CN117660506A - 针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用。本发明的质粒以R6Kγorigin自杀复制子为基础，设有蔗糖致死基因sacB用于逆向筛选，并有绿色荧光蛋白基因sfgfp、卡那霉素抗性基因kanR或潮霉素抗性基因hygR供基因编辑的多个阶段筛选；辅以同源臂克隆位点以及一系列调控元件。该方法通过构建与目标碱基或基因上下游序列相同的DNA片段实现同源重组以及sacB、sfgfp、kanR等基因筛选获得目标菌株，克服了目前针对多重耐药阴性菌基因编辑耗时长、效率低的问题。本发明可根据目标菌株耐药情况理性选择质粒携带的抗性基因，拓宽了编辑范围，且解决了CRISPR相关系统DNA双键断裂导致质粒丢失的问题，在多重耐药菌的机制研究与资源利用中有着广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用。
背景技术
细菌感染(Bacterial infection)是致病菌或条件致病菌侵入血循环引起的急性全身性感染，对人类健康、畜牧业等都有不同程度的威胁。而在治疗细菌感染与动物养殖的过程中，由于抗菌药物的滥用，细菌抗生素耐药性的形成加速，导致多重耐药菌(MultipleDrug Resistant Organism，MDRO)的产生并使细菌感染带来的死亡负担加重。细菌耐药性已成为全球人口公共卫生的巨大威胁，在中国的形势尤其十分严峻，给患者的救治带来了严重的挑战，阐明耐药性发生与传播的机制并基于机制研发耐药性干预策略刻不容缓。直接分离自临床、动物、环境一线的多重耐药菌是开展机制研究的最佳对象，然而在此类多重耐药菌中开展机制研究的最大障碍是高效基因编辑技术的缺失。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列，是细菌和病毒等入侵DNA长期竞争中进化产生的适应性免疫系统。由其发明的CRISPR-Cas基因编辑系统目前被广泛地运用在真核生物的基因编辑中。但是目前与CRISPR-Cas相关的基因编辑技术都是基于结构简单的ii类系统所开发，运用在不同条件下存在基因编辑的周期长、脱靶、对质粒编辑因涉及DNA双键断裂易造成质粒容易丢失等问题，因此目前仍极少应用于多重耐药菌的基因编辑。因此，由于缺乏能在多重耐药菌中直接进行高效基因编辑的工具，目前耐药机制仍主要是采用组学分析加在模式菌中的异源验证进行研究。这种脱离多重耐药菌遗传背景的研究策略大多数情况忽视了遗传背景本身对耐药因素的因素以及不同耐药因素相互间的关系，对阐明耐药性发生与传播的机制与研发耐药性干预策略无法提供的信息存在不同程度的偏倚。因此，开发一种简单高效、兼容分离自不同来源的多重耐药菌的基因编辑方法将有力助推这一关键领域的研究。
依赖于同源重组的传统基因编辑技术可将含有目的基因两侧同源序列的外源DNA片段导入宿主菌，然后通过核酸链间等位替换的方式对目的基因进行进行快速、高效、精确的修饰和编辑，但目前基于此原理的方法在多重耐药菌中的使用依然罕见。因此，发明一种分离自不同来源的多重耐药菌基于同源重组实现单碱基分辨率基因编辑的方法至关重要。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供了针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用的技术方案，本发明以pLGGE质粒为基础，而该质粒前体系统由R6Kγ复制起点、多重筛选标记基因、多克隆位点区、其他调控元件四部分核心基因元件构成，在多克隆位点区插入目的基因待编辑处两侧的同源片段实现完整功能性质粒的构建，利用供体菌E.coliGEDpir将pLGGE质粒接合转移至受体野生菌中，在特定抗生素筛选压力下进行目标基因待编辑处两侧的同源片段的重组，获得整合子菌株后进行sacB介导的逆向筛选，经测序验证后获得无痕编辑目标基因的突变株，此方法可以大大提高对多重耐药阴性菌基因编辑的效率，减少时耗且应用前景广泛。
本发明具体采用以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，所述的质粒上设有蔗糖致死基因sacB，用于逆向筛选；
所述质粒上设有抗菌素抗性标记基因；
所述质粒上设有编码绿色荧光蛋白sfGFP的基因sfgfp，具有更好的折叠性与稳定性，在基因编辑的多个阶段辅助克隆筛选；
所述质粒上设有M13同源臂克隆位点，用于插入感兴趣的基因；
所述质粒上设有R6Kγorigin，缺失复制关键蛋白π的编码基因pir，R6Kγorigin只能在特定的可以提供π蛋白的菌株中复制，在非pir+菌株中无法复制，仅携带R6Kγorigin的质粒会成为自杀质粒；
