CN117660464A

CN117660464A - 柑橘木虱唾液腺基因DcS21、其编码蛋白及其应用

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Publication number: CN117660464A
Application number: CN202311432042.8A
Authority: CN
Inventors: 喻修道; 邝印辉; 陈志勤; 上官超智; 周谷春
Original assignee: Gannan Normal University
Current assignee: Gannan Normal University
Priority date: 2023-10-31
Filing date: 2023-10-31
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明申请公开一种柑橘木虱唾液腺基因DcS21、其编码蛋白及其应用，旨在解决柑橘木虱难以无害化防治的技术问题，本申请筛选得到一种DcS21基因，获取自柑橘木虱的唾液腺转录组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请利用dsRNA处理沉默DcS21基因后，柑橘木虱的生存能力及其对寄主柑橘的致病力与对照GFP dsRNA处理组相比均显著降低，表明此基因在木虱的取食和侵染致病过程中具有重要作用，可作为植物抗木虱工程的靶标基因；本申请对于柑橘木虱致病机理研究以及抗木虱植物制备具有重大应用价值。

Description

柑橘木虱唾液腺基因DcS21、其编码蛋白及其应用

技术领域

本发明申请涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种柑橘木虱唾液腺基因DcS21、其编码蛋白及其应用。

背景技术

我国是世界第一大柑橘生产国，产量约占世界总产量的30%。柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB）是当前全球柑橘产业最具有毁灭性的病害，又称柑橘“癌症”。目前，尚未发现抗HLB柑橘品种，且对感病树体缺乏有效的治疗方法，只能砍掉病株减少传播菌源。我国HLB常年发生面积超过200万亩，其中江西、广东、广西、福建等柑橘产区面临着HLB的严重威胁。

柑橘木虱（DiaphorinacitriKuwayama）是传播黄龙病菌的最主要虫媒，而控制木虱虫口数量是防止黄龙病扩散成灾的关键措施之一。当前，柑橘木虱防控主要通过喷洒农药，而大规模和高频率使用农药造成了抗药性木虱、水土污染和药物残留等问题。因此，面对日益严重的柑橘黄龙病和环境问题，降低化学农药使用量，开发绿色无公害的柑橘木虱防控方法显得十分重要和迫切。

RNAi是由dsRNA介导的一种序列特异性转录后基因沉默机制；dsRNA进入生物体后被宿主细胞中的Dicer酶切割成21～23nt的siRNA（small interfering RNA）；siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencing complex，RISC），继之RISC以序列互补的方式与靶mRNA结合并使之降解，造成靶标基因表达量下降。

利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。研究发现，dsRNA有开发成为新型生物农药的潜力，同时在植物中表达dsRNA能特异抑制昆虫特定基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死，进而有效控制害虫。通过合理设计，RNAi技术兼具对靶基因的选择性强、对人畜及害虫天敌无毒害、不易使昆虫产生抗性等优点，该技术在柑橘木虱分子防治中显示很好的应用前景。

鉴于柑橘木虱能够对柑橘生产造成的巨大损失，且现有种质资源中缺乏有效的抗木虱基因，常规抗木虱育种也难以在短期内奏效。而利用RNAi技术对柑橘木虱进行分子防治是新的技术途径，对于保障我国柑橘生产具有重要的意义。RNAi靶标基因是利用RNAi技术提高植物抗虫性能的基础。然而现有高效RNAi靶标基因匮乏，特别是柑橘木虱取食相关的基因。因此，挖掘和鉴定新型抗木虱基因或木虱dsRNA，利用RNAi技术对柑橘木虱进行分子防治，对于保障我国柑橘生产具有重要的意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本申请的目的在于提供一种柑橘木虱唾液腺基因DcS21、其编码蛋白及应用，以解决柑橘木虱难以实现无害化防治的技术问题。

为解决上述技术问题，本申请采用如下技术方案：

筛选得到一个柑橘木虱唾液腺基因DcS21，ORF长度为459 bp，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。

得到编码所述柑橘木虱唾液腺DcS21基因的蛋白序列，长度为152个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

