CN117660353A - 富含egf的外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种外泌体,该外泌体含有含量升高的表皮生长因子(EGF)。本公开还提供了该外泌体的制备方法。该外泌体可用于治疗与EGF相关疾病中,例如角膜损伤、烧烫伤、溃疡、手术等创面的修复和愈合,可预防疤痕增生。
Description
技术领域
本公开属于生物技术领域,具体涉及一种富含表皮生长因子(EGF)的外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)是一种分子量为134kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白。人类的的EGF蛋白编码基因位于人第4号染色体,由1207个氨基酸组成的多肽,属于生长因子家族的典型成员。它广泛表达在人体肾、胰腺、唾腺、皮肤、甲状腺、心、胆囊等多处组织和器官,在人体的病理生理过程中扮演着极其重要的角色。EGF是一个多结合位点的多效蛋白,可发挥多种生物学作用,包括具有多种生物学功能,尤其对细胞的增殖、分化和迁移作用显著,从而在器官发生发育和伤口修复中扮演重要角色。
近年来,EGF主要在溃疡和皮肤伤口愈合领域受到越来越多的关注。当EGF与受体结合后,激活下游信号通路,会产生多种生物学效应,包括:对不同来源的多种细胞,比如表皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞,均有强烈的促分裂活性,促进细胞内DNA、RNA和蛋白质的合成,能够加速组织的增殖与分化;促进胚胎细胞的增殖与分化,影响器官的发生发育;促进间质细胞的增殖,比如角膜内皮细胞,对角膜相关疾病具有一定的修复治疗价值。然而,EGF虽然具有多种方向的治疗皮肤修复的作用,EGF本身为一个多功能蛋白,分子量过大,不易吸收,制药难度大,难以用于临床治疗,因此开发一种具有靶向性治疗药物很有必要。
外泌体是一种细胞胞吐的纳米级细胞外囊泡(30~150nm),属于细胞的旁分泌介质之一。外泌体可以包含RNA、蛋白质和其他分子,由亲本细胞包装并发送给相连细胞用于细胞间的交流,由于其具有免疫原性低,毒性较低,并且能跨越血脑屏障等生物屏障等优势,可以将这些内容物递送到受体细胞,有助于蛋白发挥功能,调节生理功能。目前基于外泌体进入临床候选药物,用于治疗各种疾病。而现有技术中的间充质干细胞分泌的外泌体中携带的EGF含量很低,因此开发一种能够提高包含EGF水平的外泌体十分必要。
发明内容
本公开提供了一种富含表皮生长因子(EGF)的外泌体及其制备方法。本公开通过基因编辑间充质干细胞提高其合成EGF并分泌的基础能力,并通过多种方法鉴定确认了在外泌体中包裹高水平的EGF,解决了外泌体中只含有极少量EGF的问题。
本公开的一方面提供了一种外泌体,该外泌体含有含量升高的EGF。
在一些实施方式中,所述外泌体的EGF含量升高了20倍以上,例如为21倍以上、22倍以上、23倍以上、24倍以上、25倍以上、26倍以上、27倍以上、28倍以上、29倍以上、30倍以上、31倍以上、32倍以上、33倍以上、34倍以上或35倍以上。在一些具体实施方式中,所述外泌体的EGF含量升高了35倍以上。
在一些实施方式中,所述外泌体的EGF含量升高是相比于野生型间充质干细胞的外泌体的EGF含量升高。
在一些实施方式中,所述外泌体可以由宿主细胞,例如哺乳动物细胞产生。在一些实施方式中,所述宿主细胞可以由干细胞产生。在一些实施方式中,所述宿主细胞可以包括,但不限于,人胚胎肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HT-1080细胞、HeLa细胞、PERC-6细胞、CEVEC细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、上皮细胞和间充质干细胞(MSC)细胞。在优选的实施方式中,所述宿主细胞可以为间充质干细胞。在具体的实施方式中,所述间充质干细胞可以包括骨髓来源的MSCs、脂肪来源的MSCs、脐带血来源的MSCs。
本公开还提供了该外泌体的制备方法,所述方法包括以下步骤:(1)将编码EGF的核苷酸序列导入宿主细胞中;以及,(2)从所述宿主细胞的培养基中分离出外泌体。
在一些实施方式中,所述编码EGF的核酸序列位于慢病毒载体中。在具体的实施方式中,所述慢病毒载体包括含有ψ序列的5’LTR、3’LTR、在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列,以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列。
在一些实施方式中,所述EGF的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中,在步骤(1)中,使用所述慢病毒载体感染所述宿主细胞。
在一些实施方式中,所述3’LTR和5’LTR包括一个或多个修饰。
在一些实施方式中,所述5’LTR和3’LTR的U3可以被缺失或突变。
