CN117624291A - 一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽及其编码基因与应用 - Google Patents

一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽及其编码基因与应用 Download PDF

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CN117624291A CN202311488995.6A CN202311488995A CN117624291A CN 117624291 A CN117624291 A CN 117624291A CN 202311488995 A CN202311488995 A CN 202311488995A CN 117624291 A CN117624291 A CN 117624291A
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肖淦泓
钟俊
许泳钊
威廉
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Abstract

本发明公开了一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽及其编码基因与应用。所述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽名称为AYLH，氨基酸序列为：Ala‑Tyr‑Leu‑His。本发明的四肽能通过与次黄嘌呤结合，进而抑制次黄嘌呤肠道吸收代谢，具有显著抑制肠道尿酸释放的活性，可广泛应用于制备降尿酸食品或药物，能有效治疗及预防高尿酸血症，并缓解痛风症状，具有良好社会经济效益。

Description

一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽及其编码基因与 应用
技术领域
本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽及其编码基因与应用。
背景技术
多肽的肽键或侧链基团中富含氢键供体(-NH、-OH)可与嘌呤分子中氢键受体(N原子)产生氢键作用，部分氨基酸残基的芳香基团能与嘌呤分子的芳香环产生π-π相互作用，带正电荷氨基酸残基则能与嘌呤分子的芳香环产生阳离子-π相互作用，故多肽与嘌呤之间具备发生非共价相互作用的结构基础。研究表明，食源性多肽可与胆汁酸、钙、锌及铁等物质产生共价或非共价相互作用，进而调控脂质及矿物质在肠道的吸收代谢。在机体内存在内源性多肽，可与嘌呤产生相互作用以实现蛋白-核酸识别作用。而食源性蛋白在胃肠道消化后能产生结构丰富的外源性多肽，其中可能存在能与食源性嘌呤互作的多肽，进而可能调控嘌呤在肠道中的吸收代谢过程。
多肽作为目前生物活性成分研究中重要的原料之一，在机体内发挥生物活性离不开其特有的结构，具有某种相似结构特征的多肽可能与同一目标物结合并发挥类似的生理活性，这种多肽生理活性与结构特征对应的关系称为“多肽构效关系”。在目前的研究中，多肽的“效”需借助已有的生物活性数据库获取具有同一“效”的多肽序列集。多肽的“构”则可从两个不同的维度进行表征，分别为分子结构及理化性质，二者均可用分子描述符进行表征。分子描述符是一类用以度量某一种分子性质的工具，一般包括定量描述符和定性描述符。定量描述符涵盖光谱特性描述符、分子组成描述符(如氢键受体数、可旋转键数、价电子数等)及理化性质描述符(如油水分布系数、等电点等)等；定性描述符即分子指纹，将分子片段、结构、子结构或性质信息进行编码以表征分子。因此，多肽数据库和多肽分子描述符是进行多肽构效关系分析的基础。
目前关于食源性肽调控外源性嘌呤吸收代谢的研究主要关注于黄嘌呤氧化酶或尿酸相关转运体的肽类抑制剂，已有研究表明，食源性蛋白酶解物可在氧嗪酸钾造模的高尿酸大鼠或小鼠体内表现出明显的降尿酸活性。Yujuan Li等人将鲣鱼酶解物(300mg/kgbody weight)连续28天灌胃给氧嗪酸钾诱导的高尿酸大鼠，结果显示大鼠血清尿酸水平显著降低且低于别嘌呤醇干预后的大鼠血清尿酸水平(李宇娟.鲣鱼降尿酸肽的制备分离,结构表征及功效机制研究[D].广州:华南理工大学,2019)。且目前食源性肽发挥降尿酸的物质基础是多肽中的氨基酸残基与黄嘌呤氧化酶活性位点产生非共价相互作用，降低黄嘌呤氧化酶与底物的结合效率，抑制黄嘌呤氧化酶催化活性，从而降低尿酸的生成量。QingyongLi等人通过分子对接法探究核桃源多肽与黄嘌呤氧化酶的结合机制，发现Trp-Pro-Pro-Lys-Asn与钼蝶呤中心的Glu-802与Thr-1010残基发生氢键作用，Ala-Asp-Ile-Tyr-Thr-Glu与钼蝶呤中心的Lys-771发生氢键作用(Li Q,Kang X,Shi C,et al.Moderation ofhyperuricemia in rats via consuming walnut protein hydrolysate diet andidentification of new antihyperuricemic peptides[J].Food&Function,2018,9(1):107-116.DOI:10.1039/C7FO01174A)。