CN117625626A - RNAi在提高苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白防治二化螟或草地贪夜蛾效果中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及RNAi在提高苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白防治二化螟或草地贪夜蛾效果中的应用。其中，沉默靶标昆虫自体snx‑20基因的表达可以提高杀虫蛋白对该靶标昆虫的防治效果，所述杀虫蛋白可以为Cry蛋白，所述靶标昆虫可以为鳞翅目（Lepidoptera）昆虫中的至少一种。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治领域，特别涉及双链RNA作为杀虫增效剂。
背景技术
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt）表达的杀虫蛋白可以有效防治靶标害虫和减少化学农药的使用。然而靶标害虫可以通过一系列防御反应削弱Bt蛋白的杀虫活性，因此单一使用杀虫蛋白用来防治靶标害虫的效果有限、并且容易诱导靶标害虫对杀虫蛋白产生抗性。若能筛选获得靶标害虫防御相关基因，并通过使用防御基因的双链RNA来抑制防御反应，将有助于极大程度地提高Bt杀虫蛋白的杀虫活性，并基于此，可以大大降低Bt杀虫蛋白的用量，降低成本，并且可能延缓靶标害虫抗性的产生。然而，目前对于防御基因的研究十分有限，尚未明确对Bt杀虫蛋白具有明细防御作用的基因。
发明内容
本发明之一提供了一种沉默靶标昆虫自体snx-20基因表达在提高杀虫蛋白对所述靶标昆虫防治效果中的应用，其中，所述杀虫蛋白为Cry蛋白，所述靶标昆虫为鳞翅目（Lepidoptera）昆虫中的至少一种。
在一个具体实施方式中，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的沉默效率在40%以上。
在一个具体实施方式中，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的沉默效率在50%以上。
在一个具体实施方式中，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的沉默效率在60%以上。
在一个具体实施方式中，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的沉默效率在70%以上。
在一个具体实施方式中，所述靶标昆虫为螟蛾科（Pyralidae）昆虫中的至少一种，或夜蛾科（Noctuidae）昆虫中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述靶标昆虫为禾草螟属（Chilo）昆虫中的至少一种，或灰翅夜蛾属（Spodoptera）昆虫中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述靶标昆虫为二化螟（Chilo suppressalis Walker）或草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry9Aa蛋白；对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry1Fa蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry9Aa3蛋白；对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry1Fa3蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如Genbank No. ADE60735.1所示的Cry9Aa3蛋白；对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示的Cry1Fa3蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如SEQID No. 18的Cry9Aa655蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ ID No. 1所示或SEQ ID No. 4所示；对于所述夜蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ IDNo. 7或SEQ ID No. 10所示。其中，在作为RNA时，序列中的t替换为u。
本发明之二提供了一种联合用药物，其包括用于沉默靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA和Cry蛋白，所述靶标昆虫为本发明之一中任意一项所述的应用中的所述的靶标昆虫；所述Cry蛋白为本发明之一中任意一项所述的应用中的所述Cry蛋白。其中，所述dsRNA和所述Cry蛋白可以先后施用，也可以同时施用，优选先后施用；优选在施用所述dsRNA 48小时后再施用所述Cry蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 4所示；对于所述夜蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 10所示。其中，在作为RNA时，序列中的t替换为u。
