CN117652343A - 一种目标植物的菌根合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于技术领域，公开了一种目标植物的菌根合成方法，该方法首先将目标植物材料和辅助植物种子混合后共同栽种于无菌栽培基质，培养至均萌发出叶片，得目标植物幼苗和辅助植物幼苗；再将目的菌液接种到混生的目标植物幼苗和辅助植物幼苗根部；待辅助植物形成目的菌菌根后，去掉辅助植物植株的地上部分，继续培养15‑93天，即得目标植物的目的菌菌根；本发明适用于目标植物的目的菌菌根合成，通过辅助植物作为菌根合成的辅助材料，充分利用辅助植物易形成菌根的特点在目标植物根部形成目的菌菌群优势的同时，还提高目标植物的菌根侵染效率至95%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物农业技术领域，涉及菌根合成方法，具体地说是目标植物的菌根合成方法。
背景技术
目前，一些经济价值较高的食用菌多为菌根性食用菌，如松口蘑(Tricholomamatsutake)、意大利白块菌(Tuber magnatum)、松乳菇(Lactariusdeliciosus)、红汁乳菇(L.hatsudake)、玫黄黄肉牛肝菌（Butyriboletusroseoflavus）、美味牛肝菌(Boletus edulis)及块菌(Tuber)等，其生活史的完成，必须与活的目标植物的根系共生形成菌根，吸收植物光合作用产生的碳水化合物，同时从土壤中吸收养分。因此，如何促进菌根性食用菌和目标植物形成高侵染率“目标菌菌根富集型种苗”的菌根合成技术成为人工栽培菌根性食用菌的关键。
现有的菌根合成方法中，如公开号为CN101595803B的中国发明专利，公开了一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，采用马尾松种子作为目标植物材料，将食用菌菌丝体与无菌的菌根合成培养基质拌匀，平铺在一层无菌基质上，然后将马尾松种子直接播于培养容器中，经培育得到带菌根的植物小苗。首先，该类方法采用松科种子作为目标植物，虽然可成功侵染，但松科种子较小，能提供的营养有限；而若换成自身有足够营养的目标植物，则往往由于其侧根发育晚且不发达，导致菌根侵染率低下；其次，在实际生产应用中，为节省成本，基质的灭菌处理，往往是大批量进行的，需存储后待使用，而存放时间越久，越易被外界杂菌污染，导致目标菌根合成率低。此外，使菌丝体平铺于无菌基质后主动与宿主植物结合而形成共生的机制，也存在效率低下的问题。
发明内容
发明人在研究中还意外发现，菌根形成的重要规律是：种子及繁殖材料自身提供的营养越多，在菌根合成中菌根侵染率就越低；种子自身提供的营养越少，则在菌根合成中菌根侵染率就越高。
本发明要解决的技术问题，是要提供一种目标植物的菌根合成方法，提高自身有足够营养的目标植物菌根侵染率低下的问题。通过将单个种子重量在60mg以下的植物作为菌根合成中的辅助材料，充分利用其易被菌根真菌侵染形成菌根的优势，在目标植物的根部形成目标菌菌群优势，达到提高菌根侵染率的目的。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种目标植物的菌根合成方法，包括依次进行的以下步骤：
S1.将目标植物材料和辅助植物的种子混合后共同栽种于无菌栽培基质，培养至均萌发出叶片，获得目标植物幼苗和辅助植物幼苗；
S2.将目的菌液接种到目标植物幼苗和辅助植物幼苗的根部；
