CN117626450A - 一种去除核糖体rna二代测序文库的构建方法及构建试剂盒 - Google Patents

一种去除核糖体rna二代测序文库的构建方法及构建试剂盒 Download PDF

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CN117626450A
CN117626450A CN202210968821.9A CN202210968821A CN117626450A CN 117626450 A CN117626450 A CN 117626450A CN 202210968821 A CN202210968821 A CN 202210968821A CN 117626450 A CN117626450 A CN 117626450A
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梁志坤
蒋析文
陈嘉棋
温慧敏
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Guangzhou Da'an Gene Co ltd
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Guangzhou Da'an Gene Co ltd
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Abstract

本申请实施例属于生物技术领域，涉及一种去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法及构建试剂盒，包括将RNA进行片段化，得到RNA片段，对RNA片段去除rRNA，得到RNA结合产物；对RNA结合产物进行一链合成反应，得到一链cDNA；对一链cDNA进行二链合成反应，得到二链cDNA；通过一步反应，对二链cDNA依次进行末端修复、磷酸化及加A处理，得到加A产物；将加A产物进行接头连接反应，得到连接产物；对连接产物进行第一次纯化处理，得到目标片段并回收；以回收的目标片段作为模板进行PCR扩增反应，得到二代测序文库。本申请能够提升核糖体RNA去除及建库的效率，降低成本。

Description

一种去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法及构建试剂盒
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法及构建试剂盒。
背景技术
近年来，随着二代测序的飞速发展，RNA-seq(转录组测序技术)已经成为研究转录组与基因表达的重要手段，通过对转录组的研究，能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。RNA-seq已被广泛应用于遗传学、农学和医学基础研究、医疗诊断和药物研发等领域中。
研究表明，人类基因组中大部分DNA都可以转录成RNA，但是仅有1.5％的核苷酸序列用于蛋白质的编码，剩余不编码蛋白质的的非编码RNA(ncRNA)，被认为是基因组转录噪音，这种转录组噪音(无效信息)基本全部来源于丰度最高的rRNA，它在RNA中占比高达80％以上，却只能提供非常少的转录本信息，且检测到过多的rRNA会掩盖其它基因的表达丰富度。所以需要在上机测序前把它去除，减少无意义数据产生，且rRNA去除的效率也被视为最大化读取到转录物的关键因素。
市面上现有的用于去除rRNA进行转录组文库构建的试剂盒，主流的方法有两大类，第一类是使用RNA探针结合链霉亲和素磁珠方法去除rRNA，如Illumina的StrandedTotal RNALT-(with Ribo-Zero TM Human/Mouse/Rat)，但样本起始量要求高(一般为1μg)且rRNA残留量相对较多，试剂价格昂贵；第二类是以DNA为探针结合RNase H和DNase I酶消化的方法去除rRNA，如NEB的NEBNext rRNADepletion Kit(Human/Mouse/Rat)试剂盒，但此方法操作较复杂，时间长，试剂价格昂贵。
因此，针对现有技术，亟需开发一种操作简单、可以快速去除rRNA的测序文库构建方法。
发明内容
本申请实施例的目的在于提出一种去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法及构建试剂盒，以解决相关技术中rRNA去除操作复杂、成本高以及时间长效率低的技术问题。
为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，采用了如下所述的技术方案：
将RNA进行片段化，得到RNA片段，对所述RNA片段去除rRNA，得到RNA结合产物；
对所述RNA结合产物进行一链合成反应，得到一链cDNA；
对所述一链cDNA进行二链合成反应，得到二链cDNA；
通过一步反应，对所述二链cDNA依次进行末端修复、磷酸化及加A处理，得到加A产物；
将所述加A产物进行接头连接反应，得到连接产物；
对所述连接产物进行第一次纯化处理，得到目标片段并回收；
以回收的所述目标片段作为模板进行PCR扩增反应，得到二代测序文库。