Zhipeng Yu等人将金枪鱼骨骼肌球蛋白来源的四肽Glu-Glu-Ala-Lys与XO活性中心进行分子对接，发现Glu-Glu-Ala-Lys与XO活性中心关键残基(Glu802、Arg880和Glu1261)发生氢键、静电力及盐桥等非共价相互作用，形成较稳定的复合物，对XO活性抑制作用显示出较强的潜力(Yu Z,Kan R,Wu S,et al.Xanthineoxidase inhibitory peptides derived from tuna protein:virtual screening,inhibitory activity,and molecular mechanisms[J].Journal of the Science ofFood and Agriculture,2021,101(4):1349-1354.DOI:10.1002/jsfa.10745)然而，鲜有基于嘌呤-多肽相互作用研究外源性多肽对嘌呤吸收代谢的影响。当外源性摄入四种游离嘌呤(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤及黄嘌呤)时，每种嘌呤致血清尿酸升高的程度不一致，研究表明，不论在啮齿类动物或人群实验中，外源性摄入次黄嘌呤可导致人体血清尿酸显著升高，且其升尿酸效应最高。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽及其编码基因与应用。该四肽能抑制黄嘌呤氧化酶活性，从而有效抑制机体产生尿酸，可广泛应用于制备降尿酸食品或药物，能有效治疗及预防高尿酸血症，并缓解痛风症状。
本发明的目的在于提供一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽。
本发明的目的在于提供编码所述的一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的编码基因。
本发明的目的在于提供所述的一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
本发明提供一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽，其特征在于，所述四肽名称为AYLH，氨基酸序列为：Ala-Tyr-Leu-His，序列如SEQ ID No:1所示；
其中，Ala为丙氨酸残基，Tyr为酪氨酸残基，Leu为亮氨酸残基，His为组氨酸残基。
进一步地，所述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的制备方法包括化学合成法、酶解法或基因工程法。
进一步地，所述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的筛选方法为基于自构建或现有多肽数据库，采用分子对接或现有实验数据及多肽分子描述符，对次黄嘌呤结合肽进行构效关系分析，根据结构特征实现次黄嘌呤结合肽高通量高效虚拟筛选，最终得到目标多肽序列。
进一步地，所述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的抑制次黄嘌呤吸收代谢能力验证方法为，基于细胞模型比较胞内次黄嘌呤含量的高低，基于离体肠囊模型比较尿酸平均释放速率的高低，从而验证该四肽的抑制次黄嘌呤吸收能力。
本发明提供一种编码上述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的基因及其互补序列与编码RNA，所述编码基因的碱基序列为GCATATCTACAC，长度为12个碱基；
所述编码RNA的碱基序列为GCAUAUCUACAC，长度为12个碱基；
其中，GCA为丙氨酸的密码子，UAU为酪氨酸的密码子，CUA为亮氨酸的密码子，CAC为组氨酸的密码子。
本发明还提供上述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽在制备预防高尿酸血症/痛风的功能性食品或治疗高尿酸血症/痛风的药物中的应用。
进一步地，所述预防高尿酸血症/痛风的功能性食品或治疗高尿酸血症/痛风的药物的制备方法，包括以下步骤：将本发明所述的一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽与食品基质匀浆混合，并加入辅料混匀，而后借助喷雾干燥制得粉剂，制备得到含有具有降尿酸活性四肽的食品或药物。
更进一步地，所述食品基质匀浆包括食物原浆和食物浓缩浆中的一种或以上。
进一步地，所述预防高尿酸血症/痛风的功能性食品的剂型包括乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、软糖、糖浆剂或口服液。
进一步地，所述治疗高尿酸血症/痛风的药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、散剂、糖浆剂或口服液。
进一步地，所述所述预防高尿酸血症/痛风的功能性食品或治疗高尿酸血症/痛风的药物的递送方法包括涂抹、贴敷或微针刺穿的方式从皮肤递送。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