所述质粒上设有oriT，用于接合转移；
所述质粒上设有启动子、核糖体结合位点和终止子。
进一步，所述抗菌素抗性标记基因包括卡那霉素抗性标记基因kanR、潮霉素抗性标记基因hygR中的至少一种。
进一步，所述质粒上设有启动子BBa_J23105、核糖体结合位点T7-gene-10RBS和终止子BBa_B1001、BBa_B1002。
其中，启动子BBa_J23105、核糖体结合位点T7-gene-10RBS，具有相对较强的启动活性，提供组成型表达；终止子BBa_B1001阻断sacB基因和sfgfp基因的泄漏表达，降低质粒适应性代价；终止子BBa_B1002阻断上下游插入片段中启动子的转录，降低sacB基因因这些启动子驱动过表达带来的细胞毒性。
本发明第二方面提供了一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒的构建方法，其包括如下步骤：
S1：以含有蔗糖致死基因sacB的质粒为模板，扩增得到蔗糖致死基因sacB片段；
S2：以含有sfgfp基因的的质粒为模板，扩增得到sfgfp片段；
S3：以含有抗菌素抗性标记的质粒为模板，扩增得到抗菌素抗性标记基因片段；
S4：以pKNG101质粒为模板，扩增得到oriT以及R6Kγorigin片段；
S5：利用特定引物，扩增得到M13同源臂克隆位点片段、sacB与M13同源臂克隆位点片段的衔接片段；
S6：通过Gibson连接将上述片段与启动子、终止子按序连接，无缝克隆组装得到所述的用于靶点基因及片段编辑的带有逆向筛选标记的pLGGE质粒；
S7：将构建好的pLGGE连接产物转化至E.coliGEDpir感受态细胞中筛选、验证得到供体菌株E.coli GEDpirpLGGE。
进一步，所述pLGGE质粒的受体菌为大肠杆菌。
本发明第三方面提供了上述的质粒在针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑中的应用。
进一步，该应用具体包括如下步骤：
S01：利用引物扩增得到靶点基因上、下游同源臂，将以E.coliGEDpirpLGGEH基因组DNA为模板扩增的pLGGEH骨架片段连接并转化至E.coliGEDpir感受态细胞，筛选、验证得到供体菌株；
S02：将供体菌和受体菌混合培养后进行涂菌，筛选在抗生素抗性平板上能够正常生长且显绿色荧光的菌株，并进行菌落PCR验证，得到正确编辑的整合子菌株；
S03：将整合子菌株在不含有抗生素，含有蔗糖的培养基中，在30～40℃培养，筛选在含有蔗糖的平板上生长，且不显绿色荧光的的菌株，并进行菌落PCR验证，得到候选突变菌株；
S04：使用引物对候选突变菌株扩增，并将扩增子进行一代测序，测序结果正确的即为成功突变株。
进一步，培养基中蔗糖的含量为6～12％。
本申请提供的技术方法带来的有益效果包括：
本发明能在目标野生菌株的基因组中高效快速地实现基因编辑而不带有任何抗性标记，整个基因编辑过程预计耗时7天，并且可以平行进行多个基因编辑操作。该方法利用基因组双链断裂的反选以及精确的同源重组修复，利用抗生素正向筛选、sacB介导的逆向筛选以及在sfGFP的辅助下，可以大大提高获得突变菌株的效率，实现精准编辑。该方法的质粒系统构成完整且有效，可根据目标菌株耐药情况理性选择质粒携带的抗性基因，拓宽了编辑范围，且解决了CRISPR相关系统DNA双键断裂导致质粒丢失的问题，在多重耐药菌的机制研究与资源利用中有着广阔的前景。
附图说明
图1为针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的pLGGE质粒的构建图谱；A：pLGGEH质粒的模式图；B：pLGGEK质粒的模式图。
图2为利用pLGGEH质粒敲除tetA基因的原理图。
图3为对目标菌株的tetA基因敲除结果图；A：PCR鉴定结果图；B：PCR扩增产物测序结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，但本发明的实施方式不限于此，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1：pLGGE质粒的构建
以pLGGEK质粒为例(pLGGEK质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)：
针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的pLGGEK质粒的构建图谱如图1：B所示。