基于所述柑橘木虱DcS21基因核苷酸序列设计合成了一个dsRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述柑橘木虱DcS21基因或所述DcS21蛋白能够有效应用于柑橘木虱和/或黄龙病的防控中，或者用于制备防治柑橘木虱的制剂。

基于所述DcS21序列设计dsRNA或其片段，可使柑橘木虱摄入dsRNA片段影响其取食能力及致病力，从而起到防治柑橘木虱和/或黄龙病的作用。

上述编码基因、dsRNA，含有DcS21基因及其同源基因的重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、转基因植物或组织、重组菌、重组基因表达盒及其应用，均属于本发明构思范畴。

含DcS21基因的重组表达载体包括双元农杆菌载体，病毒载体，细菌表达载体及酵母表达载体等。含DcS21基因的载体在构建过程中，可以单独或者多个组合使用诱导型、组成型、增强型、组织特异型等；载体可以包括抗生素或抗化学试剂的抗性筛选标记，也可以含有产生颜色变化的酶，比如GUS、或者红色或绿色荧光蛋白等。

抑制DcS21基因的表达为本发明的构思范围，本发明构思还涉及用于抑制DcS21基因的表达的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制木虱对植物的取食和/或致病；用于抑制DcS21基因表达的物质具体可以为抑制DcS21基因表达的dsRNA，干扰载体，以及病毒载体等。

本发明通过基因沉默，将DcS21dsRNA导入木虱体内，测定了DcS21基因沉默对木虱存活的影响，实验结果表明DcS21基因经dsRNA处理沉默8天后，木虱的死亡率与对照GFPdsRNA相比增加了66%，表明该基因在柑橘木虱生存和致病等过程中发挥重要作用，可作为植物抗柑橘黄龙病的靶标基因。本发明对于柑橘木虱致病机理研究以及抗木虱植物的培育具有重大价值。

含有如下活性成分中的至少一种的产品也属于本申请的保护范围：

A、所述dsRNA；

B、重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒；

所述产品具有如下功能中的至少一种：

①防治柑橘木虱；

②降低柑橘木虱存活率；

③抑制柑橘木虱DcS21基因的表达。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1. 筛选得到一种柑橘木虱唾液腺基因DcS21，该基因与柑橘木虱的取食和存活率相关，可以利用该基因或其编码蛋白进行生物防控。

2. 基于DcS21序列合成的dsRNA，可以显著沉默柑橘木虱DcS21基因的表达，进而降低其存活率；该基因在柑橘木虱生物防治中显示很好的应用前景。

附图说明

图 1为本申请实施例中DcS21基因的扩增（M: D2000 plus DNA Ladder）。

图2为本申请实施例中DcS21基因在不同发育时期的表达分析。

图3为本申请实施例中DcS21基因在不同组织部位的表达分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中所用的试验材料、试剂及仪器：

本例实验材料中的柑橘木虱由赣南师范大学国家脐橙工程技术研究中心养虫室提供，饲养寄主是九里香；环境条件为温度（28±2）℃、湿度60%～80%、光周期L∶D=14∶10。

仪器：GeneAmp PCR System 9700、LC96荧光定量PCR仪、高速离心机、超低温冰箱、NanoDrop OneC超微量核酸测定仪、超净工作台、显微镜、镊子、移液器等。

药品和试剂：TaKaRa Trizol试剂、PrimeSTAR高保真聚合酶、TaKaRa凝胶回收试剂盒；T载体连接试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒均购自北京全式金公司；质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；T7 RiboMAX™ Express RNAi System试剂盒购自Promega公司；其它生化试剂购自上海生工生物工程有限公司。

实施例一、DcS21基因的克隆与表达分析

发明人前期对柑橘木虱唾液腺进行了RNA-seq分析，发现其中包含一个DcS21基因的完整开放阅读框（Open reading frame, ORF）。由此扩增得到DcS21基因的ORF，并对该基因在不同组织部位以及不同发育时期的表达趋势进行分析。

1. 柑橘木虱DcS21基因的ORF扩增

从饲养笼中收集100只柑橘木虱，在解剖镜下用镊子解剖出木虱的头部，然后利用Trizol提取柑橘木虱的RNA，EasyScript^®One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix反转录试剂盒合成cDNA第一链。

