CN117625570A - 一种3α-羟基类固醇脱氢酶、基因、试剂盒、表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种3α‑羟基类固醇脱氢酶、基因、试剂盒、催化剂、表达载体、重组菌，其中，3α‑羟基类固醇脱氢酶在野生型的假单胞菌属的3α‑羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的59位、85位、135位以及233位进行了替换修饰，分别替换修饰为C59Y、V85L、D135E、S233R，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明解决了目前经提取纯化或通过基因工程表达以后得到的3α‑HSD酶活性不高，使得酶法检测胆汁酸过程中催化效率较低的技术问题，实现了提高3α‑HSD催化活性，进而提高检测效率的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体而言，涉及一种3α-羟基类固醇脱氢酶、基因、试剂盒、表达载体。
背景技术
胆汁酸是胆汁的主要有机成分，是几种结构类似的类固醇酸的统称，其主要的代谢过程是由肝脏完成的。早期胆汁酸的测定方法主要为气相色谱法、高效液相色谱法，但由于这些方法测定步骤繁琐、测定时间长，所需大量血清样本，使临床应用受到限制。现代临床研究表明，血液胆汁酸的浓度变化可以有效检测肝细胞是否发生病变，肝功能是否有损伤。因此，开发一种步骤简便，测定时间短的胆汁酸检测方法尤为重要。
近年来，临床开发了酶法检测胆汁酸试剂。酶法检测由于操作简单、灵敏度高、成本低，且结合全自动生化仪的使用，可快速进行常规检查。酶法检测的原理为：胆汁酸被3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroiddehydrogenase，3α-HSD)及Thio-NAD+特异性氧化，生成3-酮类固醇及Thio-NADH，3-酮类固醇继续在3α-HSD及NADH存在下，生成胆汁酸和NAD+，如上述，循环往复从而放大微量的总胆汁酸含量，测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，以求得胆汁酸浓度。
存在的问题是：3α-HSD作为总胆汁酸检测试剂中的关键原料，目前主要来源于睾酮假单胞菌提取或基因工程表达，但提取纯化步骤繁琐，得率低，生产成本偏高；而基因工程表达的野生型3α-HSD催化活性低，热稳定性不佳，导致试剂盒灵敏度偏低，在运输和使用过程中稳定性不好。综上所述，经提取纯化或通过基因工程表达以后得到的3α-HSD酶活性不高，使得酶法检测过程中催化效率较低，因而有待提升。
发明内容
本发明解决了目前经提取纯化或通过基因工程表达以后得到的3α-HSD酶活性不高，使得酶法检测胆汁酸过程中催化效率较低的技术问题，实现了提高3α-HSD催化活性，进而提高检测效率的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种3α-羟基类固醇脱氢酶，3α-羟基类固醇脱氢酶在野生型的假单胞菌属的3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的59位、85位、135位以及233位进行了替换修饰，分别替换修饰为C59Y、V85L、D135E、S233R，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明以假单胞菌属的野生型3α-HSD基因序列为模板，进行易错PCR随机突变，构建3α-HSD突变文库，通过特异性酶切，将突变文库片段连接到PET-22b质粒中，转化到E.Coli BL21(DE32)中，经平板初筛和摇瓶复筛确定，获得活性和热稳定性最佳的3α-HSD及其重组表达菌株，该3α-HSD的氨基酸序列如SEQ ID.No.1所示，在该酶的序列上有4个突变氨基酸，分别为C59Y、V85L、D135E、S233R。本发明获得的3α-羟基类固醇脱氢酶活性和热稳定性均得以提高，催化雄酮脱氢反应的比酶活为130U/mg，60℃处理30min后，酶活保留率可达72.3％。而且该酶可以通过E.coli基因工程菌进行重组表达，工程菌培养方式简单、表达量高、纯化简单、回收率高，使得该酶生产成本低，可以实现快速大量生产。
本发明还提供一种基因，基因的核苷酸序列编码上述实例的3α-羟基类固醇脱氢酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或为对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：经过DNA测序反应，该酶核苷酸编码序列如SEQ ID No.2所示，与原有基因序列相比，有6处核苷酸序列发生突变，分别是176位G→A，253位G→C，405位T→A，456位T→A，540位G→C，699C→G，其中456位、540位为同义碱基突变，未导致编码的氨基酸发生改变。本发明提供的基因具有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的所有有益效果，在此不再赘述。