在一些实施方式中,所述3’LTR是缺失了U3区域的3’LTR(3’LTR-ΔU3)。
在一些实施方式中,所述5’LTR是缺失了U3区域的5’LTR(5’LTR-ΔU3)。
在一些实施方式中,所述5’LTR的启动子选自巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子,优选选自劳斯肉瘤病毒RSV启动子。
在一些实施方式中,与EGF的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1A(EF1α)启动子或其转录活性片段,RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子,优选选自短延伸因子1A(EF1α)启动子。
在一些实施方式中,EGF的编码核苷酸可操作连接有EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。
在一些实施方式中,所述慢病毒载体还包括筛选标记物的编码核苷酸。
在一些实施方式中,所述筛选标记物选自荧光素酶(Luciferase)、荧光蛋白、链霉亲和素结合肽、嘌呤霉素抗性标记物、氨苄抗性标记物、卡那霉素抗性标记物和新霉素抗性标记物中的一种或多种。优选地,所述筛选标记物为增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。
在一些实施方式中,所述慢病毒载体还包括SV40早期pA。
在一些实施方式中,所述慢病毒载体的转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
在一些实施方式中,所述慢病毒载体包含逆转录病毒输出元件。“逆转录病毒输出元件”是指调节RNA转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。优选地,所述逆转录病毒输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
在一些实施方式中,所述慢病毒载体还包括中央多聚嘌呤区(cPPT)或中心终止序列(CTS)。
优选地,所述cPPT序列为HIV1的cPPT。
优选地,所述CTS序列为HIV1的CTS。
在一些实施方式中,所述慢病毒载体从5’LTR区到3’LTR区依次包含:RSV启动子,5’LTR-ΔU3,Ψ序列,RRE,cPPT,EF1α启动子,Kozak翻译起始序列,EGF的编码核苷酸,EGFP,WRPE,3’LTR-ΔU3和SV40早期pA。
在一些实施方案中,所述宿主细胞能够表达所述慢病毒载体中携带的目的核苷酸。
在一些实施方案中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方式中,所述宿主细胞可以包括,但不限于,人胚胎肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HT-1080细胞、HeLa细胞、PERC-6细胞、CEVEC细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、上皮细胞和间充质干细胞(MSC)细胞。
在一些实施方式中,所述宿主细胞可以为干细胞。在优选的实施方式中,所述宿主细胞可以为间充质干细胞。在具体的实施方式中,所述间充质干细胞可以包括骨髓来源的MSCs、脂肪来源的MSCs、脐带血来源的MSCs。
在一些实施方式中,所述干细胞为转染有携带EGF编码核苷酸的所述慢病毒载体的人脐带间充质干细胞。
在一些实施方式中,步骤(2)中,干细胞的接种密度为1.0×105-2.0×105,优选为1.0×105。
在一些实施方式中,步骤(2)中,病毒转染复数MOI为10-30,优选为20-30。
在一些实施方式中,步骤(2)中,转染采用的辅助转染试剂选自聚凝胺(Polybrene)。优选地,Polybrene的工作浓度为5-8μg/mL。
在一些实施方式中,所述方法还包括采用超速离心法、过滤离心、密度梯度离心法、免疫磁珠法或PS亲和法等提取外泌体。相较于其他外泌体提取方法,超速离心法具有获得的外泌体量多的有优点,因此,超速离心法是更常用的外泌体提取方法。
在一些实施方式中,所述方法制备的外泌体具有高表达的EGF。因此,通过本公开的方法能够获得有效富集EGF的外泌体。
本公开还提供了一种药物组合物,所述组合物包含前述的外泌体或前述的的制备方法获得的外泌体,以及药学上可接受的赋形剂或载体。
本公开还提供了前述的外泌体、前述的方法制备的外泌体或前述的药物组合物在制备治疗创面修复和愈合、组织修复、伤口愈合或预防疤痕增生的药物中的应用。
在一些实施方式中,所述创面包括但不限于角膜损伤、烧烫伤、手术或慢性溃疡引起的创面等。
在一些实施方式中,本公开制备的外泌体可用于加快伤口愈合速度,提高伤口恢复质量,减小疤痕面积等。
本公开具有如下的有益效果:
1、本公开涉及的过表达EGF慢病毒载体设计简洁高效,感染效率高。
2、本公开涉及的过表达EGF慢病毒感染的间充质干细胞的外泌体富含显著提高的EGF;