根据柑橘木虱唾液蛋白转录组得到的DcS21基因序列，通过软件Premier Primer5.0设计特异性引物，命名为DcS21 F1和DcS21 R1。以cDNA作为模板，DcS21 F1和DcS21 R1为引物，用PrimeSTAR高保真酶（Takara）扩增DcS21基因的ORF。

PCR的扩增产物Takara凝胶回收试剂盒进行回收纯化，与pEASY^®-Blunt克隆（全式金）载体连接，转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定。

DcS21 F1: 5′- ATGTTCAAGCTGTTAGTCC-3′；

DcS21 R1: 5′- CTAGTAGTAAGATCTTGTGACTG-3′。

以上述合成特异性引物进行PCR扩增，扩增得到接近459 bp的目的条带（图1）。切胶回收后，经过连接转化送至公司测序，得到了该基因的核苷酸序列（如SEQ ID NO: 1所示）。测序结果表明DcS21基因的开放阅读框长度为459 bp，预测编码152个氨基酸。

2. 柑橘木虱DcS21基因的表达分析

为了研究DcS21基因在柑橘木虱不同组织部位和发育时期的表达情况，对柑橘木虱进行了解剖镜下的样本采集。解剖了雌雄柑橘木虱的头部、腿部、翅膀、表皮和中肠等柑橘木虱的不同组织部位；在解剖镜下采集了不同阶段的木虱样本，包括卵、一龄若虫、二龄若虫、三龄若虫、四龄若虫、五龄若虫和雌雄柑橘木虱成虫。同样采用Trizol RNA 提取试剂盒上的操作提取柑橘木虱不同组织部位，以及不同发育时期的RNA。按照上述反转录试剂盒的说明进行操作，进行反转录合成cDNA。最后利用qRT-PCR的方法来检测柑橘木虱DcS21基因在不同组织部位和发育时期的的表达水平。所用引物为DcS21-F2和DcS21-R2，柑橘木虱的Actin基因（DcActin F和DcActin R）及GAPDH基因（DcGAPDH F和DcGAPDH R）作为qPCR内参，实时荧光定量所采用的试剂为PerfectStart^®Green qPCR SuperMix（全式金）。

qRT-PCR检测引物：

DcS21 F2: AACCCTAGCTCACCCTACTT；

DcS21 R2: TGGGTGCATATGGGTTGTAAG；

DcActin F: AGAAAGTACTCCGTGTGGATTG；

DcActin R: CGGACTCGTCGTATTCTTGTT；

DcGAPDH F: TGAGATCAAGGCCAAGGTAAAG；

DcGAPDH R:GTCAAAGATGGAGGAGTGAGTG。

结果如图2、图3所示，DcS21基因在柑橘木虱的各个发育时期均有表达，一龄和二龄若虫中表达量稍高，五龄的含量相对较低，但均未达到统计学显著水平。但是DcS21基因在柑橘木虱不同部位的表达量存在很大的差异，其中表皮中的表达量最低，头部的表达量最高，如在雌虫头部的表达量是表皮的242倍，但两性木虱中同一组织部位的表达量差异不大。鉴于DcS21基因来源于柑橘木虱唾液腺的转录组，以上结果预示该基因可能在头部的唾液腺中高量表达。

实施例二、柑橘木虱DcS21基因的dsRNA合成

（1）引物设计与dsRNA合成片段扩增

利用Primer Primer5.0软件设计引物DcS21 F3、DcS21 R3、DcS21-T7 F、DcS21-T7R，GFP-F、GFP-R、GDP-T7F、GFP-T7R，由上海生工公司合成。