进一步的，所述将RNA进行片段化，得到RNA片段，对所述RNA片段去除rRNA，得到RNA结合产物的步骤包括：
将RNA、rRNABlocker、随机引物和反应液A进行混合，并在高温下对所述RNA进行打断，得到RNA片段；
将所述RNA片段、rRNABlocker、随机引物和反应液A，在不同的温梯度进行反应，得到所述RNA结合产物；其中，所述RNA结合产物包括rRNA和rRNABlocker的结合产物以及非rRNA与随机引物的结合产物。
进一步的，所述对所述RNA结合产物进行一链合成反应，得到一链cDNA的步骤包括：
将所述RNA结合产物与反应酶B和反应酶C进行一链合成反应，得到所述一链cDNA；其中，反应酶B为逆转录酶；反应酶C为鼠源RNase抑制剂。
进一步的，所述对所述一链cDNA进行二链合成反应，得到二链cDNA的步骤包括：
将所述一链cDNA与反应物D、酶混合液E进行二链合成反应，得到二链cDNA，其中，反应液D包括Tris-HCl、MgCl2、KCl、DTT、NAD+、BSA、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶混合液E包括DNA Polymerase I、E.coli DNA Ligase、RNase H、T4 DNA Polymerase、T4Polynucleotide Kinase酶。
进一步的，所述将所述加A产物进行接头连接反应，得到连接产物的步骤包括：
将所述加A产物与反应液F、反应液G和酶H进行接头连接反应，得到连接产物；其中，所述反应液F包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP及PEG8000；所述反应液G为接头X为Illumina接头或MGISEQ接头；所述酶H为T4 DNA连接酶。
进一步的，所述对所述连接产物进行第一次纯化处理，得到目标片段并回收的步骤包括：
将所述连接产物与磁珠在离心管中充分混匀，室温孵育后进行离心，静置后得到澄清溶液，去除上清液；
往离心管中加入新鲜配制的醇漂洗磁珠，等待后吸弃上清，并重复；
将离心管瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体；
吸取无核酸酶水于离心管中，涡旋混匀，室温孵育，瞬时离心后置于磁力架上，静置后吸取上清得到目标片段并回收。
进一步的，所述以回收的所述目标片段作为模板进行PCR扩增反应，得到二代测序文库的步骤包括：
将所述目标片段与反应液I和反应液J进行不同阶段的PCR扩增反应，得到所述二代测序文库；其中，所述反应液I包括5*Q5 buffer、dATP、dGTP、dCTP、dTTP及Q5热启动超保真DNA聚合酶；所述反应液J为Illumina文库扩增引物或MGISEQ文库制备引物。
进一步的，在所述以回收的所述目标片段作为模板进行PCR扩增反应的步骤之后还包括对所述PCR扩增反应的扩增产物进行第二次纯化处理：
将所述扩增产物与磁珠装入离心管中充分混匀；
室温孵育后瞬时离心，将离心管置于磁力架上静置；
待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
往离心管中加入新鲜配制的乙醇漂洗磁珠，等待后吸弃上清，并重复；
将离心管瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体；
吸取无核酸酶水于离心管中，涡旋混匀，室温孵育，瞬时离心后置于磁力架上，静置澄清后，吸取上清得到二代测序文库。
进一步的，所述不同阶段为不同反应阶段，反应温度和反应时间如下：
预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；
退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；
终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
保存阶段：反应温度为4℃；
其中，变性阶段至延伸阶段，分别需要执行10-16个循环；预变性阶段和终延伸阶段，各执行1次。
为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种采用如上所述构建方法制得的去核糖体RNA的转录组文库构建试剂盒。
与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：
本申请提供的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，核糖体RNA去除步骤简单，可大大节约人力、试剂、时间等成本；整体建库流程，工艺步骤简化，与市面上的核糖体RNA去除及建库相比，极大缩减了操作流程和实验时间，可最大程度减少核酸样本的损耗。
附图说明
为了更清楚地说明本申请中的方案，下面将对本申请实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本申请的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法的一个实施例的流程图；