在一个具体实施方式中，所述靶标昆虫为为鳞翅目（Lepidoptera）昆虫中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述靶标昆虫为螟蛾科（Pyralidae）昆虫中的至少一种，或夜蛾科（Noctuidae）昆虫中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述靶标昆虫为禾草螟属（Chilo）昆虫中的至少一种，或灰翅夜蛾属（Spodoptera）昆虫中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述靶标昆虫为二化螟（Chilo suppressalis Walker）或草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry9Aa蛋白；对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry1Fa蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry9Aa3蛋白；对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry1Fa3蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如Genbank No. ADE60735.1所示的Cry9Aa3蛋白；对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示的Cry1Fa3蛋白。
在一个具体实施方式中，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如SEQID No. 18的Cry9Aa655蛋白。
本发明的有益效果：本发明首次发现沉默鳞翅目昆虫自体的snx-20基因的表达可以显著提升Cry蛋白对所述鳞翅目昆虫的活性。例如，沉默二化螟Cssnx-20基因的表达可以显著提升Cry9A蛋白对二化螟的活性；沉默草地贪夜蛾Sfsnx-20基因的表达可以显著提升Cry1F蛋白对草地贪夜蛾的活性。据此，可以将其dsRNA制剂与Cry蛋白制剂联合用药，以提高生物源杀虫剂的活性，并延缓害虫对生物源杀虫剂的抗性。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
实施例1：二化螟的snx-20基因的克隆和dsCssnx-20的制备。
根据鳞翅目害虫二化螟（Chilo suppressalis Walker）的基因组（NCBI Genomeassemly GCA_004000445.1）设计二化螟的snx-20基因（Cssnx-20，SEQ ID No. 1）全长的引物对。其中上游引物为Cssnx-20F（SEQ ID No. 2），下游引物为Cssnx-20R（SEQ ID No. 3）。
利用RNeasy Mini Kit试剂盒（74106，QIAGEN公司）提取二化螟三龄幼虫的总RNA，使用反转录试剂盒（R223-01，南京诺唯赞生物公司）进行反转录，得到cDNA，然后以cDNA为模板，以Cssnx-20F和Cssnx-20R为引物，进行PCR，并将PCR产物克隆到pEASYBluntZero质粒（北京全式金生物公司）上，得到含有Cssnx-20全长基因的pEASYBluntZero-Cssnx-20阳性质粒。
在SnapDragon-dsRNA Design网站（https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl）设计用于RNA干扰的dsRNA片段（dsCssnx-20，其正义链的碱基序列如SEQID No.4所示）。然后利用T7 RiboMAX™Express RNAi System试剂盒（P1700，Promega）以pEASYBluntZero-Cssnx-20为模板，以dsCssnx-20F（SEQ ID No. 5）和dsCssnx-20R（SEQ IDNo. 6）为引物合成Cssnx-20的dsRNA片段，最后溶于无酶水中，得到dsCssnx-20水溶液。
实施例2：草地贪夜蛾的snx-20基因的克隆和dsSfsnx-20的制备。
根据鳞翅目害虫草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的转录组设计草地贪夜蛾的snx-20基因（Sfsnx-20，SEQ ID No. 7）全长的引物对。其中上游引物为Sfsnx-20F（SEQID No. 8），下游引物为Sfsnx-20R（SEQID No. 9）。
