CN108660135A - 一种用于dna建库的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于DNA建库的试剂盒及其应用，特别涉及用于外周血cfDNA建库的试剂盒及其应用。本发明首先提供了一种用于DNA建库的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲包括配比如下的各个组分：1‑3U T4 PNK：1‑4.5U Klenow Fragment：0.25‑0.5U LA Taq DNA Polymerase：0.3‑0.9U T4 DNA Polymerase：0.5‑2.5nmol dNTP：0.5‑2.5nmol dATP；组件乙包括配比如下的各个组分：2.5‑8nmol ATP：26.5‑132U T4 DNA Ligase：0.213μL‑0.534μLPEG 8000。本发明提供的试剂盒及其应用方法，尽可能减少了建库过程中DNA损失，减少了血浆使用量，降低了建库成本，缩短了建库时间，操作更简便，结果更稳定可靠。本发明对于提高建库效率，减少人力成本有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于DNA建库的试剂盒及其应用，特别涉及用于外周血cfDNA建库的试剂盒及其应用。
背景技术
外周血游离DNA是存在于外周血循环中的游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)。cfDNA的来源主要有如下两种：第一种，细胞凋亡过程中产生的“DNA ladder”式的片段化核酸，大小基本上在150-200bp；第二种，细胞被裂解(这种裂解既可以来源于物理性刺激引发的坏死，也可以是免疫细胞杀伤作用)产生的核酸，大小接近基因组DNA。当然，不管是哪种方式产生的cfDNA，都会进一步在外周血中被快速清除(这个时间可能是数十分钟至数小时不等，但机制尚不清楚)。
与健康人相比，肿瘤患者cfDNA含量升高，这些cfDNA可以来自肿瘤原发灶、转移灶、循环肿瘤细胞以及正常组织。目前学者们普遍认为，在肿瘤发生发展的早期阶段即有核酸释放入血，并将这种循环在血液中的肿瘤细胞DNA命名为ctDNA(Circulating tumorDNA)，这些ctDNA被认为携带了肿瘤组织遗传学和表观遗传学的变异信息。近年来，随着技术手段的迅速发展，ctDNA作为一种可广泛应用的生物标志物被越来越多地关注和报道。有研究已经证实了利用癌症患者ctDNA结合新一代高通量测序技术在肿瘤个体化治疗上的可行性，并指明了ctDNA在肿瘤早期诊断、个体化治疗和预后监测等方面的巨大潜力和应用前景。
目前市场上能够有效进行DNA建库的试剂盒主要有两种，均为KAPA Biosystems公司的产品，一种是KAPA-LTP试剂盒，另一种是KAPA-Hyper试剂盒。
KAPA-LTP试剂盒的工作原理流程示意图见图1。该试剂盒采用三步法建库，将末端修复、末端加A和接头连接三个步骤分开反应，流程较稳定，可以针对基因组DNA、血浆DNA以及福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)DNA，各样本间的成功率和效果差异较大。但是，应用KAPA-LTP试剂盒进行DNA建库，存在单个建库成本过高、建库产量低、耗时长、操作复杂等不利于生产的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于DNA建库的试剂盒及其应用，特别涉及用于外周血cfDNA建库的试剂盒及其应用。
本发明首先提供了一种用于DNA建库的试剂盒，包括组件甲和组件乙；
组件甲包括配比如下的各个组分：
1-3U T4PNK：1-4.5U Klenow Fragment：0.25-0.5U LA Taq DNA Polymerase：0.3-0.9U T4DNA Polymerase：0.5-2.5nmol dNTP：0.5-2.5nmol dATP；
组件乙包括配比如下的各个组分：
2.5-8nmol ATP：26.5-132U T4DNA Ligase：0.213μL-0.534μL PEG 8000。
组件甲优选包括配比如下的各个组分：
2U T4PNK：3U Klenow Fragment：0.25U LA Taq DNA Polymerase：0.6U T4DNAPolymerase：1.25nmol dNTP：1nmol dATP。
组件乙优选包括配比如下的各个组分：
5.6nmol ATP：85U T4DNA Ligase：0.267μL PEG 8000。
组件甲中，dATP指的是dNTP以外额外加入的dATP。
组件甲中的各个组分，可以混合包装，也可以单独包装待使用时再混合。
组件乙中的各个组分，可以混合包装，也可以单独包装待使用时再混合。