S3.待辅助植物形成菌根后，去掉辅助植物植株的地上部分，继续培养15-93天，获得目标植物的目的菌菌根；
所述目的菌液包括分离目的菌获得纯菌种后经发酵培养所得的菌液或目的菌的孢子液；
所述目标植物材料和辅助植物的种子均是经消毒处理后的无菌材料。
其中，所述目的菌液可以是分离目的菌获得纯菌种后经发酵培养18-25天，取发酵液，加水稀释300-800倍所得；
所述目的菌液还可以是取含孢子的目的菌，加入3-8倍重量的水，打碎，加水稀释300-800倍所得。
作为本发明的一种限定，所述目标植物为单个种子重量在0.1g以上的菌根植物；所述目标植物材料为目标植物种子或目标植物地上部分的繁殖材料。
其中，所述目标植物包括但不限于壳斗科植物或榛科植物。
作为本发明的进一步限定，所述辅助植物种子为单个种子重量在60mg以下的菌根植物种子。
其中，所述辅助植物包括但不限于松科植物或半日花科植物。
作为本发明的再进一步限定，所述栽种是采用点种方法将目标植物材料和辅助植物的种子混合后栽种至同一穴位。
作为本发明的进一步限定，所述目标植物材料中，繁殖材料包括目标植物已经木质化的枝条。优选为杨树枝条。
作为本发明的更进一步限定，所述接种是采用注射器将目的菌液接种到幼苗的根部。优选地，接种量为每株幼苗3-8ml。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明的方法以单个种子重量在60mg以下的植物种子作为菌根合成的辅助材料，以种子及繁殖材料有自身营养能维持一段时间生长的植物作为目标植物，利用易形成菌根的辅助植物迅速在树根周边形成优势菌群，同时由于其通过宿主植物有营养来源，可在竞争中避免被杂菌占领；待目标植物自身的营养快消耗殆尽时，只能和树根周边已经有的优势菌群形成目的菌菌根，显著提高菌根侵染率；
其中，利用单个种子重量在60mg以下的植物多为浅根性树种没有明显的主根，侧根发达的特点，使目的菌侵染后能快速形成优势菌群，在目标植物的根系范围内保持目的菌菌群优势的生命力和活力；
另一方面，目标植物因其自身营养能维持一段时间的生长，储存的营养物质多，在发芽后在自身营养消耗殆尽前主根生长是其第一要务，目的是找到养分及水分，形成深根性树种。在其主根生长的过程中不易形成菌根，只有等其自身营养消耗殆尽时才会生长侧根逐渐在侧根上形成菌根。待其生长侧根后，因辅助植物的作用使目标植物的根系范围内均为目的菌优势菌群，其只能和目的菌共生形成目的菌菌根。
在这个过程中，人为去掉辅助植物的地上部分植株，仅保留地下根系，由于目标植物根系周边的小环境里已有目的菌的优势菌群，优势菌群丧失辅助植物的营养来源后，需尽快寻找新的宿主根系获得新的营养来源，而唯一来源只有目标植物，只能与之尽快建立共生关系，从而提高了菌根侵染率；
本发明的方法在利用目标植物种子及其繁殖材料时，既极大拓宽了目标植物材料的选择，又降低了对目标植物栽培条件的限制，还显著降低菌根合成技术在目标植物菌根合成方面的投入成本，同时用辅助植物形成的目标菌的优势菌群限制了育苗基质在菌根合成的长周期中暴露在被空气中易被杂菌污染的可能，降低了菌根合成的投入成本，提高了菌根侵染率；
本发明的方法通过待种子或繁殖材料等目标植物萌发后，用注射器将目的菌直接注射接种到幼苗根部，相较于待菌丝自发生长侵染，显著提高侵染效率和成功率，且操作简便；
本发明在高经济价值的菌根性食用菌栽培生产中应用价值大，能够显著降低菌根性食用菌种苗生产成本，提升经济效益，具有良好的推广应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明实施例中所用到的培养基配方包括：