3、本公开本公开公开制备的外泌体属于囊泡包裹着蛋白,相比于纯蛋白,更利于抗炎因子蛋白到达炎症细胞,从而被炎症细胞吸收;相比于间充质干细胞的细胞疗法,本公开外泌体具有无免疫原性和渗透性好等优点。
附图说明
图1显示了慢病毒过表达载体图谱。
图2显示了慢病毒转染的hUC-MSCs共聚焦显微镜观察转染效果。
图3显示了流式检测GFP表达的结果。
图4显示了电镜鉴定过表达空载体间充质干细胞外泌体以及EGF过表达间充质干细胞外泌体的形态。
图5显示了ELISA检测过表达空载体MSC外泌体以及EGF过表达MSC外泌体中EGF的含量,***P≤0.001,与MSC-Exo组相比。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本公开进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开,并不用于构成对本公开的任何限制。此外,在以下说明中,省略了对公知结构和技术的描述,以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义,否则本公开使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本公开所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的,将应用以下定义,并且在适当时,以单数形式使用的术语也将包括复数形式,反之亦然。
除非上下文另有明确说明,否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如,提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
外泌体(exosome)是由细胞内多泡体(multivesicular body,MVB)与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞,都可以产生并释放外泌体。它是一种直径为30~150nm的纳米级脂质包裹体结构,内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液和母乳,被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中,通过循环系统到达其他细胞与组织,产生远程调控作用。大部分外泌体含有MHC I类和/或II类分子、热休克蛋白(hsp)、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架蛋白、mRNA和其他非编码RNA以及各种代谢酶。外泌体的膜上包含不同的表面标记物,其中典型的是四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81。四跨膜蛋白可用于各种肿瘤和传染病的诊断。
慢病毒载体系统包括包装质粒,包膜质粒和载体质粒,并且可以为二质粒系统,三质粒系统或四质粒系统。三质粒系统是将慢病毒基因组中负责包装,逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离,再克隆到三个独立的质粒中,并去除了所有的辅助序列。四质粒系统是在三质粒系统的基础上改进而来的,与三质粒系统相比,第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上,新增一个质粒更增加了系统的安全性,第二个变化是将tat基因去除,并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR,以启动载体质粒的表达。此外,三质粒系统和四质粒系统还有一个可以放置目的基因序列的载体,称作载体质粒。
表皮生长因子(EGF)是肽生长因子EGF超家族的原型成员,编码前的蛋白经过蛋白水解处理以生成53-氨基酸表皮生长因子肽,组成53个氨基酸残基的单链多肽。EGF是由1217个氨基酸残基组成的前体,其前提通过蛋白质水解生成成熟的EGF。EGF是一种有效的有丝分裂因子,它通过与细胞表面受体——表皮生长因子受体(EGFR/ErbB)的高亲和力结合发挥作用。
ψ序列是慢病毒基因组的衣壳化所需要的最小包装信号。
“干细胞”是指未分化的细胞,其能够长期自我更新,或能够产生初始细胞的至少一个相同拷贝;在单细胞水平下分化成多个,且在一些情况下,仅一个特殊的细胞类型;以及实现组织的活体内功能性再生。根据干细胞细的发育潜力将干细胞细分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和寡能干细胞。
间充质干细胞(MSC)因其具有多向分化潜能和免疫调节功能,已被广泛用于再生医学、自身免疫性疾病的临床研究者。与其他干细胞,例如造血干细胞不同,MSC是一类在体外能够扩增的干细胞。在本申请中UMSC是从脐带获得的间充质干细胞,尤其是人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)。人脐带间充质干细胞是来源于新生儿脐带的间充质干细胞,具有强大的增殖及多向分化能力。但是本领域技术人员应该知晓间充质干细胞的来源不仅限于人脐带间充质干细胞,其它来源的间充质干细胞也可实现本公开。