组件甲具体可为5×Fast Library Repaire Mix 1。5×Fast Library RepaireMix 1中，包括1-3U/μL T4PNK、1-4.5U/μL Klenow Fragment、0.25-0.5U/μL LA Taq DNAPolymerase、0.3-0.9U/μL T4DNA Polymerase、0.5-2.5nmol/μL dNTP、0.5-2.5nmol/μLdATP。5×Fast Library Repaire Mix 1中，优选包括2U/μL T4PNK、3U/μL KlenowFragment、0.25U/μL LA Taq DNA Polymerase、0.6U/μL T4DNA Polymerase、1.25nmol/μLdNTP、1nmol/μL dATP。5×Fast Library Repaire Mix 1中，包括1-3U/μL T4PNK、1-4.5U/μL Klenow Fragment、0.25-0.5U/μL LA Taq DNA Polymerase、0.3-0.9U/μL T4DNAPolymerase、0.5-2.5nmol/μL dNTP、0.5-2.5nmol/μL dATP和50％(体积百分含量)10×T4PNK buffer，余量为水。5×Fast Library Repaire Mix 1中，优选包括2U/μL T4PNK、3U/μL Klenow Fragment、0.25U/μL LA Taq DNA Polymerase、0.6U/μL T4DNA Polymerase、1.25nmol/μL dNTP、1nmol/μL dATP和50％(体积百分含量)10×T4PNK buffer，余量为水。
组件乙具体可为Adaptor Ligation Mix 2。
所述试剂盒中还可包括组件丙。组件丙为接头。接头(Adaptor)具体可为将单链DNA分子HS-PEIA-1.1和单链DNA分子HS-PEIA-1.2退火得到的DNA分子。HS-PEIA-1.1如序列表的序列1所示；HS-PEIA-1.2如序列表的序列2所示。
Adaptor Ligation Mix 2、组件丙和水(具体为ddH2O)组成30μL体系。该30μL体系中，ATP的浓度为2.5-8nmol/μL、T4DNA Ligase的浓度为26.5-132U/μL、PEG 8000的浓度为21.3％-53.4％(体积百分含量)。该30μL体系中，组件丙的浓度为0.6-3μM。该30μL体系中，ATP的浓度优选为5.6nmol/μL、T4DNA Ligase的浓度优选为85U/μL、PEG 8000的浓度优选为26.7％(体积百分含量)。该30μL体系中，组件丙的浓度优选为0.67μM。该30μL体系中，ATP的浓度为2.5-8nmol/μL、T4DNA Ligase的浓度为26.5-132U/μL、PEG 8000的浓度为21.3％-53.4％(体积百分含量)、10×T4PNK Buffer的浓度为10％(体积百分含量)，组件丙的浓度为0.6-3μM，余量为水。该30μL体系中，ATP的浓度优选为5.6nmol/μL、T4DNA Ligase的浓度优选为85U/μL、PEG8000的浓度优选为26.7％(体积百分含量)、10×T4PNK Buffer的浓度为10％(体积百分含量)，组件丙的浓度优选为0.67μM，余量为水。
所述组件甲为溶液形式，溶剂为T4PNK buffer或T4PNK buffer的浓缩液。
所述组件乙为溶液形式，溶剂为T4PNK buffer或T4PNK buffer的浓缩液。
所述试剂盒还包括组件丁；所述组件丁包括标签和引物。优选地，所述标签为单链标签，所述引物为单链引物。所述引物为测序引物。所述标签具体可为Index N。Index N如序列表的序列3所示。Index N中，N代表A/T/C/G四个碱基中的任意一个。在一个具体实施例中，Index N中的“NNNNNNNN”为“ATGACGTA”。所述测序引物具体可为index P1。index P1如序列表的序列4所示。优选地，所述组件丁还包括KAPA HiFi Mix。
所述试剂盒还包括组件戊；组件戊为用于纯化DNA的物质。具体可为AgencourtAMPure XP Reagent。
本发明还保护以上任一所述试剂盒在DNA建库中的应用。
所述DNA建库为构建外周血游离DNA的文库或构建ctDNA的文库。
本发明还提供了一种构建DNA文库的方法，包括如下步骤：
(1)将含有目标核酸的溶液作为模板，进行末端修复和加A反应；初始反应体系由模板、T4PNK、Klenow Fragment、LA Taq DNA Polymerase、T4DNA Polymerase、dNTP、dATP和T4PNK buffer组成；初始反应体系中，模板核酸含量为1-40ng，T4PNK的浓度为0.2-0.6U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.3-0.9U/μL，LA Taq DNA Polymerase的浓度为0.05-0.1U/μL，T4DNA Polymerase的浓度为0.06-0.18U/μL，dNTP的浓度为0.1-0.37nmol/μL，dATP的浓度为0.1-0.3nmol/μL；