图2是本申请的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法的原理图。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本申请提供了一种去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，参见流程示意图图1和流程原理图图2所示，该方法包括以下步骤：
步骤S10，将RNA进行片段化，得到RNA片段，对RNA片段去除rRNA，得到RNA结合产物。
在本实施例中，获取样品，并去除样品总RNA(核糖核酸)中的核糖体RNA(rRNA)，得到去除核糖体后的RNA结合产物。
具体的，将RNA、rRNA Blocker、随机引物和反应液A进行混合后，在94℃高温下将RNA打断，得到RNA片段，将RNA片段、rRNA Blocker、随机引物和反应液A在不同温度梯度下各自进行反应，最终得到RNA结合产物。
其中，Blocker作为野生型封闭系统，能特异性结合野生型模板从而阻滞特异性引物与野生型模板非特异性结合，此外blocker 3’端修饰基团能封闭序列扩增。
在本实施例中，利用真核生物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的rRNABlocker，rRNA Blocker序列长度为18-22nt，共130条，可与rRNA进行互补配对，rRNABlocker序列进行特殊的锁核酸(LNA)或钛核酸(PNA)修饰，其TM值(熔解温度)可达80℃及以上，能够特异性的与样品rRNA紧密结合将其封闭，使其无法进行逆转录及下游的建库步骤，从而实现有效去除核糖体RNA及构建转录组测序文库。
在本实施例中，反应液A包含的物质及其对应的终浓度如下：
Tris-HCl(ph8.3)，终浓度为300mM；MgCl2，终浓度为18mM；KCl，终浓度为300mM；DTT，终浓度为60mM；dATP，终浓度为3mM；dGTP，终浓度为3mM；dCTP，终浓度为3mM及dTTP，终浓度为3mM。
温度梯度包括75℃、65℃、55℃、37℃以及25℃，将RNA片段、rRNA Blocker、随机引物和反应液A在不同的温度梯度下各反应2min，得到RNA结合产物，其中，RNA结合产物包括rRNA和rRNA Blocker结合产物以及非rRNA(非核糖体)与随机引物结合的产物。
其中，反应液A作为RNA片段化、rRNA Blocker与rRNA杂交和一链合成的buffer缓冲液。
步骤S20，对RNA结合产物进行一链合成反应，得到一链cDNA。
具体的，将RNA结合产物与反应酶B和反应酶C进行一链合成反应，得到一链cDNA。
其中，反应酶B为逆转录酶(Reverse Transcriptase)，具体可以为M-MuLV酶；反应酶C为Murine RNase Inhibitor(鼠源RNase抑制剂)，具体可以采用Rnasin酶。
在一些的可选的实现方式中，一链合成反应的反应条件为：反应温度为25℃、反应时间5-15min，其中，反应时间优选为5min；或者反应温度为42℃、反应时间为10-20min，其中，反应时间优选为15min；或者反应温度为65℃、反应时间为10-30min，其中，反应时间优选为15min。
应当理解，不同反应温度对应的优选反应时间为最佳一链合成反应条件。
步骤S30，对一链cDNA进行二链合成反应，得到二链cDNA。
具体的，将一链cDNA与反应物D、酶混合液E进行二链合成反应，得到二链cDNA。
其中，反应物D作为二链合成反应的缓冲液，包含有如下物质以及对应的终浓度：
Tris-HCl(ph8.3)，终浓度为100mM；MgCl2，终浓度为6mM；KCl，终浓度为300mM；DTT，终浓度为20mM；NAD+，终浓度为208uM；BSA，终浓度为400ug/ml；dATP，终浓度为3mM；dGTP，终浓度为3mM；dCTP，终浓度为3mM及dTTP，终浓度为3mM。
酶混合液E包括DNA Polymerase I(DNA聚合酶)、E.coli DNA Ligase(大肠杆菌DNA连接酶)、RNase H(核糖核酸酶H)、T4 DNA Polymerase(T4-DNA聚合酶)、T4Polynucleotide Kinase酶(T4多聚核苷酸激酶)。
在一些可选的实现方式中，二链合成反应的反应条件如下：
反应温度为16℃，反应时间为30-60min，反应时间优选为30min。
步骤S40，通过一步反应，对二链cDNA依次进行末端修复、磷酸化及加A处理，得到加A产物。
其中，一步反应的反应条件如下：
反应温度为65℃、反应时间为10-20min，反应时间优选为15min。
应当理解，由机体自身酶切产生的游离RNA片段或被物理或化学方法打断的RNA片段末端的完整性会受到不同程度的破环，形成5’突出末端、3’突出末端、5’羟基、3’磷酸基团等构型，经过逆转录后与RNA互补形成的cDNA的末端同样不完整，不利于后续与接头发生接头连接反应。
末端修复反应主要利用聚合酶(如T4-DNA聚合酶等)在dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)存在时的5’-3’聚合活性将5’突出末端补平，3’-5’外切酶活性将3’突出末端切平；利用多聚核苷酸激酶(如T4多聚核苷酸激酶等)的5’羟基激酶活性将5’羟基转变成5’磷酸基团，多聚核苷酸激酶的3’磷酸酯酶活性将3’磷酸基团转变成3’羟基。
