临床常用的TILs体外扩增方法主要使用细胞因子IL-2作为培养基的添加物。首先加入高浓度的IL-2，对TILs进行预扩增；随后加入抗CD3抗体以及饲养淋巴细胞，在低浓度的IL-2下进行快速扩增。在IL-2培养条件下，非肿瘤特异性TILs和调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)在无倾向性扩增过程中也会发生扩增和富集，限制了TILs的肿瘤反应性。另一方面，TILs在IL-2培养条件下长期扩增过程中抗肿瘤功能的丧失和记忆表型的下降影响了ACT有效和持久的反应。
因此，需要开发创新的体外扩增策略来提升TILs中肿瘤特异性CD8+T细胞的比例，同时保持记忆表型，以获得精确和持久的治疗效果。体外将TILs与递呈新抗原的DC共培养是针对性促进肿瘤特异性CD8+T细胞富集的有效方式。值得注意的是，大部分肿瘤特异性CD8+T细胞包括记忆性Tscm亚型呈PD-1+，与DC表面PD-L1结合形成抑制信号，影响这群细胞的增殖。因此，上调DC表面共刺激分子的表达同时抑制PD-L1的水平是促进肿瘤特异性CD8+T细胞包括记忆性Tscm亚型细胞增殖的创新策略。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够促进T细胞体外扩增的记忆性T细胞高效体外扩增体系的构建方法。
为了实现以上目的，本发明提供了一种记忆性T细胞高效体外扩增体系的构建方法，其中，将T细胞与递呈特异性CD8+T细胞抗原表位的BMDC于中空纳米管阵列(HollowNano-pillar Array,HNA)上进行共培养。
优选地，所述中空纳米管阵列是中空Al2O3纳米管阵列。
优选地，所述中空纳米管阵列长度为3μm，密度为2×107/cm2。
优选的，所述中空纳米管阵列诱导BMDC高表达共刺激分子且低表达PD-L1。
优选地，所述方法还包括加入白细胞介素-2。
优选地，所述方法的具体步骤如下：
(1)分离诱导BMDC并培养；
(2)分离并提取T细胞：将1×106肿瘤细胞(MC38-OVA)接种至小鼠皮下，11天后，取腹股沟淋巴结，于70μm细胞筛网上研磨过滤后，1600rpm离心5min，分选得到T细胞；
(3)体外扩增：将2×104BMDC接种于平板、HNA上，12h后加入0.1μM COVA250-264，12h后弃培养基，PBS润洗3遍后加入8×105个分选出的T细胞进行共培养。
优选地，步骤(1)如下：取C57BL/6J小鼠的胫骨和股骨骨髓，经40μm筛网过滤得到单细胞悬液后，以ACK裂解液去除红细胞，随后以1×106/ml的细胞密度培养在含20ng/mlGM-CSF、10ng/mg IL-4的RPMI1640 10％FBS培养基中，2天后去悬浮细胞更换含10ng/mlGM-CSF、5ng/ml IL-4的新鲜培养基，继续培养2天后弃上清更换含10ng/ml GM-CSF、5ng/mlIL-4的新鲜培养基，第6天收取悬浮及贴壁松散的细胞进行后续实验。
优选地，在步骤(3)中加入白细胞介素-2进行共培养。
另一方面，本发明还提供了HNA上高表达共刺激分子且低表达PD-L1的BMDC在促进记忆性T细胞体外扩增方面的应用。
另一方面，本发明还提供了根据所述方法获得的功能性T细胞亚群。
本发明目的在于构建体外抗原特异性CD8+T，包含Tscm亚群细胞的快速扩增体系。本发明以临床常用方法添加细胞因子IL-2作为参照，共培养体系中BMDC以未刺激/LPS(脂多糖)刺激作为阴性/阳性对照。从MC38-OVA荷瘤小鼠淋巴结中的分选出T细胞与递呈了OVACD8+T细胞表位多肽的BMDC共培养，而后采用OVA257–264H-2Kb tetramer和抗CD8的抗体识别鉴定抗原特异性CD8+T细胞。
本发明的方法构建了一种抗原特异性CD8+T细胞的快速扩增体系，HNA上的BMDC预先经过新抗原刺激，为特异性的CD8+T细胞提供第一信号；共刺激分子高表达为CD8+T细胞的扩增提供强有力的共刺激信号，使得抗原特异性CD8+T快速激活和增殖，达到提升TILs中抗原特异性CD8+T的比例的目的；同时，BMDC上PD-L1低表达有利于PD-1高表达的Tscm(TCF1+PD-1+)细胞群的增殖。