(2)取末端修复和加A反应的产物，进行接头连接；初始反应体系由末端修复和加A反应的产物、接头、ATP、T4DNA Ligase、PEG 8000和T4PNK buffer组成；初始反应体系中，ATP的浓度为1-3nmol/μL，T4DNA Ligase的浓度为16-48U/μL，PEG 8000的体积百分含量为8-15％。
步骤(1)的初始反应体系中，T4PNK的浓度优选为0.4U/μL，Klenow Fragment的浓度优选为0.6U/μL，LA Taq DNA Polymerase的浓度优选为0.05U/μL，T4DNA Polymerase的浓度优选为0.12U/μL，dNTP的浓度优选为0.25nmol/μL，dATP的浓度优选为0.2nmol/μL。
步骤(2)的初始反应体系中，ATP的浓度优选为2.1nmol/μL，T4DNA Ligase的浓度优选为32U/μL，PEG 8000的体积百分含量优选为10％。
步骤(2)的初始反应体系中，接头的浓度为0.25-1μM。
步骤(2)的初始反应体系中，接头的浓优选为0.25μM。
末端修复和加A反应的初始反应体系中，dATP指的是dNTP以外额外加入的dATP。
末端修复和加A反应的反应条件具体可为：30-37℃孵育30分钟，然后72-75℃孵育30分钟；
接头连接的反应条件具体可为“16℃、12小时以上”或者“23℃、60分钟”。
所述方法还包括将接头连接的产物进行纯化的步骤。具体可采用AgencourtAMPure XP Reagent进行纯化。
所述方法还包括prePCR的步骤。prePCR的初始反应体系由核酸类产物、KAPA HiFiMix、标签和引物组成；所述核酸类产物为接头连接的产物或接头连接的产物进行纯化后的产物。所述初始反应体系具体可由22μL核酸类产物、25μLKAPA HiFi Mix、1.5μL标签和1.5μL引物组成。所述标签具体可为Index N。Index N如序列表的序列3所示。Index N中，N代表A/T/C/G四个碱基中的任意一个。在一个具体实施例中，Index N中的“NNNNNNNN”为“ATGACGTA”。所述“1.5μL标签”具体可为1.5μL10pM标签溶液。所述引物为测序引物。所述测序引物具体可为index P1。index P1如序列表的序列4所示。所述“1.5μL引物”具体可为1.5μL 10pM引物溶液。所述prePCR的反应程序具体如下：98℃45s；98℃20s、62℃30s、72℃30s，若干个循环；72℃5min。所述若干的循环的含义：1ng≤X＜10ng,推荐10-15个循环；10ng≤X＜20ng,推荐9个循环；20ng≤X＜40ng,推荐8个循环；X＝40ng,推荐7个循环。X指的是核酸类产物中的DNA含量。
所述方法还包括将prePCR的产物进行纯化的步骤。具体可采用AgencourtAMPureXP Reagent进行纯化。
所述目标核酸具体可为外周血游离DNA。
所述含有目标核酸的溶液的制备方法具体如下：
(1)取EDTA抗凝外周血，4℃、1600g转速离心10分钟，收集上层血浆。
(2)取步骤(1)得到的血浆，4℃、12000g转速离心10分钟，收集上层血浆。
(3)取步骤(2)得到的血浆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒进行提取，得到游离核酸溶液。
本发明提供试剂盒及其使用方法的流程示意图见图2。
本发明通过综合挑选DNA片段修复酶，以及连接酶等，并将所有的反应酶和缓冲液优化成两个MIX，分别为5×Fast Library Repaire Mix 1和Adaptor Ligation Mix 2。经验证，在相同建库起始量的情况下，采用本发明提供的试剂盒的建库产量比KAPA-Hyper试剂盒要高20％以上。
本发明在不影响测序深度的前体下，首先对血浆cfDNA建库的建库起始量进行了优化，建库起始量低至10ng，并且在数据量足够的前提下能保证达到1000X的去重测序深度。本发明提供的试剂盒及其应用方法，尽可能减少了建库过程中DNA损失，减少了血浆使用量，降低了建库成本，缩短了建库时间，操作更简便，结果更稳定可靠。本发明对于提高建库效率，减少人力成本有重要意义。
附图说明
图1为KAPA-LTP试剂盒的工作原理流程示意图
图2为本发明提供试剂盒及其使用方法的流程示意图。
图3为单次试验中游离核酸溶液的检测结果。
图4为单次试验的文库溶液的检测结果。
图5为实施例4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
T4PNK：英文全称“T4Polynucleotide Kinase”,中文全称“T4多聚核苷酸激酶”