PDA平板培养基：土豆 200g，葡萄糖 20g，琼脂 18g, 水补齐至1L。
改良MMN液体培养基：MgSO4.7H2O：1.5g，KH2PO4：3g，酵母浸膏：5g，葡萄糖：10g，麦芽糖：10g，VB1：0.01g，NaCl：0.058g，CaCl2：1.11g，柠檬酸铁：1.5×10-2g，PDA 24g，水补齐至1L。
实施例1
本实施例为一种美味牛肝菌杨树菌根的合成方法。该方法以美味牛肝菌作为目的菌，以云南松种子为辅助植物种子，以杨树枝条为目标植物材料。其中，辅助植物云南松种子千粒重16.8g，单个种子平均重量为16.8mg；目标植物杨树枝条的单株平均重量为12g。
具体方法包括依次进行的以下步骤：
S0.前期培养和消毒灭菌准备
（1）将美味牛肝菌子实体采用组织分离法分离菌肉，接种在PDA平板培养基上，置于培养箱中在22℃下培养萌发出菌丝，挑取菌丝转接至新的PDA平板培养基纯化培养至菌丝长满培养皿，获得纯菌丝；
（2）挑取纯菌丝在改良MMN液体培养基上，置于摇床内进行液体发酵培养21天，获得液体菌种，加水稀释成300倍，得美味牛肝菌菌液；
（3）对直径小于1cm已经木质化的杨树树枝截成15cm长的枝条，作为目标植物材料，用5%的84消毒液进行表面灭菌消毒；
对云南松种子用5%的84消毒液进行表面灭菌消毒；
对蛭石进行温度为121℃，时间为2h的高温灭菌后，作为无菌栽培基质装入育苗容器，备用；
S1.将15cm长的杨树枝条扦插入无菌栽培基质，同时在其周边点种消毒后的云南松种子，每株杨树枝条旁点种3颗云南松种子；21天后杨树枝条和云南松种子均萌发出新叶，得杨树幼苗和云南松幼苗；
S2.用带针头的医用注射器将美味牛肝菌菌液，按照每株苗注射5ml，注射到幼苗的根部；
S3.培育45天后，经检测，已形成松科植物目的菌菌根，剪掉每株杨树旁边的3株云南松地上植株；继续培养90天，获得“杨树——美味牛肝菌”菌根。
（二）菌根侵染率检测
经菌根侵染数量平均值统计，实施例1所得菌根的侵染率为96%。
上述结果表明，本发明的美味牛肝菌与杨树的菌根合成方法具有较高的侵染率，表明采用本发明的方法可以利用杨树枝条实现菌根合成。以杨树作为目标植物材料进行菌根合成，既拓宽了目标植物材料的选择，又降低了对目标植物栽培条件的限制，还显著降低菌根合成技术在目标植物材料方面的投入成本。
实施例2
本实施例为一种中国块菌榛子菌根的合成方法。该方法以中国块菌作为目的菌，以油松种子为辅助植物种子，以榛子为目标植物种子。其中，辅助植物油松种子千粒重48.2g，单个种子平均重量为48.2mg；目标植物榛子种子的单个平均重量为20g。
具体方法包括依次进行的以下步骤：
S0.前期培养和消毒灭菌准备
（1）将完整、成熟的中国块菌子实体表面消毒后，在小型打浆机中加子实体5倍质量的常温纯水后，打碎，形成孢子原液；将孢子原液稀释500倍，得中国块菌孢子液；
（3）对油松种子和榛子种子用3%的过氧化氢水溶液浸泡5min消毒；
按照1:1的比例混合珍珠岩及蛭石作为育苗基质，对育苗基质进行121℃两小时的高温灭菌后，作为育苗基质装入育苗穴盘，备用；
S1. 按照1颗榛子配5颗油松种子的比例，将消毒后的种子点种进装有育苗基质的育苗穴盘内；30天后榛子和油松种子均萌发出新叶，得榛子和油松幼苗；
S2.用带针头的医用注射器将中国块菌孢子液，按照每株苗注射4ml，注射到幼苗的根部；