DcS21 dsRNA合成引物：

DcS21 F3: TCTGCCTCCAGCACATT

DcS21 R3: GTACGGGCTGAACAAGG

DcS21-T7 F: ggatcctaatacgactcactatagggTCTGCCTCCAGCACATT

DcS21-T7 R: ggatcctaatacgactcactatagggGTACGGGCTGAACAAGG。

GFP dsRNA合成引物：

GFP F: ACAAGTTCAGCGTGTCCG

GFP R: TCACCTTGATGCCGTTCT

GFP-T7 F: ggatcctaatacgactcactatagggACAAGTTCAGCGTGTCCG

GFP-T7 R: ggatcctaatacgactcactatagggTCACCTTGATGCCGTTCT。

各引物序列中下划线处为T7 RNA聚合酶启动子序列。

以DcS21ORF质粒为模板，用DcS21 F3和DcS21-T7 R、DcS21-T7F和DcS21 R3引物分别扩增。扩增采用PrimeSTAR高保真酶（Takara），扩增程序为，98℃ 10 s，57℃ 15 s，72℃30 s；35个循环，4℃保存，扩增得到用于合成DcS21dsRNA的DNA片段。相同步骤，以16318hGFP质粒为模板，用GFP F和GFP-T7 R、GFP-T7 F和GFP R引物扩增得到合成GFPdsRNA的DNA片段。

（2）柑橘木虱DcS21基因和GFP的dsRNA的制备

将DcS21-F3和DcS21-T7 R、DcS21-T7 F和DcS21-R3扩增的2种DNA产物按照TaKaRaDNA产物纯化试剂盒说明书纯化。

将上述得到的2种纯化产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。参考Promega公司的T7 RiboMAX™ Express RNAi System试剂盒说明书进行以下步骤。dsRNA的体外转录体系为：

RiboMAX™ Express T7 2X Buffer* 10.0 μL

linear DNA template 8 μL

Enzyme Mix, T7 Express 2.0 μL

Total 20 μL

37 ℃ 孵育两小时后，将2个体系的产物混合。

dsRNA退火：70℃水浴10 min，冷却至室温。

dsRNA纯化：加1 μL（1:200无酶水稀释）RNase、1 μL RQ1，30℃孵育30min；加60 μL无酶水、10 μL醋酸钠、100 μL异丙醇，冰上5 min，12000 rpm 10 min；1 mL 75%酒精清洗沉淀，7500 rpm 5 min；室温通风橱20 min，加50 μL无酶水溶解dsRNA。按此步骤得到柑橘木虱DcS21dsRNA，其一条链的核苷酸序列为SEQID No. 3所示。用相同步骤得到GFPdsRNA，其一条链的核苷酸序列为SEQ ID No. 4所示。

取1 μL上述dsRNA，稀释10倍，剩余dsRNA 置于-20℃冰箱保存；取2 μL稀释后dsRNA用NanoDrop One^C超微量核酸仪测定浓度。

实施例三、dsRNA（DcS21dsRNA）在抑制柑橘木虱生长中的应用

1. dsRNA显微注射及柑橘木虱死亡率检测

柑橘木虱DcS21dsRNA注射组：取10头羽化3天的柑橘木虱进行注射，每头注射500ng的DcS21dsRNA，饲养在九里香植株。

柑橘木虱GFPdsRNA（dsGFP）注射组：取10头羽化3天的柑橘木虱进行注射，每头注射500 ng的dsGFP，饲养在九里香植株。

上述各组设置5个重复，置于人工气候箱（温度（28±2）℃，湿度60%～80%，光周期L∶D=14∶10）。每天统计各九里香中柑橘木虱的存活数。试验结果如表1所示。从该表1中可以看出，随着注射DcS21dsRNA的时间增加，柑橘木虱的平均死亡率随之增加，DcS21dsRNA处理4天、5天、6天、7天、8天、9天和10天后，柑橘木虱的平均死亡率为32%、52%、64%、70%、72%、72%和72%，与对照组GFPdsRNA相比均存在显著性差异（P<0.05）。其中DcS21dsRNA处理8天后，柑橘木虱的平均死亡率比对照组（dsGFP）高66%。