磷酸化可以提高接头连接效率。
加A处理则是在3’末端加A反应，是在反应体系中存在dATP时，利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶，在双链DNA3’末端加上dATP，以利于双链DNA后续与3’T突出构型的接头序列进行A-T连接。
步骤S50，将加A产物进行接头连接反应，得到连接产物。
具体的，将加A产物与反应液F、反应液G和反应液G进行接头连接反应，得到连接产物。
其中，反应液F包括Tris-HCl(ph7.5)、MgCl2、DTT、ATP及PEG8000，其对应的终浓度分别为75mM、15mM、15mM、2.75mM及20v/v％；反应液G为根据不同测序平台，可以选择为Illumina接头或MGISEQ接头Ad153，其终浓度为5μM；酶H为T4 DNA连接酶。
在一些可选的实现方式中，接头连接反应的反应条件如下：
反应温度为20℃、反应时间为20min。
步骤S60，对连接产物进行第一次纯化处理，得到目标片段并回收。
在接头连接反应结束后，需对连接产物进行第一次纯化处理，步骤如下：
将连接产物与磁珠在离心管中充分混匀，室温孵育后进行离心，静置后得到澄清溶液，去除上清液；
往离心管中加入新鲜配制的醇漂洗磁珠，等待后吸弃上清，并重复；
将离心管瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体；
吸取无核酸酶水于离心管中，涡旋混匀，室温孵育，瞬时离心后置于磁力架上，静置后吸取上清得到目标片段并回收。
作为一种具体的实现方式，第一次纯化处理包括以下步骤：
步骤A，将连接产物和0.9x磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使连接产物与磁珠充分混匀；
步骤B，室温孵育5min后瞬时离心，将离心管置于磁力架上静置3min；
步骤C，待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
步骤D，往离心管中加入200μL新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠，等待30s后吸弃上清；
步骤E，重复步骤D；
步骤F，将离心管瞬时离心，置于磁力架上，用枪吸去残留液体，开盖晾干；
步骤G，吸取22ul的无核酸酶水于离心管中，涡旋数秒混匀，室温孵育5分钟，瞬时离心后置于磁力架上静置后吸取上清得到目标片段。
本实施例中，通过第一次纯化处理可以去除连接产物中的大量杂质。
步骤S70，以回收的目标片段作为模板进行PCR扩增反应，得到二代测序文库。
具体的，将目标片段与反应液I和反应液J进行不同阶段的PCR扩增反应，得到去除核糖体RNA的二代测序文库。
其中，反应液I包括5*Q5 buffer、dATP、dGTP、dCTP、dTTP及Q5热启动超保真DNA聚合酶，对应的终浓度分别为80％、0.8mM、0.8mM、0.8mM、0.8mM及4％；反应液J，根据测序平台，可以选择Illumina文库扩增引物或MGISEQ文库制备引物，终浓度为10μM。
在本实施例中，PCR扩增反应中，根据反应阶段，其反应温度和反应时间如下：
1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；
3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；
5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
6)保存阶段：反应温度为4℃；
其中，第2)至4)阶段分别需要执行10-16个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。
在本实施例的一些可选的实现方式中，PCR扩增反应结束后，还包括对PCR扩增反应产生的PCR扩增产物进行的第二次纯化处理：
将扩增产物与磁珠装入离心管中充分混匀；
室温孵育后瞬时离心，将离心管置于磁力架上静置；
待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
往离心管中加入新鲜配制的乙醇漂洗磁珠，等待后吸弃上清，并重复；
将离心管瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体；
吸取无核酸酶水于离心管中，涡旋混匀，室温孵育，瞬时离心后置于磁力架上，静置澄清后，吸取上清得到二代测序文库。
作为一种具体的实现方式，第二次纯化处理包括以下步骤：
步骤S701，将PCR扩增产物、1x磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使PCR扩增产物与磁珠充分混匀；
步骤S702，室温孵育5min后瞬时离心，将离心管置于磁力架上静置3min；
步骤S703，待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