利用RNeasy Mini Kit试剂盒（74106，QIAGEN公司）提取草地贪夜蛾三龄幼虫的总RNA，使用反转录试剂盒（R223-01，南京诺唯赞生物公司）进行反转录，得到cDNA，然后以cDNA为模板，以Sfsnx-20F和Sfsnx-20R为引物，进行PCR，并将PCR产物克隆到pEASYBluntZero质粒（北京全式金生物公司）上，得到含有Sfsnx-20全长基因的pEASYBluntZero-Sfsnx-20阳性质粒。
在SnapDragon-dsRNA Design网站（https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl）设计用于RNA干扰的dsRNA片段（dsSfsnx-20，其正义链的碱基序列如SEQID No. 10所示）。然后利用T7 RiboMAX™Express RNAi System试剂盒（P1700，Promega）以pEASYBluntZero-Sfsnx-20为模板，以dsSfsnx-20F（SEQ ID No. 11）和dsSfsnx-20R（SEQID No. 12）为引物合成Sfsnx-20的dsRNA片段，最后溶于无酶水中，得到dsSfsnx-20水溶液。
对比例1：阴性对照dsgfp的制备。
由上海生工公司合成序列如SEQ ID No. 13所示的gfp DNA。
利用T7 RiboMAX™ Express RNAi System试剂盒（P1700，Promega）以gfp DNA为模板，以gfpF（SEQ ID No. 14）和gfpR（SEQ ID No. 15）为引物，合成gfp的dsRNA片段（dsgfp，其正义链的碱基序列如SEQ ID No. 13所示），最后溶于无酶水中，得到dsgfp水溶液。
实施例3：Cry9Aa655蛋白的制备。
蛋白提取：以cry9Aa655-F（SEQ ID No. 16）和cry9Aa655-R（SEQ ID No. 17）为引物，以合成的cry9Aa3基因（Genbank No. GQ249293.1，其氨基酸GenbankNo. ADE60735.1）为模板，克隆cry9Aa3基因第1-655位氨基酸（SEQ ID No. 18）的DNA序列，并连接到pEB表达载体上，得到pEB-cry9Aa655，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)/pEB-cry9Aa655。同时，将pEB空载转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)/pEB。
将大肠杆菌BL21(DE3)/pEB-cry9Aa655接种于5mL含有1‰的氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C 220 r/min培养8 h，得到活化培养液；取1%的活化培养液接种于300 mL含有1‰的氨苄青霉素的 LB液体培养基中，于37°C 220 r/min培养至OD600=0.8；加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，然后于18°C 150 r/min诱导14 h，得到诱导培养液；将诱导培养物12000 g离心8 min收集菌体，将收集到的菌体悬浮于结合缓冲液（50 mM咪唑，20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 8.0），其中结合缓冲液与菌体的用量比以结合缓冲液与诱导培养液的体积比计为7：100；超声破碎细胞5 min（超声功率：70%；超声：3s，暂停：5s）；13000 g离心15 min，收集上清液，通过SDS-PAGE分析上清液以确认目标蛋白Cry9Aa655成功表达（以相同条件下获得的BL21(DE3)/pEB上清液作为阴性对照）。
亲和纯化：将上一步得到的20 mL上清液加入2 mL 镍（Ni）亲和柱料至纯化柱中；以5倍柱体积结合缓冲液洗脱杂蛋白； 以10 mL洗脱液II洗脱目的蛋白Cry9Aa655并收集；将收集到的Cry9Aa655蛋白使用脱盐柱（HiPrep 26/10，Cytiva）在AKTA-Avant蛋白纯化系统（Cytiva）中进行脱盐纯化，其中缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；流速为8mL/min，检测UV280 nm，在蛋白峰处收集脱盐后的蛋白溶液，获得纯化的Cry9Aa655蛋白溶液。
实施例4：Cry1Fa3晶体蛋白的制备。
将能够表达Cry1Fa3蛋白（SEQ ID No. 19）的Bt菌株HD73接种于5mL的LB液体培养基中，于30°C 220 r/min培养12 h，得到活化培养液；取1%的活化培养液接种于300 mL的1/2LB液体培养基中，于30°C 220 r/min培养至镜检观察有50%以上的晶体释放时停止培养；9000 g离心15 min收集菌体，将收集到的菌体用预冷的1 M NaCl洗涤，13000 g离心后1min再用预冷的无菌水洗涤两次；收集沉淀，重悬于裂解液（5.30 g Na2CO3，18.61 gNaHCO3，超纯水定容至1L，pH 10.0）中，搅拌均匀，冰浴置于摇床上100 rpm摇1 h；9000 g离心15 min后，收集上清液，加入1/7体积的4 M NaAc-HAc（pH4.8），边加边缓慢搅拌均匀，冰浴静置1 h；9000 g离心15 min后，收集沉淀用预冷的无菌水充分洗涤3次，每次9000 g离心15 min，将NaAc-HAc洗涤干净；收集沉淀，加入5 mL 50 mM Na2CO3缓冲液溶解，充分搅拌至沉淀溶解，得到Cry1Fa3蛋白溶液，并通过SDS-PAGE分析以确定Cry1Fa3蛋白。