Klenow Fragment：DNA聚合酶I(DNA pol 1)大片段，又称克列诺片段、克列诺酶、Klenow enzyme或Klenow片段。
LA Taq DNA Polymerase：中文全称“LA Taq DNA聚合酶”。
T4DNA Polymerase：中文全称“T4DNA聚合酶”。
T4DNA Ligase：中文全称“T4DNA连结酶”。
实施例1、试剂盒的制备
5×Fast Library Repaire Mix 1的组成见表1。
表1
| 组分 | |
| 10×T4PNK buffer | 5μL |
| T4PNK | 范围值：1-3U/μL；最佳参考值：2U/μL |
| Klenow Fragment | 范围值：1-4.5U/μL；最佳参考值：3U/μL |
| LA Taq DNA Polymerase | 范围值：0.25-0.5U/μL；最佳参考值：0.25U/μL |
| T4DNA Polymerase | 范围值：0.3-0.9U/μL；最佳参考值：0.6U/μL |
| dNTP | 范围值：0.5-2.5nmol/μL；最佳参考值：1.25nmol/μL |
| dATP(dNTP以外额外加入的dATP) | 范围值：0.5-2.5nmol/μL；最佳参考值：1nmol/μL |
| ddH2O | 补足至10μL |
对于10×T4PNK buffer和ddH2O来说，表1的第二列数据为加入量；对于其他组分来说，表1的第二列数据为该组分在5×Fast Library Repaire Mix 1中的浓度。
其中，dNTP由dATP、dCTP、dTTP、dGTP按照1:1:1:1比例混合而成。例如，dNTP浓度为1.25nmol/μL，指的是dATP、dCTP、dTTP和dGTP浓度均为1.25nmol/μL。
Adaptor Ligation Mix 2的组成见表2。
表2
| 组分 | |
| 10×T4PNK Buffer | 3μl |
| ATP | 范围值：2.5-8nmol/μL；最佳参考值：5.6nmol/μL |
| T4DNA Ligase | 范围值：26.5-132U/μL；最佳参考值：85U/μL |
| PEG 8000 | 范围值：21.3％-53.4％(体积百分含量)；最佳参考值：26.7％ |
对于10×T4PNK buffer来说，表2的第二列数据为该组分在30μL体系中的加入量；对于其他组分来说，表2的第二列数据为该组分在30μL体系中的浓度。所述30μL体系，为表4中Adaptor Ligation Mix 2、接头和ddH2O混合得到的30μL体系。
实施例2、方法的建立
一、从血浆中提取游离核酸(血浆来自于正常人群或肿瘤患者)
1、取EDTA抗凝外周血，4℃、1600g转速离心10分钟，收集上层血浆。
2、取步骤1得到的血浆，4℃、12000g转速离心10分钟，收集上层血浆。
3、取步骤2得到的血浆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒进行提取，得到游离核酸溶液。
取游离核酸溶液，采用 dsDNA BR分析试剂盒(Thermo FisherScientific，货号Q32850)检测dsDNA浓度(仪器为Agilent 2100Bioanalyzer)。
单次试验中游离核酸溶液的检测结果见图3。
二、建立血浆cfDNA文库
1、取步骤一得到的游离核酸溶液，作为模板样本，进行末端修复和加A反应，初始反应体系组成见表3。
表3
| 组分 | 体积(μL) |
| 模板样本 | X(DNA含量为1-40ng) |
| 5×Fast Library Repaire Mix 1 | 10 |
| ddH2O | 50-X-10 |
| 总体积 | 50 |
反应条件：30-37℃孵育30分钟，然后72-75℃孵育30分钟。
完成上述反应后的体系为终止体系，即为末端修复和加A反应的产物，简称产物。
产物4℃保存。
2、取步骤1得到的产物，进行接头连接，初始反应体系组成见表4。
表4
| 组分 | 体积(μL) |
| 末端修复和加A反应的产物 | 50 |
| Adaptor Ligation Mix 2 | 24.6 |
| 接头(40μM母液) | X(0.5-2μL) |
| ddH2O | 30-24.6-X |
| 总体积 | 80 |
接头(Adaptor)：将单链DNA分子HS-PEIA-1.1和单链DNA分子HS-PEIA-1.2退火得到的DNA分子。0.5≤X≤2。
HS-PEIA-1.1(序列1)：5’-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
HS-PEIA-1.2(序列2)：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’。