S3.60天后，经检测，已形成松科植物目的菌菌根，剪掉每株榛子旁边的5株油松地上植株；继续培养60天，获得“榛子——中国块菌”菌根。
（二）菌根侵染率检测
经菌根侵染数量平均值统计，实施例2所得菌根的侵染率为96.4%。
在其他实施方式中，目的菌液还可以是取含孢子的目的菌，加入3-8倍中某一数值重量的水，打碎，加水稀释至300-800倍的某一数值，均得到相应的目的菌的孢子液。且按照本实施例的方法，进行菌根合成，所得菌根的侵染率在96%以上。
实施例3
本实施例为一种玫黄黄肉牛肝菌栓皮栎菌根的合成方法。该方法以玫黄黄肉牛肝菌作为目的菌，以岩蔷薇种子为辅助植物种子，以栓皮栎种子为目标植物种子。其中，辅助植物岩蔷薇种子千粒重240mg，单个种子平均重量为0.24mg；目标植物栓皮栎种子的单个平均重量为5.5g。
具体方法包括依次进行的以下步骤：
S0.前期培养和消毒灭菌准备
（1）将玫黄黄肉牛肝菌子实体采用组织分离法分离菌肉，接种在PDA平板培养基上，置于培养箱中在22℃下培养萌发出菌丝，挑取菌丝转接至新的PDA平板培养基纯化培养至菌丝长满培养皿，获得纯菌丝；
（2）挑取纯菌丝在改良MMN液体培养基上，置于摇床内进行液体发酵培养21天，获得液体菌种，加水稀释成800倍，得玫黄黄肉牛肝菌菌液；
（3）栓皮栎种子为目标植物种子，对岩蔷薇种子和栓皮栎种子用3%的过氧化氢水溶液浸泡5min消毒；
对蛭石进行温度为121℃，时间为2h的高温灭菌后，作为无菌栽培基质装入育苗容器，备用；
S1. 按照1颗栓皮栎种子配4颗岩蔷薇种子的比例，将消毒后的种子点种进装有育苗基质的育苗穴盘内；45天后栓皮栎和岩蔷薇种子均萌发出新叶，得栓皮栎和岩蔷薇幼苗；
S2.用带针头的医用注射器将玫黄黄肉牛肝菌菌液，按照每株苗注射5ml，注射到幼苗的根部；
S3.75天后，经检测，已形成岩蔷薇目的菌菌根，剪掉每株栓皮栎旁边的4株岩蔷薇地上植株；继续培养93天，获得目标植物的目的菌菌根：“栓皮栎——玫黄黄肉牛肝菌”菌根。
（二）菌根侵染率检测
经菌根侵染数量平均值统计，实施例3所得菌根的侵染率为97.2%。
对比例1-3
对比例1为一种未加入辅助植物种子的菌根合成方法。该方法与实施例1相比，除未加入辅助植物种子外，其余步骤均相同。
对比例2为一种未加入辅助植物种子的菌根合成方法。该方法与实施例2相比，除未加入辅助植物种子外，其余步骤均相同。
对比例3为一种未加入辅助植物种子的菌根合成方法。该方法与实施例3相比，除未加入辅助植物种子外，其余步骤均相同。
经菌根侵染数量平均值统计，对比例1所得菌根的侵染率为36.5%；对比例2所得菌根的侵染率为33.2%；对比例3所得菌根的侵染率为38.6%。
实施例4-6
实施例4-6分别为一种目标植物的菌根合成方法。这些实施例与实施例3基本相同，不同之处仅在于以下参数存在区别：
实施例4以玫黄黄肉牛肝菌作为目的菌，以岩蔷薇种子为辅助植物种子，以栓皮栎种子为目标植物种子；目的菌液是分离目的菌获得纯菌种后经发酵培养18天，取发酵液，加水稀释350倍所得；步骤S2中，接种量为每株幼苗3ml；步骤S3中，继续培养时间为15天。
实施例5以美味牛肝菌作为目的菌，以云杉种子为辅助植物种子，以麻栎种子为目标植物种子；目的菌液是分离目的菌获得纯菌种后经发酵培养19天，取发酵液，加水稀释800倍所得；步骤S2中，接种量为每株幼苗4.5ml；步骤S3中，继续培养时间为19天。