实施例5：对二化螟的生物活性测定。
二化螟人工饲料配方：大豆粉40.0 g，酵母粉30.0 g，干酪素15.0 g，蔗糖12.0g，鲜茭白145.0 g，琼脂18.0 g，抗坏血酸钠(Vc)4.5 g，胆固醇0.25g，氯化胆碱 0.40 g，威氏盐0.15 g，复合维生素B 0.020 g，山梨酸1.50 g，对羟基苯甲酸甲酯 1.50 g， 40%甲醛0.6ml，水731.08m。其中，复合维生素B配方：烟酰胺0.0060g，盐酸硫胺素(VB1) 0.0016g，核黄素(VB2) 0.0030g，盐酸吡哆醇(VB6) 0.0016g，赖氨肌醇(VB12) 0.00004g；叶酸0.0016g；泛酸钙0.0060g，生物素0.00016g。其制备过程见CN200910080336.2的实施例1。
复合物dsRNA-SPc的制备：将实施例1制备得到的dsCssnx-20水溶液用无酶水梯度稀释为25 μg/g；与纳米材料SPc以dsCssnx-20与SPc质量比为1:1混合，得到dsCssnx-20-SPc溶液；向dsCssnx-20-SPc溶液中加入终溶液（即以后续形成的dsCssnx-20-SPc复合物的总体积为100%）为1%体积的脂肪醇醚硫酸钠，混合均匀，室温孵育15 min得到dsCssnx-20-SPc复合物。其中，纳米材料SPc的制备按照A facile-synthesized star polycationconstructed as a highly efficient genevector in pest management（Li, J., Qian,J., Xu, Y., Yan, S., Shen, J., and Yin, M. ，ACSSustainable Chem. Eng. 7,6316-6322，2019.）来制备。
以同样的方式制备dsgfp-SPc复合物，作为阴性对照。
沉默效率测定：使用超纯水将dsCssnx-20-SPc复合物和dsgfp-SPc复合物分别稀释至333 μL，然后分别加入到1 g人工饲料中，混合均匀，使dsCssnx-20在人工饲料中的浓度为25 μg/g，dsgfp在人工饲料中的浓度为25 μg/g，将混合均匀的人工饲料分装于指形管中，每个指形管接入15头二化螟初孵幼虫，每个处理组3次重复。饲喂48 h后，以实施例1相同的操作提取二化螟幼虫的RNA，并反转录获得cDNA，以所获得的cDNA为模板，以Q-Cssnx-20-F（SEQID No. 20）和Q-Cssnx-20-R（SEQ ID No. 21）为引物用qRCR试剂盒（Q131-02，南京诺唯赞生物公司）进行qRCR以检测RNA干扰效率。其中，qRCR的配制20µL的总体系，具体如下：cDNA 2µL，Q-Cssnx-20-F（10 µmol/L）0.4µL，Q-Cssnx-20-R（10 µmol/L）0.4µL，SYBRGreen Master Mix（2×）10µL，无酶水7.2µL。
使用QuantStudio 6 Flex System（ABI公司）检测，扩增条件为：95°C预变性5min，95°C 10s，60°C 30 s，40个循环，进行溶解曲线分析。根据 2-△△Ct方法，根据Ct值计算Cssnx-20基因在经dsCssnx-20处理后与dsgfp对照组相比的相对表达量，并基于相对表达量计算沉默效率（或称之为干扰效率）。其中，沉默效率=（1-相对表达量）×100%。结果以dsgfp处理组（对照）的相对表达量（倍数）为1，dsCssnx-20的相对表达量（倍数）为0.278，dsCssnx-20的沉默效率为72.2%。从结果可以看出，当dsCssnx-20浓度为25 μg/g时沉默效率达到60%以上，干扰效率较好。
联合使用dsCssnx-20和Cry9A的生物活性测定。
处理dsCssnx-20-Cry9A：将用25 μg/g dsCssnx-20干扰48 h（操作同上述沉默效率）的二化螟幼虫转入装有Cry9Aa655蛋白含量为200 μg/g的人工饲料的指形管中，每管接32头幼虫，重复3次。将指形管置于温度为27±2°C、湿度为70±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用含有Cry9Aa655蛋白的人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
处理dsgfp-Cry9A：将用25 μg/g dsgfp干扰48 h（操作同上述沉默效率）的二化螟幼虫转入装有Cry9Aa655蛋白含量为200 μg/g的人工饲料的指形管中，每管接32头幼虫，重复3次。将指形管置于温度为27±2°C、湿度为70±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