本发明还提供一种用于体外总胆汁酸含量检测的试剂盒，包含上述实例的3α-羟基类固醇脱氢酶。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的3α-羟基类固醇脱氢酶可以应用于体外总胆汁酸检测试剂盒中，该试剂盒用于总胆汁酸检测不仅准确度、精密度、线性范围良好，而且由于酶催化活性高，可以减少酶用量，降低试剂成本；酶稳定性提高，可以改善试剂盒稳定性。在37℃热储加速11天和4℃放置18个月，试剂盒性能指标均表现良好。
本发明还提供一种催化剂，其有效成分包含上述实例的3α-羟基类固醇脱氢酶。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的催化剂具有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的所有有益效果，在此不再赘述。
本发明还提供一种表达载体，含有上述实例的基因。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的表达载体具有上述基因的所有有益效果，在此不再赘述。
本发明还提供一种重组菌，重组菌被上述实例的表达载体转化，经表达载体转化的重组菌选自大肠杆菌。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的重组菌具有上述表达载体的所有有益效果，在此不再赘述。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的3α-HSD应用于总胆汁酸酶循环法检测试剂盒中线性关系。
图2为本发明实施例提供的3α-HSD应用于总胆汁酸酶循环法检测试剂盒热储后线性关系。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明提供一种活性和热稳定性提高的3α-类固醇脱氢酶(3α-HSD)，基于目前假单胞菌属的野生型3α-HSD基因序列为模板，进行易错PCR随机突变，构建3α-HSD突变文库，通过特异性酶切，将突变文库片段连接到PET-22b质粒中，转化到E.Coli BL21(DE32)中，经平板初筛和摇瓶复筛确定，获得一株活性和热稳定性提高的3α-HSD及其重组表达菌株。该酶催化雄酮(Androgen)比酶活为130U/mg，60℃处理30min，酶活保留率有72.3％。该3α-HSD的氨基酸序列如SEQ ID.No.1所示，编码该酶的核苷酸序列如SEQID.No.2所示。
本发明的活性和稳定性提高的3α-类固醇脱氢酶通过如下途径获得：
(1)、以假单胞菌属的3α-HSD基因序列为模板，进行易错PCR扩增突变，建立3α-HSD随机突变文库。
(2)、将获得3α-HSD突变文库，通过特异性内切酶酶切和连接酶连接，连接在PET22b载体中，导入表达菌株E.Coli BL21(DE32)中，进行重组表达。
(3)、对重组表达的菌株平板进行热处理，通过高通量筛选，获得5株热稳定性提高的3α-HSD突变株。
(4)对5株热稳定性提高的3α-HSD突变株，进行摇瓶表达、纯化，测定比酶活，优选1株活性和热稳定性均提高的3α-HSD菌株。
(5)对优选的1株突变3α-HSD菌株，进行重组表达、纯化回收，进一步测定其比酶活和热稳定性。测定其催化雄酮脱氢反应的比酶活为130U/mg。酶溶液经60℃处理30min后，该酶酶活保留率有72.3％。
经过DNA测序反应，该酶核苷酸编码序列如SEQ ID No.2所示，与原有基因序列相比，有6处核苷酸序列发生突变，分别是176位G→A，253位G→C，405位T→A，456位T→A，540位G→C，699C→G，其中456位、540位为同义碱基突变，未导致编码的氨基酸发生改变，其他四个位点分别导致氨基酸序列发生改变，分别是59位Cys→Tyr，85位Val→Leu，135位Asp→Glu，233位为Ser→Arg。该突变获得的热稳定性好的3α-HSD的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
进一步地，该酶可以应用于总胆汁酸检测试剂盒中，该应用用于非疾病的诊断和治疗。该试剂盒用于总胆汁酸检测不仅准确度、精密度、线性范围良好，而且试剂具有良好的稳定性，37℃热储加速11d和4℃放置18个月，试剂盒性能指标均表现良好。
本发明还提供一种催化剂，其有效成分包含上述实例的3α-羟基类固醇脱氢酶。
本发明还提供一种表达载体，含有上述实例的基因，该基因编码上述实例的3α-HSD的核苷酸序列。
本发明还提供一种重组菌，重组菌被上述实例的表达载体转化，经表达载体转化的重组菌选自大肠杆菌。
实施例1：易错PCR扩增3α-羟基类固醇脱氢酶，制备基因突变文库
根据假单胞菌属中的3α-HSD序列，设计引物序列：
正向引物：5’-TACAGGCAATAGCGTTAATG-3’，
反向引物：5’-AGTCTTCCAGAACCGCGCGT-3’
应用上述引物，利用易错PCR进行扩增,易错PCR扩增体系为：
10*扩增缓冲液20μl
dNTP混合物30μM