1、本发明提供的一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽，可通过与次黄嘌呤发生互作，进而抑制外源性次黄嘌呤在肠道吸收代谢过程，发挥降尿酸功能。
2、本发明提供的具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽可广泛应用于制备降尿酸食品或药物，能有效治疗及预防高尿酸血症，并缓解痛风症状，可改善高尿酸血症或痛风患者的饮食方式，具有良好社会经济效益。
附图说明
图1为RKO细胞对次黄嘌呤摄入量随时间变化曲线。
图2为不同次黄嘌呤浓度干预下对RKO细胞摄入量的影响图。
图3为本发明四肽AYLH对RKO摄入次黄嘌呤的影响图。
图4A为本发明四肽AYLH干预不同时间下小鼠空肠尿酸释放量折线图；图4B为本发明四肽AYLH干预对小鼠空肠尿酸释放速率的影响图。
图5为本发明四肽AYLH对RKO细胞存活率的影响图。
图6为基于肠囊模型对比AYLH与黄嘌呤氧化酶抑制肽降尿酸活性柱状图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明技术方案作进一步详细的描述，但本发明的具体实施方式及保护范围不限于此。
本发明的具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽，名称为AYLH，氨基酸序列为：Ala-Tyr-Leu-His，如序列表SEQ ID No:1所示；
其中，Ala为丙氨酸残基，Tyr为酪氨酸残基，Leu为亮氨酸残基，His为组氨酸残基。
本发明具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的结构式如下：
编码上述的具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的基因，AYLH的编码基因的碱基序列为GCATATCTACAC。
AYLH的编码RNA的碱基序列GCAUAUCUACAC，长度为12个碱基。
其中，GCA为丙氨酸的密码子，UAU为酪氨酸的密码子，CUA为亮氨酸的密码子，CAC为组氨酸的密码子。
具体实施例中，本发明的具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽在应用过程中，首先基于多肽与次黄嘌呤的结合能及多肽分子描述符对次黄嘌呤结合肽进行构效关系分析，而后从结构上对若干食源性肽结合次黄嘌呤能力进行评估，初步得到食源性次黄嘌呤结合肽。其次基于次黄嘌呤细胞摄取模型评价其对细胞次黄嘌呤摄取的影响，通过体外肠囊吸收代谢模型评价其对次黄嘌呤吸收代谢的影响。最后经过MTT实验验证次黄嘌呤结合肽对RKO细胞存活率的影响，证明本发明多肽具有次黄嘌呤结合能力，进而能降低肠道对次黄嘌呤的吸收，同时具有较低细胞毒性。
实施例1
高通量虚拟筛选潜在具有结合次黄嘌呤能力的多肽
1、多肽数据集的建立
从Protein Data Base(https://www1.rcsb.org/)中检索含有腺嘌呤分子的蛋白质，选择由X-Ray晶体衍射及冷冻电镜解析的晶体结构。经统计后发现，次黄嘌呤分子常与蛋白质中的苏氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和组氨酸(His)产生相互作用，并将其作为氨基酸单元，进行排列组合得到一组由343条三肽和2401条四肽的多肽数据集。
2、多肽分子描述符的计算
调用Python中计算化学库，计算数据集中所有多肽分子的分子描述符，以描述相应的物理结构特征。计算包括相对分子质量、重原子质量、氢键受体数、氢键供体数、可旋转键数、sp3杂化碳比例、拓扑极性表面积(TPSA)、杂原子数、重原子数、N/O数、-NH/-OH数、环数、芳香环数、芳香杂环数、芳香烃环数及价电子数在内共16个分子描述符。
3、多肽与次黄嘌呤的批量分子对接
通过Python中Pandas表格读取功能批量导入多肽序列集，再借助化学库RDkit批量生成多肽结构文件，即可快捷批量生成多肽结构文件。将生成的多肽结构文件导入Discovery Studio 4.5中，进行批量前处理，包括调整电荷、生成互变异构体等。而后，基于CHARMm力场对每个多肽分子进行能量最小化操作。同理，相同操作实施于次黄嘌呤分子结构文件。分子文件均准备完毕后，在Discovery Studio 4.5中进行批量分子柔性对接，最终得到每个多肽与次黄嘌呤的Cdocker Energy。
4、筛选得到目标多肽序列
综合分子对接结果划分强结合(按结合能由强至弱排序的前30％)及弱结合(按结合能由强至弱排序的末30％)，为明晰腺嘌呤结合肽所具备的分子结构特征，将多肽的分子描述符作为变量，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，得到变量投影重要性(VIP)，筛选出对结合强弱贡献差异较大的分子描述符(VIP>1.0)，并以此构建次黄嘌呤结合肽评价体系，最终筛选出具有结合次黄嘌呤能力的食源性四肽AYLH(Ala-Tyr-Leu-His)。
实施例2