反应条件：“16℃、12小时”或者“23℃、60分钟”。
模板样本中的DNA含量为10ng以下时，本步骤的反应条件建议采用“16℃、12小时”。
完成上述反应后的体系为终止体系，即为接头连接的产物，简称产物。
产物4℃保存。
3、取步骤2的产物，进行纯化，体系组成见表5。
表5
| 组分 | 体积(μL) |
| 接头连接的产物 | 80 |
| AgencourtAMPure XP Reagent | 64 |
| 总体积 | 144 |
操作步骤如下：
(1)取反应管，加入各个组分，然后吹打数次混合均匀(不能涡旋)；
(2)室温下静置孵育10分钟(使DNA与磁珠结合)；
(3)将反应管置于磁力架上，吸附至液体澄清；
(4)小心移除并弃掉上清；
(5)保持反应管置于磁力架上，向反应管中加入400μL 80％乙醇水溶液；
(6)转动反应管，室温孵育30秒以上；
(7)小心移除并弃掉上清，尽量将反应管内所有液体吸出，但不能碰到磁珠；
(8)保持反应管置于磁力架上，向反应管中加入400μL 80％乙醇水溶液；
(9)转动反应管，室温孵育30秒以上；
(10)小心移除并弃掉上清，尽量将反应管内所有液体吸出，但不能碰到磁珠；
(11)反应管内的磁珠室温干燥至表面无液体反光，呈磨砂状态，磁珠出现微裂最佳；
(12)向反应管内加入22μl水，吹打混匀，室温孵育5分钟。
完成上述步骤后，反应管内的体系即为纯化产物(包括磁珠和水)。
4、取步骤3得到的纯化产物，进行prePCR，体系组成见表6。
表6
| 组分 | 体积(μL) |
| 纯化产物 | 22 |
| KAPA HiFi Mix | 25 |
| Index N(10pM母液) | 1.5 |
| Index P1(10pM母液) | 1.5 |
| 总体积 | 50 |
Index N(单链，标签)序列如下(序列3)：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
其中，NNNNNNNN是文库的标签序列，N代表A/T/C/G四个碱基中的任意一个。在一个具体实施例中，“NNNNNNNN”为“ATGACGTA”。
index P1(单链，测序引物)序列如下(序列4)：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
反应程序见表7。
表7
表7中，X指的是纯化产物中的DNA含量。
完成上述反应后的体系为终止体系，即为prePCR的产物。
5、取prePCR的产物，将反应管置于磁力架上，转移上清至新的1.5ml EP管中。
6、取步骤5得到的上清，进行纯化，体系组成见表8。
表8
| 组分 | 体积(μL) |
| 步骤5得到的上清 | 全部 |
| AgencourtAMPure XP reagent | 50 |
操作步骤如下：
(1)取反应管，加入各个组分，然后吹打数次混合均匀(不能涡旋)；
(2)室温下静置孵育10分钟(使DNA与磁珠结合)；
(3)将反应管置于磁力架上，吸附至液体澄清；
(4)小心移除并弃掉上清；
(5)保持反应管置于磁力架上，向反应管中加入400μL 80％乙醇水溶液；
(6)转动反应管，室温孵育30秒以上；
(7)小心移除并弃掉上清，尽量将反应管内所有液体吸出，但不能碰到磁珠；
(8)保持反应管置于磁力架上，向反应管中加入400μL 80％乙醇水溶液；
(9)转动反应管，室温孵育30秒以上；
(10)小心移除并弃掉上清，尽量将反应管内所有液体吸出，但不能碰到磁珠；
(11)反应管内的磁珠室温干燥至表面无液体反光，呈磨砂状态，磁珠出现微裂最佳；
(12)向反应管内加入32μl水，吹打混匀，37℃孵育5分钟。
(13)将反应管置于磁力架上，吸附至液体澄清，将上清转移到新的离心管中，用ddH2O调整体积为50μl，即为文库溶液。
取文库溶液，采用 dsDNA BR分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific，货号Q32850)检测dsDNA浓度(仪器为Agilent 2100Bioanalyzer)。
单次试验的其中一个文库溶液的检测结果见图4。
实施例3、实施例1制备的试剂盒以及实施例2建立的方法的应用
取知情同意的志愿者(正常人群或肿瘤患者)的EDTA抗凝外周血，应用实施例1制备的试剂盒按照实施例2建立的方法进行检测(X＝0.5)。
一、末端修复和加A反应中采用不同的T4PNK浓度
末端修复和加A反应的初始反应体系中，T4PNK的浓度为0.2U/μL、0.4U/μL或0.6U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.6U/μL，LA Taq DNA Polymerase的浓度为0.05U/μL，T4DNAPolymerase的浓度为0.12U/μL，dNTP的浓度为0.25nmol/μL，dATP的浓度为0.2nmol/μL。