处理dsCssnx-20：将用25 μg/g dsCssnx-20干扰48 h（操作同上述沉默效率）的二化螟幼虫转入装有人工饲料的指形管中，每管接32头幼虫，重复3次。将指形管置于温度为27±2°C、湿度为70±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
处理dsgfp：将用25 μg/g dsgfp干扰48 h（操作同上述沉默效率）的二化螟幼虫转入装有人工饲料的指形管中，每管接32头幼虫，重复3次。将指形管置于温度为27±2°C、湿度为70±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
结果如下：dsCssnx-20-Cry9A处理组的幼虫的死亡率为90.00%（c），dsgfp-Cry9A处理组的幼虫的死亡率为58.73%（b），dsCssnx-20处理组的幼虫的死亡率为3.33%（a），dsgfp处理组的幼虫的死亡率为6.67%（a），其中，死亡率数据后不同小写字母表示在P<0.001水平上差异显著。结果表明，dsCssnx-20-Cry9A处理组显著高于dsgfp-Cry9A处理组；此外，dsCssnx-20处理与阴性对照dsgfp处理的二化螟幼虫的死亡率没有显著差异，可见，虽然仅沉默Cssnx-20基因不能使二化螟死亡，即沉默Cssnx-20基因对二化螟没有杀虫活性；但沉默二化螟的Cssnx-20基因却可以显著提高Cry9Aa655蛋白对二化螟的杀虫效果。
实施例6：对草地贪夜蛾的生物活性测定。
草地贪夜蛾人工饲料配方：琼脂30.0 g，黄豆粉110.0 g，麦麸210.0 g，酵母粉40.0g，山梨酸4.0 g，干酪素55.0 g，抗坏血酸钠(Vc) 4.0 g，复合维生素3ml，甲醛3ml，乙酸6ml，特克多1ml，水1800ml。其中，复合维生素配方：烟酸（VB5）4.584g，泛酸钙（VB3）4.575g，核黄素(VB2) 2.292g，维生素B11.146g，维生素B6 1.146g，叶酸（VBC）0.0016g生物素（VH）0.915g，氰钴胺素（VB12）0.009g，水1.5l。
复合物dsRNA-SPc的制备：将实施例2制备得到的dsSfsnx-20水溶液用无酶水梯度稀释为25 μg/g；与纳米材料SPc以dsSfsnx-20与SPc质量比为1:1混合，得到dsSfsnx-20-SPc溶液；向dsSfsnx-20-SPc溶液中加入终溶液（即以后续形成的dsSfsnx-20-SPc复合物的总体积为100%）为1%体积的脂肪醇醚硫酸钠，混合均匀，室温孵育15 min得到dsSfsnx-20-SPc复合物。其中，纳米材料SPc的制备按照A facile-synthesized star polycationconstructed as a highly efficient genevector in pest management（Li, J., Qian,J., Xu, Y., Yan, S., Shen, J., and Yin, M. ，ACSSustainable Chem. Eng. 7,6316-6322，2019.）来制备。
以同样的方式制备dsgfp-SPc复合物，作为阴性对照。
沉默效率测定：使用超纯水将dsSfsnx-20-SPc复合物和dsgfp-SPc复合物分别稀释至333 μL，然后分别加入到1 g人工饲料中，混合均匀，使dsSfsnx-20在人工饲料中的浓度为25 μg/g，dsgfp在人工饲料中的浓度为25 μg/g，将混合均匀的人工饲料分装于指形管中，每个指形管接入15头草地贪夜蛾初孵幼虫，每个处理组3次重复。饲喂48 h后，以实施例2相同的操作提取草地贪夜蛾幼虫的RNA，并反转录获得cDNA，以所获得的cDNA为模板，以Q-Sfsnx-20-F（SEQ ID No.22）和Q-Sfsnx-20-R（SEQ ID No. 23）为引物用qRCR试剂盒（Q131-02，南京诺唯赞生物公司）进行qRCR以检测RNA干扰效率。
使用QuantStudio 6 Flex System（ABI公司）检测，扩增条件为：95°C预变性5min，95°C 10s，60°C 30 s，40个循环，进行溶解曲线分析。根据 2-△△Ct方法，根据Ct值计算Cssnx-20基因在经dsSfsnx-20处理后与dsgfp对照组相比的相对表达量，并基于相对表达量计算沉默效率（或称之为干扰效率）。其中，沉默效率=（1-相对表达量）×100%。结果以dsgfp处理组（对照）的相对表达量（倍数）为1，dsSfsnx-20的相对表达量（倍数）为0.587，dsSfsnx-20的沉默效率为41.3%。从结果可以看出，当dsSfsnx-20浓度为25 μg/g时沉默效率达到40%以上，干扰效率较好。
联合使用dsSfsnx-20和Cry1F的生物活性测定。
处理dsSfsnx-20-Cry1F：将用25 μg/g dsSfsnx-20干扰48 h（操作同上述沉默效率）的草地贪夜蛾幼虫转入装有Cry1Fa3蛋白含量为1 μg/g的人工饲料的指形管中，每管接32头幼虫，重复3次。将指形管置于温度为27±1°C、湿度为65±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用含有Cry1Fa3蛋白的人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