实施例6以意大利白块菌作为目的菌，以云杉种子为辅助植物种子，以麻栎种子为目标植物种子；目的菌液是分离目的菌获得纯菌种后经发酵培养25天，取发酵液，加水稀释300倍所得；步骤S2中，接种量为每株幼苗8ml；步骤S3中，继续培养时间为70天。
经菌根侵染数量平均值统计，实施例4-6所得菌根的侵染率均在95%以上。
验证实验：
为验证不同植物种子的菌根侵染率，判断是否是植物种子携带的营养影响菌根的合成效果，设计以下实验：
实验方法：选择均能形成共生关系的美味牛肝菌、玫黄黄肉牛肝菌分别作为目的菌，制备目的菌液备用；选择云南松、云杉、岩蔷薇、栓皮栎、麻栎种子分别作为菌根合成植物材料。这些种子植物材料的重量如表1：
表1 植物种子重量一览表
将蛭石高温灭菌后作为植物育苗的育苗基质（目的是营养一致），选择颗粒饱满的种子灭菌后播种在单体式育苗容器内，每个单体式育苗容器播种一粒种子，置于洁净空间内。整个实验过程中给种苗浇灌蒸馏水，不施肥。
种子发芽后15天后，将纯菌液稀释到500倍，分品种、分菌种采用注射法在同一天给每株种苗的根部注射5ml的菌液用于菌根接种，注射后每周分品种、分菌种各挑选5株种苗检查菌根数量，连续检查记录9周，计算每种植物菌根侵染数量的平均值，以此来验证菌根侵染率和种子营养之间的关系。
实验结果如表2：
表2 菌根数量平均值结果（单位：个）
表1和表2表明，菌根侵染率的高低和种子的自身重量有关，也就是和所携带的营养有关：种子携带的营养越少，侵染率越高；反之，则降低菌根侵染率。有营养的植物种子在自身营养消耗8周后（营养几乎消耗殆尽），菌根侵染率明显提高。
上述试验结果表明，本发明的方法将菌根侵染率高的植物种子（其自身携带的营养少）作为菌根合成的辅助材料，对目标植物进行菌根合成，能显著提高菌根侵染率。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。
Claims (6)
1.一种目标植物的菌根合成方法，其特征在于，包括依次进行的以下步骤：
S1.将目标植物材料和辅助植物的种子混合后共同栽种于无菌栽培基质，培养至均萌发出叶片，获得目标植物幼苗和辅助植物幼苗；
S2.将目的菌液接种到目标植物幼苗和辅助植物幼苗的根部；
S3.待辅助植物形成菌根后，去掉辅助植物植株的地上部分，继续培养15-93天，获得目标植物的目的菌菌根；
所述目的菌液包括分离目的菌获得纯菌种后经发酵培养所得的菌液或目的菌的孢子液；
所述目标植物材料和辅助植物的种子均是经消毒处理后的无菌材料；
所述目标植物包括壳斗科或榛科植物；所述辅助植物包括松科或半日花科植物；
所述目标植物的种子重量大于辅助植物的种子重量。
2.根据权利要求1所述的一种目标植物的菌根合成方法，其特征在于，所述目标植物为单个种子重量在0.1g以上的菌根植物；所述目标植物材料为目标植物种子或目标植物地上部分的繁殖材料。
3.根据权利要求2所述的一种目标植物的菌根合成方法，其特征在于，所述辅助植物种子为单个种子重量在60mg以下的菌根植物的种子。
4.根据权利要求1、2和3中任意一项所述的一种目标植物的菌根合成方法，其特征在于，步骤S1中，所述栽种是采用点种方法将目标植物材料和辅助植物的种子混合后栽种至同一穴位。
5.根据权利要求2所述的一种目标植物的菌根合成方法，其特征在于，所述目标植物材料中，繁殖材料包括目标植物已经木质化的枝条。
6.根据权利要求4所述的一种目标植物的菌根合成方法，其特征在于，步骤S2中，所述接种是采用注射器将目的菌液接种到幼苗的根部。
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