引物60pM
模板0.5μg
易错TaqDNA聚合酶2.5U/L
Mg2+0.15mM
Mn2+6mM
加双蒸水到200μl。
PCR反应条件为：92℃5min；92℃30s、55℃30s、72℃2min、35个循环；72℃10min。
取上述5μlPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在750-800bp处观察到目的产物条带，确定获得PCR扩增条带。将PCR扩增产物经DNA回收试剂盒进行纯化回收后，获得基因片段，用NdeI和XhoI酶切，用T4连接酶连接到PET22b中，转化到E.coli BL21(DE32)表达菌株中，涂布于含有100mg/L AMP的LB平板上，37℃培养过夜，获得一系列3α-HSD易错PCR随机突变表达单菌落，用以后续筛选。
实施例2：突变株平板初筛
将实施例1获得的随机突变表达菌株的LB平板上的单克隆菌株用印章法转移到含有终浓度0.4mM IPTG、100mg/L AMP的LB平板上，25℃培养16h，充分诱导3α-HSD的表达。
在表达3α-HSD的单菌落平板上喷涂细胞裂解液。细胞裂解液的组成为50mM PB、0.6g/L CTAB、50mM KCl、10mM MgCl2、0.4g/L脱氧胆酸钠，pH7.6。然后将平板放置在60℃烘箱中处理30min。
在处理过的平板上，均匀喷洒显色反应液，已确定单菌落的酶活保留率。酶活反应液组成为：40mM Tris-HCl、1mM NAD、1mM雄酮、0.5％TritonX-100、0.1％NTB、10U/ml DI，pH8.0。充分反应10min后，用肉眼观察单菌落周围颜色反应，挑选反应明显，呈现深紫色的单菌落共计5株，用于后续复筛。
实施例3：突变株摇瓶复筛
将实施例2平板初筛获得的5株单克隆菌落，接种到5ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD为1时，转接到200ml的LB液体培养基中，待OD长至0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，25℃诱导培养16h。
将诱导结束的发酵液3000rpm离心30min后，收集沉淀菌体，加入10倍体积的细胞裂解液，裂解2h后，8000rpm离心40min后，将上清利用重力缓慢流过IDA-Ni填料，然后分别使用washing buffer 1和washing buffer 2对填料进行洗杂和目的蛋白洗脱。细胞裂解液为50mM PB、1％SDS、100U/ml溶菌酶、0.5％TritonX-100，pH7.5；washing buffer 1组成为50mM PB、300mMNaCl、30mM咪唑，pH7.5；washing buffer 2组成为50mM PB、300mM NaCl、250mM咪唑，pH7.5。
将收集到的目的蛋白，使用BCA方法测定蛋白浓度，使用酶活反应液测定酶活。酶活反应液为50mM Tris-HCl、2mM NAD、2mM雄酮、1％TritonX-100、0.2％NTB、15U/ml DI，pH8.0。根据BCA方法测定的酶溶液蛋白浓度，将酶溶液使用washing buffer 2将蛋白稀释到0.1g/L。然后取100μl加入到2ml酶活反应体系中，37℃恒温反应10min后，加入100μl的100％TCA进行反应终止，利用分光光度计测定546nm下吸光度。根据已有3α-HSD为标准，1min内催化雄酮反应生成1μM的雄甾酮，定义为1个酶活单位。计算每mg蛋白的酶活性，即获得5株突变3α-HSD的比酶活，比酶活检测数据参见表1。
表1：3α-HSD突变株的比酶活
比较表1中的比酶活数据，可见4号突变株比酶活最高，优选4号突变株，即获得活性和稳定性提高的3α-HSD突变株。
实施例4：突变株酶活性和热稳定性测定
将实施例3获得的4号突变株，接种到20ml 2YT液体培养基中，37℃培养至OD为1.2时，转移到500ml 2YT液体培养基中，37℃培养至OD为0.8时，加入0.5mM IPTG，23℃诱导过夜。
将发酵液5000rpm离心30min收集菌体，加入8倍体积破碎液，超声波破碎20min后，8400rpm离心50min后，取上清液，将上清利用重力缓慢流过IDA-Ni填料，然后分别使用washing buffer 1和washing buffer2对填料进行洗杂和目的蛋白洗脱。细胞裂解液50mMTris-HCl、1.2％SDS、50U/ml溶菌酶、1％TritonX-100，pH8.0；washing buffer 1组成为50mM Tris-HCl、500mMNaCl、50mM咪唑，pH8.0；washing buffer 2组成为50mM Tris-HCl、500mMNaCl、300mM咪唑，pH8.0。
将收集到的目的蛋白，使用BCA方法测定蛋白浓度，使用酶活反应液测定酶活。酶活反应液为20mM Tris-HCl、5mM NAD、5mM雄酮、1.2％TritonX-100、0.3％NTB、20U/ml DI，pH8.0。根据BCA方法测定的酶溶液蛋白浓度，将酶溶液使用washing buffer 2将蛋白稀释到0.05g/L。然后取100μl加入到1ml酶活反应体系中，37℃恒温反应10min后，加入100μl的100％TCA进行反应终止，利用分光光度计测定546nm下吸光度，计算每mg蛋白的酶活性，即获得4号突变3α-HSD的比酶活，进一步确定该比酶活为130U/mg。