以含有蔗糖致死基因sacB的pKNG101(Kaniga et al,1991)质粒为模板，利用引物为P1702和P1844扩增得到蔗糖致死基因sacB片段(引物P1702携带启动子片段BBa_J23105)，所述蔗糖致死基因sacB片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
以含有sfgfp基因的pUA139质粒为模板，利用引物为P1842和P1834扩增得到GFP片段(引物P1834携带终止子片段BBa_B1001)，所述GFP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
以含有卡那霉素抗性标记的pET28a质粒为模板，利用引物为P1901和P1902扩增得到卡那霉素抗性标记片段；
以pKNG101(Kaniga et al,1991)质粒为模板，利用引物为P224和P1760扩增得到oriT以及R6Kγorigin片段，所述oriT以及R6Kγorigin片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
利用引物为P1980和P716扩增得到M13同源臂克隆位点片段，所述M13同源臂克隆位点片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
合成sacB与M13同源臂克隆位点片段的衔接片段，利用P1968与P1981扩增该片段，所述sacB与M13同源臂克隆位点片段的衔接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
通过Gibson连接将以上片段连接，片段较多时用上一步Gibson反应液为模板，将多个小片段合并为一个片段来提高Gibson的成功率。
将pLGGE连接产物转化至E.coliGEDpir感受态细胞中，涂布于含有二氨基戊二酸(Diaminopimelic acid，DAP，0.3mM)和卡那霉素抗性(卡那霉素100μg/ml)的LB平板，在37℃下培养至长出单菌落。
在470nm波长蓝光激发下，挑选呈绿色的菌落使用引物P715和P2342进行菌落PCR验证，挑选正确的克隆进行全质粒测序，获得菌株E.coliGEDpirpLGGEK。
构建过程中使用的引物序列如表1。
表1：构建pLGGEK与pLGGEH所需引物序列
表2：实施例1的PCR扩增条件
实施例2：基因编辑操作流程
以对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)Kp36质粒pIncFIIpCRY携带的tetA基因进行敲除为范例，一个完整的基因编辑流程主要包含以下几步：
1.pLGGEHΔtetA质粒的构建
用E.coliGEDpirpLGGEH(以pLGGEH质粒为模板，通过实施例1的方法得到，pLGGEH质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)基因组DNA为模板，利用引物P1341，P1342扩增pLGGEH骨架片段，利用引物P2154和P2155，以K.pneumoniae Kp36基因组DNA为模板，扩增tetA上游同源臂；利用引物为P2156和P2157，扩增tetA下游同源臂。将片段tetA上游同源臂、tetA下游同源臂和pLGGEH骨架片段通过Gibson连接，将连接产物转化到E.coliGEDpir感受态细胞中，在潮霉素(200μg/ml)+DAP(0.3mM)平板筛选能正常生长的菌株E.coliGEDpirpLGGEHΔtetA，在470nm波长蓝光激发下，挑选呈绿色的菌落使用引物P715和P716进行菌落PCR和测序验证。
2.整合子筛选
利用pLGGEH质粒敲除tetA基因的原理图如图2所示。将菌株E.coliGEDpirpLGGEHΔtetA(供体)和K.pneumoniae Kp36 pIncFIIpCRY(受体)在37℃过夜培养，供体菌和受体菌培养液各取20μl，混匀后滴于含DAP(0.3mM)的LB平板上，室温放干，将LB平板置于37℃5h，把菌团刮下，重悬于1mL液体LB培养基中，取100μl菌液涂在含潮霉素(200μg/ml)的固体LB平板上，37℃过夜培养，将平板置于蓝光切胶仪上，在470nm波长蓝光激发下，挑选呈绿色的菌落使用引物P716和P2158进行菌落PCR验证，获得pLGGEHΔtetA成功整合入tetA位点的整合子Kp36 pIncFIIpCRYpLGGEHΔtetA。
3.sacB介导的逆向筛选