步骤S704，往离心管中加入200μL新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠，等待30s后吸弃上清；
步骤S705，重复步骤S704；
步骤S706，将离心管瞬时离心，置于磁力架上，用枪吸去残留液体，开盖晾干。
步骤S707，吸取22ul的无核酸酶水于离心管中，涡旋数秒混匀，室温孵育5分钟，瞬时离心后置于磁力架上，静置澄清后吸取上清得到二代测序文库。
本申请还提供一种采用如上所述的构建方法制得的去核糖体RNA的转录组文库构建试剂盒，该试剂盒可以极大缩减了操作流程和实验时间，提升建库效率。
下面采用具体实施例详细说明去除核糖体RNA二代测序文库的构建流程。
1、核糖体RNA去除
包括：RNA片段化、rRNA Blocker与rRNA结合、非rRNA与Random Primers(随机引物)结合。
1.1、将表1各组分从-20℃冰箱取出，置于冰盒上解冻，在PCR管中配置如表1所示的反应体系。
表1
组分 体积
Total RNA(RIN＝7) 500ng/21.5ul
rRNA Blocker 3ul
随机引物 1ul
反应液A 3ul
补水至 28.5ul
其中，反应液A包含物质及其终浓度：Tris-HCl(ph8.3)300mM、MgCl2 18mM、KCl300m M、DTT60mM、dATP3mM、dGTP 3mM、dCTP 3m M及dTTP 3mM。
反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s。
1.2、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表2所示。
表2反应条件
温度 时间
热盖 105℃
94℃ 7min
75℃ 2min
65℃ 2min
55℃ 2min
37℃ 2min
25℃ 2min
4℃ Hold
表3不同质量样本及不同片段长度打断时间推荐
2、一链合成反应
2.1、将反应酶B和反应酶C从-20℃冰箱取出，在冰上解冻呈液态，颠倒混匀短暂离心后放冰盒上备用；在PCR管中配制以下反应体系，如表4所示。
表4一链合成反应体系
组分 体积
RNA结合产物 28.5ul
反应酶B 1ul
反应酶C 0.5ul
共计 30ul
其中，反应酶B为逆转录酶M-MuLV酶，反应酶C为鼠源RNase抑制剂)Rnasin酶。
2.2、反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
2.3、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表5所示。
表5一链合成反应条件
温度 时间
热盖 105℃
25℃ 5min
42℃ 25min
65℃ 15min
4℃ Hold
3、二链合成及末端修复加A反应
3.1、将反应液D和酶混合液E从-20℃冰箱取出，反应液D室温解冻，颠倒混匀短暂离心后备用，酶混合液E冰上解冻呈液态，颠倒混匀短暂离心后放冰盒上备用；在PCR管中配制以下反应体系，如表6所示。
表6二链合成反应体系
组分 体积
一链合成产物 30ul
反应液D 5ul
酶混合液E 5ul
共计 40ul
其中，反应液D包括物质及其终浓度度Tris-HCl(ph8.3)100mM、MgCl26mM、KCl300mM、DTT 20mM、NAD+208uM、BSA 400ug/ml、dATP 3mM、dGTP 3mM、dCTP 3mM及dTTP 3mM；及酶混合液E包括DNA Polymerase I、E.coli DNA Ligase、RNase H、T4 DNA Polymerase、T4Polynucleotide Kinase酶。
3.2、反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
3.3、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表7所示。
表7反应条件
温度 时间
热盖 105℃
16℃ 30min
65℃ 15min
4℃ Hold
4、接头连接反应
4.1、将反应液F、反应液G从-20℃冰箱取出，室温解冻，混匀短暂离心后备用；将酶H从-20℃冰箱取出，短暂离心后放冰盒上备用。
4.2、在加A产物中依次添加以下各组分，如表8所示。
表8接头连接反应组分
组分 体积
加A产物 40ul
反应液F 20ul
反应液G 5ul
反应液G 5ul
无核酸酶水 10ul
总计 80ul
其中，反应液F包括Tris-HCl(ph7.5)、MgCl2、DTT、ATP及PEG8000，其对应的终浓度分别为75mM、15mM、15mM、2.75mM及20v/v％；
反应液G为根据不同测序平台，可以选择为Illumina接头或MGISEQ接头Ad153，其终浓度为2μM；酶H为T4 DNA连接酶。
4.3、反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
4.4、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表9所示。
表9反应条件