处理dsgfp-Cry1F：将用25 μg/g dsgfp干扰48 h（操作同上述沉默效率）的草地贪夜蛾幼虫转入装有Cry1Fa3蛋白含量为1μg/g的人工饲料的指形管中，每管接32头幼虫，重复3次。将指形管置于温度为27±1°C、湿度为65±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
处理dsSfsnx-20：将用25 μg/g dsSfsnx-20干扰48 h（操作同上述沉默效率）的草地贪夜蛾幼虫转入装有人工饲料的24孔板中，每孔接1头幼虫，共接24头，重复3次。将24孔板置于温度为27±1°C、湿度为65±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
处理dsgfp：将用25 μg/g dsgfp干扰48 h（操作同上述沉默效率）的草地贪夜蛾幼虫转入装有人工饲料的24孔板中，每孔接1头幼虫，共接24头，重复3次。将24孔板置于温度为27±1°C、湿度为65±5%、14：10 h光照周期的培养箱中培养，在用人工饲料饲喂7天时统计死亡率。
结果如下：dsSfsnx-20-Cry1F处理组的幼虫的死亡率为80.56%（c）dsgfp-Cry1F处理组的幼虫的死亡率为47.22%（b），dsSfsnx-20处理组的幼虫的死亡率为12.5%（a），dsgfp处理组的幼虫的死亡率为11.10%（a），其中，死亡率数据后不同小写字母表示在P<0.001水平上差异显著。结果表明，dsSfsnx-20-Cry1F显著高于dsgfp-Cry1F处理组；此外，dsSfsnx-20处理与阴性对照dsgfp处理的草地贪夜蛾幼虫的死亡率没有显著差异，可见，虽然仅沉默Sfsnx-20基因不能使草地贪夜蛾死亡，即沉默Sfsnx-20基因对草地贪夜蛾没有杀虫活性；但沉默草地贪夜蛾的Sfsnx-20基因却可以显著提高Cry1Fa3蛋白对草地贪夜蛾的杀虫效果。
Claims (10)
1.沉默靶标昆虫自体snx-20基因表达在提高杀虫蛋白对所述靶标昆虫防治效果中的应用，其中，所述杀虫蛋白为Cry蛋白，所述靶标昆虫为鳞翅目（Lepidoptera）昆虫中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的沉默效率在40%以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶标昆虫为螟蛾科（Pyralidae）昆虫中的至少一种，或夜蛾科（Noctuidae）昆虫中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶标昆虫为二化螟（Chilosuppressalis Walker）或草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry9Aa蛋白；
对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为Cry1Fa蛋白。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如Genbank No. ADE60735.1所示的Cry9Aa3蛋白；
对于所述夜蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示的Cry1Fa3蛋白。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，对于所述螟蛾科昆虫，所述Cry蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No. 18的Cry9Aa655蛋白。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，对于所述螟蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ ID No. 1所示或SEQ ID No. 4所示；
对于所述夜蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 10所示。
9.一种联合用药物，其包括用于沉默靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA和Cry蛋白，所述靶标昆虫为权利要求1至8中任意一项所述的应用中的所述的靶标昆虫；所述Cry蛋白为权利要求1至8中任意一项所述的应用中的所述Cry蛋白。
10.根据权利要求9所述的联合用药物，其特征在于，对于所述螟蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 4所示；
对于所述夜蛾科昆虫，沉默所述靶标昆虫自体snx-20基因表达的dsRNA中的正义链的序列如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 10所示。
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