将一轮交换菌株Kp36 pIncFIIpCRYpLGGEHΔtetA在含潮霉素的液体LB培养基中于37℃过夜培养，取过夜菌1mL，用无抗性液体LB培养基洗三次，加入至5mL无抗性液体LB培养基中，37℃培养4小时。取5μl培养液稀释至95μl无抗性液体LB培养基中，混合均匀，涂布于含羧苄青霉素和10％蔗糖的固体LB平板上(羧苄青霉素100μg/ml，无NaCl)，37℃过夜培养。挑选470nm波长蓝光激发下不呈绿色的菌落使用引物P2158和P2159进行菌落PCR验证，验证获得Kp36pIncFIIpCRYΔtetA候选菌株。
4.测序验证
使用引物P2158和P2159对Kp36 pIncFIIpCRYΔtetA进行PCR扩增，并将扩增子进行一代测序，结果如图3所示。测序结果正确的即为成功Kp36 pIncFIIpCRYΔtetA的突变株。整个基因编辑过程仅仅耗时7天，并且可以平行进行多个基因编辑操作。
构建过程中使用的引物序列如表2。
表2：构建pIncFIIpCRY携带的tetA基因敲除株所需引物序列
表3：实施例2的PCR扩增条件
以上实施例只是用以解释本发明的技术方案，并不用于限制本发明。虽然结合上述实施例对本发明进行了详细描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，仍然能够做到上述实施例。对实施例描述的技术方案进行修改，或者对实施例中的部分或者全部技术特征进行等同替换；这些修改或替换并不造成相应技术方案的实质脱离本发明实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述的质粒上设有蔗糖致死基因sacB，用于逆向筛选；
所述质粒上设有抗菌素抗性标记基因；
所述质粒上设有编码绿色荧光蛋白sfGFP的基因sfgfp；
所述质粒上设有M13同源臂克隆位点；
所述质粒上设有R6Kγorigin；
所述质粒上设有oriT；
所述质粒上设有启动子、核糖体结合位点和终止子。
2.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述抗菌素抗性标记基因包括卡那霉素抗性标记基因kanR、潮霉素抗性标记基因hygR中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒上设有启动子BBa_J23105、核糖体结合位点T7-gene-10RBS和终止子BBa_B1001、BBa_B1002。
4.如权利要求1所述的质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：以含有蔗糖致死基因sacB的质粒为模板，扩增得到蔗糖致死基因sacB片段；
S2：以含有sfgfp基因的的质粒为模板，扩增得到sfgfp片段；
S3：以含有抗菌素抗性标记的质粒为模板，扩增得到抗菌素抗性标记基因片段；
S4：以pKNG101质粒为模板，扩增得到oriT以及R6Kγorigin片段；
S5：利用特定引物，扩增得到M13同源臂克隆位点片段、sacB与M13同源臂克隆位点片段的衔接片段；
S6：通过Gibson连接将上述片段与启动子、终止子按序连接，无缝克隆组装得到所述的用于靶点基因及片段编辑的带有逆向筛选标记的pLGGE质粒；
S7：将构建好的pLGGE连接产物转化至E.coliGEDpir感受态细胞中筛选、验证得到供体菌株E.coli GEDpirpLGGE。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述pLGGE质粒的受体菌为大肠杆菌。
6.如权利要求1-3任一所述的质粒在针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
S01：利用引物扩增得到靶点基因上、下游同源臂，将以E.coliGEDpirpLGGEH基因组DNA为模板扩增的pLGGEH骨架片段连接并转化至E.coliGEDpir感受态细胞，筛选、验证得到供体菌株；
S02：将供体菌和受体菌混合培养后进行涂菌，筛选在抗生素抗性平板上能够正常生长且显绿色荧光的菌株，并进行菌落PCR验证，得到正确编辑的整合子菌株；
S03：将整合子菌株在不含有抗生素，含有蔗糖的培养基中，在30～40℃培养，筛选在含有蔗糖的平板上生长，且不显绿色荧光的的菌株，并进行菌落PCR验证，得到候选突变菌株；
S04：使用引物对候选突变菌株扩增，并将扩增子进行一代测序，测序结果正确的即为成功突变株。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，培养基中蔗糖的含量为6～12％。
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