温度 时间
热盖 off
20℃ 20min
4℃ Hold
5、连接产物的第一次纯化处理
5.1将DNA纯化磁珠提前30min从2-8℃冰箱取出，静置，使其温度平衡至室温；
5.2颠倒或旋涡振荡使DNA纯化磁珠和连接产物充分混匀，将72μl磁珠分装至1.5mL低吸附离心管中；
5.3室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
5.4将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
5.5保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；
5.6重复步骤5.5一次，总计漂洗二次；
5.7将样品瞬时离心5s，把样品置于磁力架上，用10μL的移液器把残留的上清彻底去干净，保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min至磁珠表面无反光；
5.8将样品从磁力架上取出，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(≈5min)，小心吸取20μL上清至下步反应的PCR管中。
6、文库扩增
6.1将从-20℃冰箱取出反应液I和反应液J，反应液I放于冰上解冻20min，反应液J室温解冻20min，混匀短暂离心离备用，在上步纯化后的连接产物中依次添加以下各组分，如表10所示。
表10
组分 体积
连接产物 20ul
反应液I 25ul
反应液J 5ul
总计 50ul
6.2、反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
6.3、按表11所示的程序在热循环仪中运行扩增。
表11反应条件
/>
7、扩增产物第二次纯化处理
7.1将DNA纯化磁珠提前30min从2-8℃冰箱取出，静置，使其温度平衡至室温；
7.2颠倒或涡旋振荡使DNA纯化磁珠充分混匀，将85μL DNA纯化磁珠分装至1.5mL低吸附离心管中；
7.3将上步50μL PCR扩增产物补水至100μL并加到磁珠中反复吹打混匀(混匀时吸头不要离开液面，防止产生过多气泡)；
7.4室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
7.5将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，取上清至含40μLDNA纯化磁珠的低吸附离心管中；
7.6室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
7.7将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
7.8保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；
7.9重复步骤7.8一次，总计漂洗二次；
7.10将样品瞬时离心5s，把样品置于磁力架上，用10μL的移液器把残留的上清彻底去干净，保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min至磁珠表面无反光；
7.11将样品从磁力架上取出，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(≈5min)，小心吸取20μL上清至一个新的1.5mL EP管中。
8、二代测序文库质检：使用Qsep 100和Qubit4.0进行文库质检。
9、二代测序文库上机检测
通过质检的文库进行上机检测。使用Pair End Flow Cell，按照MGI-2000的指示进行上机操作，并运行Pair End 100标准测序程序。测序程序运行完毕后，对所得数据进行生物信息学分析。其中rRNA残留率计算公式为：与数据库比对得到的rRNA片段数/过滤合格片段数，数据RNAcentral。
10、结果分析
测序分析结果(如表12)显示，经过rRNA去除的文库rRNA的残留量均在5％以下，而阴性对照组在80％以上(阴性对照未进行rRNA去除处理)，表明本方法能高效去除rRNA。同时，本方法检测到的CDS区域占比提升，提升了测序效率。
表12测序分析结果
显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：
将RNA进行片段化，得到RNA片段，对所述RNA片段去除rRNA，得到RNA结合产物；
对所述RNA结合产物进行一链合成反应，得到一链cDNA；
对所述一链cDNA进行二链合成反应，得到二链cDNA；
通过一步反应，对所述二链cDNA依次进行末端修复、磷酸化及加A处理，得到加A产物；
将所述加A产物进行接头连接反应，得到连接产物；
对所述连接产物进行第一次纯化处理，得到目标片段并回收；
以回收的所述目标片段作为模板进行PCR扩增反应，得到二代测序文库。
2.根据权利要求1所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，所述将RNA进行片段化，得到RNA片段，对所述RNA片段去除rRNA，得到RNA结合产物的步骤包括：