将3α-HSD酶溶液，60℃水浴热处理30min，按照同样方法测定保留的酶活。将保留酶活和对照酶活进行对比，确定酶活保留率为72.3％。
实施例5：3α-HSD在胆汁酸检测试剂盒中的性能验证
将实施例4制备的3α-类固醇脱氢酶溶液添加到总胆汁酸循环酶法试剂盒中，分析试剂盒的准确度、精密度、线性关系等指标。试剂盒由试剂R1和试剂R2组成，R1成分为：20mMTris-HCl、1g/L Thio-NAD、0.1％TritonX-100，pH8.0；R2成分为：50mM Tris-HCl、5g/LNADH、10KU/L 3α-HSD、0.05％TritonX-100，pH9.0。
试剂盒准确性测定是在试剂盒正常校准情况下，测定赋值质控，将测定值与质控进行比较，偏差±5％以内视为准确度合格。精密度测定是在试剂盒正常校准情况下，分别连续测定高值样本和低值样本20次，经统计学分析后计算CV，CV≤2％视为精密度合格。线性测定是在试剂盒正常校准情况下，测定150μM线性高值与生理盐水按10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10比例混合，将测定值与理论值进行回归分析，R2≥0.995视为合格。准确度、精密度测定结果参见表2，线性关系测定结果参见图1。
表2：3α-HSD应用于总胆汁酸酶循环法检测试剂盒中的准确度、精密度测定结果
从表2中可以看出，低值质控和高值质控分别偏差2.47％和1.13％，因此试，剂盒的准确度合格；低值样本和高值样本CV分别为1.24％和0.834％，因此，试剂盒的精密度合格。从图1中可以看出，线性回归方程为Y＝1.007X-0.3227，R2＝0.9996，因此，试剂盒检测的线性关系良好。
实施例6：3α-HSD在胆汁酸检测试剂盒中的热储后性能验证
将实施例4制备的3α-类固醇脱氢酶溶液添加到总胆汁酸循环酶法试剂盒中，分析试剂盒热储后的准确度、精密度、线性关系等指标，以考察试剂盒稳定性情况。试剂盒包括试剂R1和试剂R2，R1成分为：20mM Tris-HCl、1.3g/L Thio-NAD、0.15％TritonX-100，pH8.2；R2成分为：100mM Tris-HCl、10g/L NADH、25KU/L 3α-HSD、0.5％TritonX-100，pH8.8。将试剂R1、R2放置在37℃下加速储存11d，热储结束，在正常校准下，测定准确度、精密度和线性关系，具体测定方法同实施例5，检测结果参见表3。
表3：3α-HSD应用于总胆汁酸酶循环法检测试剂盒中热储后的准确度、精密度测定结果
从表3中可以看出，热储后低值质控和高值质控分别偏差-2.47％和-0.528％，因此，试剂盒的准确度合格；低值样本和高值样本CV分别为1.39％和0.595％，因此，试剂盒的精密度合格。从图2中可以看出，线性回归方程为Y＝0.9948X+1.055，R2＝0.9993，因此，试剂盒检测的线性关系良好。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (6)
1.一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其特征在于，所述3α-羟基类固醇脱氢酶在野生型的假单胞菌属的3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的59位、85位、135位以及233位进行了替换修饰，分别替换修饰为C59Y、V85L、D135E、S233R，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列编码如权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或为对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
3.一种用于体外总胆汁酸含量检测的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶。
4.一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含如权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶。
5.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的基因。
6.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌被如权利要求5所述的表达载体转化，经所述表达载体转化的重组菌选自大肠杆菌。
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