进行接头连接的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
结果见表9。
表9不同浓度T4PNK时50μl文库产量
| T4PNK酶浓度 | 0.2U/μL | 0.4U/μL | 0.6U/μL |
| 文库产量 | 640ng | 700ng | 600ng |
二、末端修复和加A反应中采用不同的Klenow Fragment浓度
末端修复和加A反应的初始反应体系中，Klenow Fragment的浓度为0.3U/μL、0.6U/μL或0.9U/μL，T4PNK的浓度为0.4U/μL，LA Taq DNA Polymerase的浓度为0.05U/μL，T4DNA Polymerase的浓度为0.12U/μL，dNTP的浓度为0.25nmol/μL，dATP的浓度为0.2nmol/μL。
进行接头连接的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
结果见表10。
表10不同浓度Klenow Fragment时50μl文库产量
| Klenow Fragment浓度 | 0.3U/μL | 0.6U/μL | 0.9U/μL |
| 文库产量 | 600ng | 720ng | 640ng |
三、末端修复和加A反应中采用不同的LA Taq DNA Polymerase浓度
末端修复和加A反应的初始反应体系中，LA Taq DNA Polymerase的浓度为0.05U/μL、0.07U/μL或0.1U/μL，T4PNK的浓度为0.4U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.6U/μL，T4DNA Polymerase的浓度为0.12U/μL，dNTP的浓度为0.25nmol/μL，dATP的浓度为0.2nmol/μL。
进行接头连接的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
结果见表11。
表11不同浓度LA Taq DNA Polymerase时50μl文库产量
| LA Taq DNA Polymerase浓度 | 0.05U/μL | 0.07U/μL | 0.1U/μL |
| 文库产量 | 720ng | 700ng | 640ng |
四、末端修复和加A反应中采用不同的T4DNA Polymerase浓度
末端修复和加A反应的初始反应体系中，T4DNA Polymerase的浓度为0.06U/μL、0.12U/μL或0.18U/μL，T4PNK的浓度为0.4U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.6U/μL，LA TaqDNA Polymerase的浓度为0.05U/μL，dNTP的浓度为0.25nmol/μL，dATP的浓度为0.2nmol/μL。
进行接头连接的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
结果见表12。
表12不同浓度T4DNA Polymerase时50μl文库产量
| T4DNA Polymerase浓度 | 0.06U/μL | 0.12U/μL | 0.18U/μL |
| 文库产量 | 600ng | 710ng | 645ng |
五、末端修复和加A反应中采用不同的dNTP浓度
末端修复和加A反应的初始反应体系中，dNTP的浓度为0.1nmol/μL、0.25nmol/μL或0.37nmol/μL，T4PNK的浓度为0.4U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.6U/μL，LA Taq DNAPolymerase的浓度为0.05U/μL，T4DNA Polymerase的浓度为0.12U/μL，dATP的浓度为0.2nmol/μL。
进行接头连接的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
结果见表13。
表13不同浓度dNTP时50μl文库产量
| dNTP浓度 | 0.10nmol/μL | 0.25nmol/μL | 0.37nmol/μL |
| 文库产量 | 600ng | 680ng | 620ng |
六、末端修复和加A反应中采用不同的dATP浓度
末端修复和加A反应的初始反应体系中，dATP的浓度为0.1nmol/μL、0.2nmol/μL或0.3nmol/μL，T4PNK的浓度为0.4U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.6U/μL，LA Taq DNAPolymerase的浓度为0.05U/μL，T4DNA Polymerase的浓度为0.12U/μL，dNTP的浓度为0.25nmol/μL。
进行接头连接的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