将RNA、rRNA Blocker、随机引物和反应液A进行混合，并在高温下对所述RNA进行打断，得到RNA片段；
将所述RNA片段、rRNA Blocker、随机引物和反应液A，在不同的温梯度进行反应，得到所述RNA结合产物；其中，所述RNA结合产物包括rRNA和rRNA Blocker的结合产物以及非rRNA与随机引物的结合产物。
3.根据权利要求1所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，所述对所述RNA结合产物进行一链合成反应，得到一链cDNA的步骤包括：
将所述RNA结合产物与反应酶B和反应酶C进行一链合成反应，得到所述一链cDNA；其中，反应酶B为逆转录酶；反应酶C为鼠源RNase抑制剂。
4.根据权利要求1所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，所述对所述一链cDNA进行二链合成反应，得到二链cDNA的步骤包括：
将所述一链cDNA与反应物D、酶混合液E进行二链合成反应，得到二链cDNA，其中，反应液D包括Tris-HCl、MgCl2、KCl、DTT、NAD+、BSA、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶混合液E包括DNA Polymerase I、E.coli DNA Ligase、RNase H、T4 DNA Polymerase、T4Polynucleotide Kinase酶。
5.根据权利要求1所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，所述将所述加A产物进行接头连接反应，得到连接产物的步骤包括：
将所述加A产物与反应液F、反应液G和酶H进行接头连接反应，得到连接产物；其中，所述反应液F包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP及PEG8000；所述反应液G为接头X为Illumina接头或MGISEQ接头；所述酶H为T4 DNA连接酶。
6.根据权利要求1所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，所述对所述连接产物进行第一次纯化处理，得到目标片段并回收的步骤包括：
将所述连接产物与磁珠在离心管中充分混匀，室温孵育后进行离心，静置后得到澄清溶液，去除上清液；
往离心管中加入新鲜配制的醇漂洗磁珠，等待后吸弃上清，并重复；
将离心管瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体；
吸取无核酸酶水于离心管中，涡旋混匀，室温孵育，瞬时离心后置于磁力架上，静置后吸取上清得到目标片段并回收。
7.根据权利要求1所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，所述以回收的所述目标片段作为模板进行PCR扩增反应，得到二代测序文库的步骤包括：
将所述目标片段与反应液I和反应液J进行不同阶段的PCR扩增反应，得到所述二代测序文库；其中，所述反应液I包括5*Q5 buffer、dATP、dGTP、dCTP、dTTP及Q5热启动超保真DNA聚合酶；所述反应液J为Illumina文库扩增引物或MGISEQ文库制备引物。
8.根据权利要求7所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，在所述以回收的所述目标片段作为模板进行PCR扩增反应的步骤之后还包括对所述PCR扩增反应的扩增产物进行第二次纯化处理：
将所述扩增产物与磁珠装入离心管中充分混匀；
室温孵育后瞬时离心，将离心管置于磁力架上静置；
待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
往离心管中加入新鲜配制的乙醇漂洗磁珠，等待后吸弃上清，并重复；
将离心管瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体；
吸取无核酸酶水于离心管中，涡旋混匀，室温孵育，瞬时离心后置于磁力架上，静置澄清后，吸取上清得到二代测序文库。
9.根据权利要求7所述的去除核糖体RNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，所述不同阶段为不同反应阶段，反应温度和反应时间如下：
预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；
退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；
终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
保存阶段：反应温度为4℃；
其中，变性阶段至延伸阶段，分别需要执行10-16个循环；预变性阶段和终延伸阶段，各执行1次。
10.一种采用权利要求1至9任一所述构建方法制得的去核糖体RNA的转录组文库构建试剂盒。
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