相比仅投喂抗原未刺激的BMDC，与HNA上的BMDC共培养，能显著促进抗原特异性CD8+T细胞的增殖，在仅添加细胞因子IL-2的培养条件下，抗原特异性CD8+T细胞也能一定程度的扩增。联合IL-2细胞，HNA共培养体系能进一步促进抗原特异性CD8+T细胞的扩增。
此外，根据本发明构建的小鼠卵巢癌(ID8)腹腔转移模型，从腹腔肿瘤微环境中分离TILs进行体外扩增，以ID8细胞特异性抗原多肽ALVHDYFSVL(0.2μM)作为抗原，发现联合IL-2、HNA共培养体系也能进一步促进CD8+T的扩增。同时，相对仅添加IL-2组和与LPS刺激后的BMDC共培养组，HNA共培养体系扩增的CD8+T细胞中记忆性Tscm(TCF1+PD-1+)的比例更高，应用于ID8荷瘤小鼠的过继治疗获得了更为持久的疗效。
附图说明
图1示出HNA共培养体系促进抗原特异性CD8+T细胞的扩增。其中，a.MC38-OVA荷瘤小鼠淋巴结T细胞在体外扩增80h后，流式细胞术检测抗原特异性CD8+T细胞(OVA257–264H-2Kbtetramer+CD8+)的扩增情况；b.抗原特异性CD8+T细胞的数量统计，结果表明，HNA共培养体系中抗原特异性CD8+T细胞的数目显著高于阴性对照组，联合IL-2培养条件能进一步促进抗原特异性CD8+T细胞的增殖。
图2示出联合HNA共培养体系促进TILs中CD8+T细胞的扩增。其中，a.ID8腹腔转移模型中腹腔TILs在体外扩增80h后，流式细胞术检测CD8+T细胞的扩增情况；b.发生增殖的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的比例；c.发生增殖的CD8+T细胞的数量统计结果。
图3示出联合HNA共培养体系扩增的反应性CD8+T细胞(CD44+CD8+)中Tscm(TCF1+PD-1+)的比例更高。其中，a.CD44+CD8+T细胞TCF1和PD-1的表达情况；b.CD44+CD8+T细胞中记忆性Tscm(TCF1+PD-1+)亚群的比例。
图4示出联合HNA共培养体系扩增的TILs具有更持久的控瘤效果。其中，a.ID8荷瘤小鼠过继治疗方案流程示意图；b.接受治疗的小鼠肿瘤体积变化结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
实施例1.BMDC(小鼠骨髓来源树突状细胞)的培养
取C57BL/6J小鼠的胫骨和股骨骨髓，经40μm筛网过滤得到单细胞悬液后，以ACK裂解液(碧云天，C3702)去除红细胞，随后以1×106/ml的细胞密度培养在含20ng/ml GM-CSF、10ng/mg白介素4(IL-4)的RPMI1640 10％FBS培养基中，2天后去悬浮细胞更换含10ng/mlGM-CSF、5ng/ml IL-4的新鲜培养基，继续培养2天后弃上清更换含10ng/ml GM-CSF，5ng/mlIL-4的新鲜培养基，第6天收取悬浮及贴壁松散的细胞进行后续实验。
实施例2.MC38-OVA荷瘤小鼠淋巴结抗原特异性CD8+T细胞的体外扩增
(1)T细胞的分离和提取：将1×106MC38-OVA(过表达OVA的小鼠结肠癌的稳转细胞株)接种至C57BL/6J小鼠皮下，11天后，取腹股沟淋巴结，于70μm细胞筛网上研磨过滤后，1600rpm离心5min，用Easysep mouse CD90.2阳性选择试剂盒分选得到T细胞。
(2)体外扩增：分为单独培养体系(NC(阴性对照)，IL-2)、共培养体系(COVA250-264，LPS，HNA)和联合共培养体系(IL-2(COVA250-264)，IL-2(LPS)，IL-2(HNA))。共培养体系为BMDC和T细胞共培养，联合共培养体系在共培养同时加IL-2(2ng/ml)。HNA为中空Al2O3纳米管阵列(Hollow Nano-pillar Array)，长度为3μm，密度为2×107/cm2。HNA以厚度为25μm，孔径为200nm、密度为2×107/cm2的聚碳酸酯(PC)多孔膜(厂家：Parafilm，货号：1000M25/720N101/A4)为基底，经原子层沉积、反应离子刻蚀、等离子体刻蚀等工艺制备。
COVA250-264多肽的具体序列为CSGLEQLESIINFEKL，结构式为：