结果见表14。
表14不同浓度dATP时50μl文库产量
| dATP浓度 | 0.1nmol/μL | 0.2nmol/μL | 0.3nmol/μL |
| 文库产量 | 605ng | 740ng | 645ng |
七、接头连接中采用不同的ATP浓度
进行末端修复和加A反应的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
接头连接的初始反应体系中，ATP浓度为1nmol/μL、2.1nmol/μL或3nmol/μL，T4DNALigase浓度为32U/μL，PEG 8000体积百分含量为10％。
结果见表15。
表15不同浓度ATP时50μl文库产量
| ATP浓度 | 1nmol/μL | 2.1nmol/μL | 3nmol/μL |
| 文库产量 | 560ng | 680ng | 645ng |
八、接头连接中采用不同的T4DNA Ligase浓度
进行末端修复和加A反应的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
接头连接的初始反应体系中，T4DNA Ligase浓度为16U/μL、32U/μL或48U/μL，ATP浓度为2.1nmol/μL，PEG 8000体积百分含量为10％。
结果见表16。
表16不同浓度T4DNA Ligase时50μl文库产量
| T4DNA Ligase浓度 | 16U/μL | 32U/μL | 48U/μL |
| 文库产量 | 650ng | 720ng | 700ng |
九、接头连接中采用不同的PEG 8000浓度
进行末端修复和加A反应的初始反应体系中，各组分均采用最佳参考值。
接头连接的初始反应体系中，PEG 8000体积百分含量为8％、10％或15％，ATP浓度为2.1nmol/μL，T4DNA Ligase浓度为32U/μL。
结果见表17。
表17不同浓度PEG 8000时50μl文库产量
| PEG 8000的体积百分含量 | 8％ | 10％ | 15％ |
| 文库产量 | 700ng | 730ng | 690ng |
实施例4、本申请的方法与现有技术的比较
一、从血浆中提取游离核酸
1、取知情同意的志愿者(正常人群)的EDTA抗凝外周血，4℃、1600g转速离心10分钟，收集上层血浆。
2、取步骤1得到的血浆，4℃、12000g转速离心10分钟，收集上层血浆。
3、取步骤2得到的血浆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒进行提取，得到游离核酸溶液。
二、取步骤一得到的游离核酸溶液，应用实施例1制备的试剂盒按照实施例2的步骤二的方法进行检测。
末端修复和加A反应的初始反应体系中，T4PNK的浓度为0.4U/μL，KlenowFragment的浓度为0.6U/μL，LA Taq DNA Polymerase的浓度为0.05U/μL，T4DNAPolymerase的浓度为0.12U/μL，dNTP的浓度为0.25nmol/μL，dATP的浓度为0.2nmol/μL。
接头连接的初始反应体系中，ATP浓度为2.1nmol/μL，T4DNA Ligase浓度为32U/μL，PEG 8000体积百分含量为10％。
三、取步骤一得到的游离核酸溶液，应用市售KAPA-Hyper试剂盒进行检测(严格按照试剂盒的说明书操作)。
步骤二的结果和步骤三的结果见图5，结果表明，在相同建库起始量的情况下，采用本发明提供的试剂盒并按本发明提供的方法进行检测，建库产量比KAPA-Hyper试剂盒要高20％以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津华大医学检验所有限公司
广州华大基因医学检验所有限公司
深圳华大基因股份有限公司
<120> 一种用于DNA建库的试剂盒及其应用
<130> GNCYX170772
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tacactcttt ccctacacga cgctcttccg atct 34
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
Claims (10)
1.一种用于DNA建库的试剂盒，包括组件甲和组件乙；
组件甲包括配比如下的各个组分：
1-3U T4PNK：1-4.5U Klenow Fragment：0.25-0.5U LA Taq DNA Polymerase：0.3-0.9U T4DNA Polymerase：0.5-2.5nmol dNTP：0.5-2.5nmol dATP；
组件乙包括配比如下的各个组分：
2.5-8nmol ATP：26.5-132U T4DNA Ligase：0.213μL-0.534μLPEG 8000。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