下面提供实施例和附图以帮助理解本公开。但应理解,这些实施例和附图仅用于说明本公开,但不构成任何限制。本公开的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解,在不脱离本公开精神的情况下,可以进行任何修改和改变。
实施例1:重组干细胞制备
1、质粒构建
首先设计合成了过表达EGF慢病毒载体,载体设计图谱如图1所示,慢病毒载体从5’LTR区到3’LTR区依次包含:RSV启动子,5’LTR-ΔU3,Ψ序列,RRE,cPPT,EF1α启动子,Kozak翻译起始序列,EGF的编码核苷酸,EGFP,WRPE,3’LTR-ΔU3和SV40早期pA。载体在插入的EGF基因(SEQ ID NO:1)上游联用了EF1α启动子序列和Kozak翻译起始序列,确保了病毒质粒在干细胞内的高表达。所构建的慢病毒载体同时携带有增强型GFP序列,方便转染效率的观察。由于EGF序列长,上述元件已经达到慢病毒最大携载容量,无法再携带常规需要保留的药物筛选标记抗生素Puro序列,也无法再增加额外的信号肽、连接区或跨膜区序列。
分析插入序列以及载体骨架上的限制性内切酶位点,选择能切出合适条带的酶消化质粒DNA,将消化的DNA跑琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭EtBr染色,判断DNA片段的大小,设计靶向载体骨架和/或插入序列的引物。通过Sanger测序对核酸序列进行鉴定,比对完全正确,病毒载体质粒构建成功。
2、感染方法
病毒载体质粒构建成功后,进行病毒包装,然后转染hUC-MSCs。转导D0天,选择P4-P8代的hUC-MSCs,将细胞按1×105-2×105/孔密度接种到6孔板中,培养基为DMEM/F12+10%FBS,在37℃5%CO2的培养箱中培养18-20h后,待细胞密度融合为30%-50%时进行转染。转导当天(D1),在冰上解冻病毒液,轻柔混匀,按照MOI(MOI约为20)吸取病毒数,加入到培养基中轻柔混匀。培养基用量以覆盖培养基表面积为宜,用量为100μL/mL,6孔板中培养基用量为1mL/孔。吸出原有培养基,将添加了病毒的培养基加入到培养了hUC-MSCs的6孔板中。同时向每孔中加入5-8μg/mL的辅助转染试剂聚凝胺(Polybrene),混匀使病毒覆盖住每一处细胞,在37℃5% CO2的培养箱中培养6-8h,制备得到重组干细胞MSC-EGF。过度暴露于聚凝胺(Polybrene)会造成细胞中毒,因此转导时间不宜过长,否则可能会影响细胞状态。同时将带有空载体的病毒液作为空白对照以同样的方法进行转导,制备得到空白对照组野生型间充质细胞MSC。
实施例2、感染效率鉴定
转导后第二天,吸出含有病毒的培养基,加入新鲜的DMEM/F12+10%FBS培养基,在37℃5%CO2的培养箱中过夜培养。通常慢病毒携带的基因在转导第2天才开始表达,转染48-72h后可以观察到绿色荧光。每天观察荧光表达,在72h后共聚焦显微镜观察到GFP的绿色荧光蛋白的强表达(参见图2),计数绿色荧光的百分比,同时流式分析确认感染效率,结果显示MOI为20时有效感染率超过86%(参见图3)。
实施例3、外泌体的制备和鉴定
在15厘米盘中以含血清的培养基扩增实施例1制备的空白对照组野生型间充质细胞(MSC)和转染病毒的EGF过表达的脐带间充质干细胞(EGF-MSC)。在收集培养基前40小时,把含血清的培养基换成不含血清的底物培养基。以无血清培养基培养两种过表达间充质干细胞40小时后,收集培养基,同时,用加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞。
上清通过2000g离心力离心,去除细胞和死细胞,收集上清。上清再通过10000g离心力第二次离心,去除细胞碎片,收集上清。上清再通过167000g离心力进行第三次离心,得到沉淀,即外泌体。最后,用PBS洗一次,再进行167000g离心力第四次离心后,去除上清,加入200ul的PBS重悬,便得到脐带间充质干细胞过表达细胞系的外泌体。
提取出来的外泌体,通过Western Blot(WB)检测发现过表达空载体间充质干细胞提取出来的外泌体(MSC-Exo)和过表达EGF间充质干细胞提取出来的外泌体(EGF-MSC-Exo)都含有CD63、CD81、CD9和TSG101等外泌体通用标志物;通过制备电镜样品,拍电镜分析发现过表达空载体间充质干细胞和过表达EGF间充质干细胞提取出来的外泌体呈现为囊泡模样,符合外泌体的形态(参见图4)。
实施例3、外泌体分泌水平的鉴定
为确认间充质干细胞旁分泌外泌体中EGF的表达增加,利用酶联免疫吸附法(ELISA)进行分析。