共培养条件：将2×104BMDC接种于平板、2×107/cm2，3μm的HNA上，12h后加入COVA250-264(0.1μM)，同时以平板上的BMDC加入TLR4激动剂LPS(100ng/ml)作为阳性对照，12h后弃培养基，PBS润洗3遍后加入8×105分选出的T细胞进行共培养，80h后收集上清中的T细胞，PBS清洗一遍，以Zombie Violet(1：100体积比稀释至PBS中，室温15min)染色以排除死细胞，以荧光标记anti-CD8、OVA257–264H-2Kb tetramer冰上染色1h(以1：100稀释至5％FBS的PBS中)，随后用含5％FBS的PBS清洗3次，200μl PBS重悬，300目筛网过滤后用流式细胞术检测，每个样品的收集时间为2min。
结果如图1所示。图1示出HNA共培养体系促进抗原特异性CD8+T细胞的扩增。其中，a.MC38-OVA荷瘤小鼠淋巴结T细胞在体外扩增80h后，流式细胞术检测抗原特异性CD8+T细胞(OVA257–264H-2Kb tetramer+CD8+)的扩增情况；b.抗原特异性CD8+T细胞的数量统计，结果表明，HNA共培养体系中抗原特异性CD8+T细胞的数目显著高于阴性对照组，联合IL-2培养条件能进一步促进抗原特异性CD8+T细胞的增殖。
3.ID8(小鼠卵巢癌)腹腔TILs的体外扩增和表型检测
(1)TILs的提取和分离：将4×106ID8细胞接种至C57BL/6J腹腔内，8天(体外扩增)/13天(表型检测)后，腹腔注射5ml RPMI1640，轻柔腹部3min后，注射器抽出灌洗液，1600rpm离心5min收集细胞，用Easysep mouse CD90.2阳性选择试剂盒分选得到T细胞。
(2)体外扩增：分为单独培养体系(IL-2)和联合共培养体系(IL-2+ALV，IL-2+ALV+LPS，IL-2+ALV+HNA)，其中ALV代表ID8细胞特异性抗原CD8+T细胞表位多肽ALVHDYFSVL。预先将BMDC培养在平板，2×107/cm2，3μm HNA12h后，加入0.2μM ALV多肽，同时以平板上的BMDC加入TLR4激动剂LPS(100ng/ml)作为阳性对照。分选出的TILs细胞经细胞增殖示踪剂CFSE(终浓度为5μM)标记后以BMDC:T细胞＝1：20的比例与BMDC共培养80h。DRAQ7(1：500，室温15min)染色以排除死细胞，以荧光标记的anti-CD8(1：100)染色，具体步骤同上。随后流式细胞术分析CD8+T细胞CFSE的荧光强度。
结果如图2所示。图2示出联合HNA共培养体系促进TILs中CD8+T细胞的扩增。其中，a.ID8腹腔转移模型中腹腔TILs在体外扩增80h后，流式细胞术检测CD8+T细胞的扩增情况，通过CFSE荧光强度的序列减半情况测定细胞分裂，结果显示IL-2联合HNA共培养体系中，CD8+T细胞增殖最为充分；b.发生增殖的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的比例，相比仅添加IL-2，联合HNA共培养体系中，发生增殖CD8+T细胞的比例显著提升；c.CD8+T细胞的数量统计表明，IL-2联合HNA共培养体系中CD8+T细胞的总数目增加。
(3)表型检测：分组同体外扩增实验，预先将BMDC培养在平板、2×107/cm2，3μm HNA12h后，加入0.2μM ALV多肽，同时以平板上的BMDC加入LPS(100ng/ml)刺激作为阳性对照。分选出的TILs细胞经CFSE标记后以BMDC:T细胞＝1：40的比例与BMDC共培养80h。Zombieviolet(1：400，室温15min)染色以排除死细胞，以荧光标记的anti-CD8、anti-PD1进行细胞表面标志物的染色、具体步骤同上，洗涤离心后加入免疫染色通透液saponin(碧云天，P0095-500ml)，室温10min通透细胞膜，离心，以anti-TCF1(1:50稀释至saponin中)染色，室温1h，离心洗涤后加入200μl PBS重悬，300目筛网过滤后流式细胞术检测，分析增殖的CD8+T细胞各指标的荧光强度。