表1 柑橘木虱DcS21dsRNA和dsGFP组的死亡率

	Day1	Day2	Day3	Day4	Day5
						dsGFP	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	2 ± 4.47
dsDcS21	0 ± 0	6 ± 8.94	20 ± 17.32	32 ± 21.68^＊	52 ± 23.87^＊
							Day6	Day7	Day8	Day9	Day10
dsGFP	2 ± 4.47	2 ± 4.47	6 ± 8.94	6 ± 8.94	10 ± 10
						dsDcS21	64±29.66^＊	70 ± 30^＊	72 ± 25.88^＊	72 ± 25.88^＊	72 ± 25.88^＊

注：^＊表示与对照组（dsGFP）相比，试验组结果差异显著（t-test, n=5,P<0.05）。

2. dsRNA（DcS21dsRNA）抑制柑橘木虱DcS21基因的表达

利用Primer Primer5.0软件设计扩增DcS21基因的引物DcS21 F2和 DcS21 R2，内参基因Actin基因（DcActin F和DcActin R）及GAPDH基因（DcGAPDH F和DcGAPDH R）。

收集各组dsRNA显微注射后存活48h及96h柑橘木虱样品，Dc S21及GFP各4组，每组5只柑橘木虱。用宝生物Trizol试剂盒提取柑橘木虱的RNA；用全式金反转录试剂盒反转录成cDNA；稀释20倍后作为实时荧光定量PCR的模板，DcS21 F2和DcS21 R2作为引物，Actin基因（DcActin F和DcActin R）及GAPDH基因（DcGAPDH F和DcGAPDH R）为内参基因。

实时荧光定量PCR体系为：正向引物（10 μmol·L^-1）0.4 μL、反向引物（10 μmol·L-1）0.4 μL、2×PerfectStart^®Green qPCR SuperMix 10 μL、模板cDNA 4 μL，ddH2O 5.2μL。

PCR循环程序为95℃ 孵育10min；2步法95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；融解曲线95℃ 10 s，65℃ 1 min，97℃ 1 s。每个样本3个重复。

最终结果的计算采用2^-△△Ct法（Ct表示循环数）进行计算，结果如表2所示，DcS21dsRNA处理后，柑橘木虱DcS21基因在2d和4 d的表达量，与对照组（dsGFP）相比，依次降低了58%和70%，在统计学上表现为差异显著（P<0.05）。说明DcS21dsRNA能够在柑橘木虱体内引起DcS21基因的RNAi效应，致使柑橘木虱DcS21基因表达量明显降低，导致柑橘木虱死亡。

表2DcS21dsRNA和dsGFP处理后柑橘木虱DcS21基因相对表达量

	Day2	Day4
			dsGFP	1 ± 0.12	1 ± 0.13
dsDcS21	0.42 ± 0.16^＊	0.30 ± 0.11^＊

注：^＊表示与对照组（dsGFP）相比，试验组结果差异显著（t-test, n=4,P<0.05）。

上面结合附图和实施例对本申请作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本申请发明构思的前提下，所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，从而形成多个具体的实施例，均为本申请的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims

1.一种柑橘木虱唾液腺基因DcS21，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种柑橘木虱唾液蛋白DcS21，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.抑制权利要求1所述柑橘木虱唾液腺基因DcS21表达的dsRNA。

4.根据权利要求3所述的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA是由如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。

5.含有权利要求1所述DcS21基因的重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒。

6.权利要求1所述柑橘木虱唾液腺基因DcS21、权利要求2所述柑橘木虱唾液蛋白DcS21、权利要求3所述dsRNA或权利要求5所述重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒在如下（1）～（3）中至少一项的应用：

（1）防治柑橘木虱或制备防治柑橘木虱的产品；

（2）降低柑橘木虱存活率或制备降低柑橘木虱存活率的产品；

（3）抑制柑橘木虱DcS21基因表达或制备抑制柑橘木虱DcS21基因表达的产品。

7.含有如下活性成分中的至少一种的产品：

A、权利要求3所述dsRNA；

所述产品具有如下功能中的至少一种：

①防治柑橘木虱；

②降低柑橘木虱存活率；

③抑制柑橘木虱DcS21基因的表达。

8.一种防治柑橘木虱的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）基于权利要求1所述基因序列设计合成DcS21基因特异的dsRNA；

（2）使柑橘木虱摄入所述dsRNA，以影响柑橘木虱的取食进而降低存活率。