将实施例1制备空白对照组野生型间充质细胞(MSC)外泌体和经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(MSC-EGF)外泌体,用适当的PBS重悬,获得样品。将100μL样品和不同浓度的标准品加入到已经用抗体包被过的板条中,每组三个孔。设置空白对照组。用封板胶纸封住板条,37℃,90min。用1×洗涤缓冲液工作液洗板5次。50μL/孔加入生物素化抗体工作液,盖上封板膜,37℃,90min。扣去孔内液,用1×洗涤缓冲液工作液洗板5次。100μL/孔加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(strptavidin-HRP)工作液,盖上封板膜,37℃,30min。洗板5次。100μL/孔加入TMB显色液,37℃,15min。100μL/孔加入终止液终止反应。用检测波长450nm读值,计算浓度。
结果如图5所示,说明感染EGF慢病毒后的间充质干细胞(MSC-EGF)相比于野生型间充质细胞(MSC)提取的外泌体包含水平明显升高的EGF,其中,EGF蛋白分泌从感染前1.2pg/mL升高到超过42.8pg/mL,分泌水平提高35倍以上。
本公开的技术方案不限于上述具体实施例的限制,凡是根据本公开的技术方案做出的技术变形,均落入本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种外泌体,所述外泌体含有含量升高的表皮生长因子(EGF),
优选地,所述外泌体的EGF含量升高了20倍以上,优选35倍以上。
2.权利要求1所述的外泌体的制备方法,所述方法包括以下步骤:(1)将编码EGF的核苷酸序列导入宿主细胞中;以及,(2)从所述宿主细胞的培养基中分离出外泌体。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述编码EGF的核酸序列位于慢病毒载体中,优选地,所述慢病毒载体包括含有ψ序列的5’LTR、3’LTR、在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列,以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述EGF的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述5’LTR的启动子选自巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子;和/或
与EGF的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1A(EF1α)启动子或其转录活性片段,RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子,优选选自短延伸因子1A(EF1α)启动子;
优选地,所述5’LTR的启动子选自劳斯肉瘤病毒RSV启动子;
优选地,所述EGF的编码核苷酸可操作连接有EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述慢病毒载体还包括筛选标记物的编码核苷酸、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE、逆转录病毒输出元件以及中央多聚嘌呤区(cPPT)或中心终止序列(CTS);
优选地,所述筛选标记物选自荧光素酶(Luciferase)、荧光蛋白、链霉亲和素结合肽、嘌呤霉素抗性标记物、氨苄抗性标记物、卡那霉素抗性标记物和新霉素抗性标记物中的一种或多种,优选为增强的绿色荧光蛋白(EGFP);
优选地,所述逆转录病毒输出元件选自人类免疫缺陷病毒rev应答元件RRE和乙型肝炎病毒转录后调节元件HPRE;
优选地,所述cPPT为HIV1的cPPT;
优选地,所述CTS为HIV1的CTS。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述慢病毒载体从5’LTR区到3’LTR区依次包含:RSV启动子,5’LTR-ΔU3,Ψ序列,RRE,cPPT,EF1α启动子,Kozak翻译起始序列,EGF的编码核苷酸,EGFP,WRPE,3’LTR-ΔU3和SV40早期pA。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述宿主细胞为干细胞,
优选地,所述干细胞为间充质干细胞,
更优选地,所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
9.药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1所述的外泌体或权利要求2-8任一项所述的方法制备的外泌体,以及药学上可接受的赋形剂或载体。
10.权利要求1所述的外泌体、权利要求2-8任一项所述的方法制备的外泌体或权利要求9的药物组合物在制备治疗创面修复和愈合、组织修复、伤口愈合或预防疤痕增生的药物中的应用,
优选地,所述创面包括角膜损伤、烧烫伤、手术或慢性溃疡引起的创面。
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