结果如图3所示。图3示出联合HNA共培养体系扩增的反应性CD8+T细胞(CD44+CD8+)中Tscm(TCF1+PD-1+)的比例更高。其中，a.CD44+CD8+T细胞TCF1和PD-1的表达情况；b.CD44+CD8+T细胞中TCF1+PD-1+的比例。流式细胞术检测扩增的CD44+CD8+T细胞中Tscm(TCF1+PD-1+)的比例，IL-2联合HNA共培养体系中CD44+CD8+T细胞中Tscm(TCF1+PD-1+)的比例更高。
实施例4.TILs应用于ID8肿瘤的过继治疗
将2×106ID8细胞接种至C57BL/6J小鼠皮下，于第4天监测肿瘤大小，随后将荷瘤小鼠分为对照(Control)组和过继治疗组。其中过继治疗组根据不同条件下富集的TILs具体分为IL-2组、IL-2(LPS)组和IL-2(HNA)组。in和out分别代表等量输入TILs体外扩增获得的TILs，和等量输出的TILs介导的过继治疗。因IL-2(LPS)和IL-2(HNA)条件下等量输入的TILs经体外扩增后得到几近相同数目的TILs，因此将两组合并，示为in/out。随后将体外扩增的TILs细胞回输至过继治疗组荷瘤小鼠体内，其中IL-2，in组小鼠接受约1×105数目的TILs，而IL-2，out和IL-2(LPS)以及IL-2(HNA)三组小鼠接受2×105数目的TILs。随后每隔4天观测肿瘤大小情况。ID8荷瘤小鼠过继治疗方案流程如图4中的a所示。
结果如图4中的b所示，可见，与对照组相比，接受治疗的小鼠肿瘤体积减小，本发明得到的TILs可有效应用于ID8肿瘤的过继治疗。
Claims (10)
1.一种记忆性T细胞高效体外扩增体系的构建方法，其特征在于，所述方法包括将T细胞与递呈特异性CD8+T细胞抗原表位的BMDC于垂直中空纳米管阵列上进行共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纳米管阵列是中空Al2O3纳米管阵列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述中空纳米管阵列长度为3μm，密度为2×107/cm2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纳米管阵列诱导BMDC高表达共刺激分子且低表达PD-L1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括加入白细胞介素-2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
(1)分离诱导BMDC并培养；
(2)分离并提取T细胞：将1×106肿瘤细胞接种至小鼠皮下，11天后，取腹股沟淋巴结，于70μm细胞筛网上研磨过滤后，1600rpm离心5min，分选得到T细胞；
(3)体外扩增：将2×104BMDC接种于平板、中空纳米管阵列上，12h后加入0.1μMCOVA250-264，12h后弃培养基，PBS润洗3遍后加入8×105个分选出的T细胞进行共培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)如下：取C57BL/6J小鼠的胫骨和股骨骨髓，经40μm筛网过滤得到单细胞悬液后，以ACK裂解液去除红细胞，随后以1×106/ml的细胞密度培养在含20ng/ml GM-CSF、10ng/mg IL-4的RPMI1640 10％FBS培养基中，2天后去悬浮细胞更换含10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4的新鲜培养基，继续培养2天后弃上清更换含10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4的新鲜培养基，第6天收取悬浮及贴壁松散的细胞进行后续实验。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中进一步加入白细胞介素-2进行共培养。
9.中空纳米管阵列上高表达共刺激分子且低表达PD-L1的BMDC在促进记忆性T细胞体外扩增方面的应用。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得的功能性T细胞亚群。
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