组件甲包括配比如下的各个组分：
2U T4PNK：3U Klenow Fragment：0.25U LA Taq DNA Polymerase：0.6U T4 DNAPolymerase：1.25nmol dNTP：1nmol dATP；
组件乙包括配比如下的各个组分：
5.6nmol ATP：85U T4DNA Ligase：0.267μLPEG 8000。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括组件丙；组件丙为接头。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述接头为将单链DNA分子HS-PEIA-1.1和单链DNA分子HS-PEIA-1.2退火得到的DNA分子；HS-PEIA-1.1如序列表的序列1所示；HS-PEIA-1.2如序列表的序列2所示。
5.如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括组件丁；所述组件丁包括标签和引物；
任选地，所述标签为单链标签，所述引物为单链引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述标签为Index N；Index N如序列表的序列3所示；
任选地，所述引物为index P1；index P1如序列表的序列4所示；
任选地，所述试剂盒还包括组件戊；组件戊为用于纯化DNA的物质；
任选地，所述组件戊为AgencourtAMPure XP Reagent。
7.权利要求1至6中任一所述试剂盒在DNA建库中的应用；
任选地，所述DNA建库为构建外周血游离DNA的文库或构建ctDNA的文库。
8.一种构建DNA文库的方法，包括如下步骤：
(1)将含有目标核酸的溶液作为模板，进行末端修复和加A反应；
初始反应体系由模板、T4PNK、Klenow Fragment、LA Taq DNA Polymerase、T4 DNAPolymerase、dNTP、dATP和T4PNK buffer组成；初始反应体系中，模板核酸含量为1-40ng，T4PNK的浓度为0.2-0.6U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.3-0.9U/μL，LA Taq DNAPolymerase的浓度为0.05-0.1U/μL，T4DNA Polymerase的浓度为0.06-0.18U/μL，dNTP的浓度为0.1-0.37nmol/μL，dATP的浓度为0.1-0.3nmol/μL；
(2)取末端修复和加A反应的产物，进行接头连接；初始反应体系由末端修复和加A反应的产物、接头、ATP、T4DNA Ligase、PEG 8000和T4PNK buffer组成；初始反应体系中，ATP的浓度为1-3nmol/μL，T4DNA Ligase的浓度为16-48U/μL，PEG 8000的体积百分含量为8-15％。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤(1)的初始反应体系中，T4PNK的浓度为0.4U/μL，Klenow Fragment的浓度为0.6U/μL，LA Taq DNA Polymerase的浓度为0.05U/μL，T4DNA Polymerase的浓度为0.12U/μL，dNTP的浓度为0.25nmol/μL，dATP的浓度为0.2nmol/μL；
步骤(2)的初始反应体系中，ATP浓度为2.1nmol/μL，T4DNA Ligase浓度为32U/μL，PEG8000体积百分含量为10％；
任选地，步骤(1)所述末端修复和加A反应的具体反应条件为：30-37℃孵育30分钟，然后72-75℃孵育30分钟；
任选地，步骤(2)所述接头连接反应的具体反应条件为：16℃、12小时以上，或者23℃、60分钟；
任选地，所述方法还包括将接头连接的产物进行纯化的步骤；优选地，采用AgencourtAMPure XP Reagent进行纯化；
任选地，所述目标核酸为外周血游离DNA。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述方法还包括prePCR的步骤；
任选地，所述方法还包括将prePCR的产物进行纯化的步骤；优选地，采用AgencourtAMPure XP Reagent进行纯化。
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- 2017-03-31 CN CN201710205827.XA patent/CN108660135B/zh active Active
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