具有结合次黄嘌呤能力的四肽的固相合成
1、合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：首先，称取0.05mol树脂放入反应器，加入10mL DCM(二氯甲烷)溶胀30min，抽去DCM，加入序列中第一个氨基酸0.10mol，再加0.1mol的DIEA(二异丙基乙胺)，15mL DMF(二甲基甲酰胺)，氮气鼓泡反应60min，然后加入0.25mol甲醇，反应30min，抽去反应液，用DMF和甲醇洗净；其次，向反应器中加入0.10mol的序列中第二个氨基酸，再加入0.10mol HBTU(1-羟基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及DIEA，氮气鼓泡反应30min，茚三酮检测，重复此步骤直至加入最后一个氨基酸为止。而后用吡啶和乙酸酐封端，最后洗净，加入脱帽液中反应2h去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，所述脱帽液为三氟乙酸、酒石酸乙二胺、蒸馏水和胰蛋白酶抑制剂(TIS)的混合液，其中三氟乙酸:酒石酸乙二胺:蒸馏水:胰蛋白酶抑制剂(TIS)的体积比为94.5:2.5:2:1，洗净并茚三酮检测；此外，将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，导入烧瓶中，加入15mL切割液，所述切割液为三氟乙酸、乙二硫醇、三异丙基硅烷和蒸馏水的混合液，其中三氟乙酸:乙二硫醇:三异丙基硅烷:蒸馏水的体积比为95:2:2:1，震荡，滤掉树脂；最后，向滤液中加入50mL乙醚，析出粗产物，采用高效液相色谱将粗品提纯至95％以上纯度，冻干成粉末。
实施例3
具有次黄嘌呤结合能力的四肽对细胞摄取次黄嘌呤的影响
为了在细胞层面研究次黄嘌呤的吸收过程，需排除黄嘌呤氧化酶对次黄嘌呤的影响，同时次黄嘌呤转运体ENT2需有较高的表达水平，因此在选择细胞系时应同时满足黄嘌呤氧化酶表达量低且ENT2表达量较高的细胞株。根据DepMap Data Explorer数据库中的转录组数据，选择几乎不表达黄嘌呤氧化酶且ENT2表达量较高的RKO细胞作为实验细胞。
1、优化RKO细胞摄取次黄嘌呤最佳孵育时间
为了优化RKO摄取次黄嘌呤的时间，进行如下实验设计：
(1)细胞接种：将RKO细胞接种于24孔板中，接种量4.0×105～5.0×105个/孔，DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+5％双抗)体积250μL，待细胞贴壁后，移出培养基，加入适量DMEM基础培养基预孵育5min。
(2)实验组：加入终浓度100μmol/L次黄嘌呤，于37℃、5％CO2的条件下培养，分别于第0.6、2.0、4.0、8.5及23.0h时移去含有次黄嘌呤的DMEM培养基。
(3)对照组：加入终浓度100μmol/L次黄嘌呤，于初始时(即第0h时)移去DMEM培养基。
(4)细胞裂解：用1×PBS清洗细胞表层2～3次，加入高效RIPA细胞裂解液于冰上裂解20min，并吹打细胞使得其充分裂解。将裂解液与12000rpm、4℃下离心10min，收集上清液，HPLC检测上清液次黄嘌呤含量，BCA法检测上清液蛋白含量。以上实验每组均设置三个平行。
本实验色谱条件为：色谱柱采用Microsorb-MV C18柱(150mm×4.60mm，5μm)，流动相A：0.20mol/L KH2PO4+0.52mmol/L戊烷磺酸钠(pH 3.80)；流动相B：0.20mol/LK2HPO4+0.52mmol/L戊烷磺酸钠+10％乙睛(pH 3.80)；柱温35℃，检测波长254nm，进样量20μL，流速1.00mL/min。流动相洗脱采用的梯度洗脱条件为：0～6.00min，100％流动相A等度洗脱；6.00～14.00min，100％流动相A～30％流动相A+70％流动相B梯度洗脱；14.00～17.40min，30％流动相A+70％流动相B等度洗脱；17.40～17.50min，30％流动相A+70％流动相B～100％流动相A梯度洗脱；17.50～35.00min，100％流动相A等度洗脱。
如图1所示，经过不同孵育时间后，RKO细胞内的次黄嘌呤含量呈现先升高后下降再缓慢上升的趋势，有文献报道ENT2不仅能将次黄嘌呤转运进胞内，还能将次黄嘌呤从胞内转运至胞外(Theisinger A,Grenacher B,Scharrer E.Na+gradient-dependenttransport of hypoxanthine by calf intestinal brush border membrane vesicles[J].Journal of Comparative Physiology B,2003,173:165-170.DOI:10.1007/s00360-002-0324-6)，因此RKO对次黄嘌呤的转运特征为前4h主要将胞外次黄嘌呤转运至胞内，第4h达到峰值，而后短时间内胞内次黄嘌呤大量转运至胞外，随后维持一定水平的胞内浓度平衡。由于第4h为RKO细胞摄入次黄嘌呤的峰值点，故本发明中实验的最佳孵育时间设置为4h。采用t检验进行显著性分析，*表示p<0.05。
2、优化RKO细胞摄取次黄嘌呤最佳给药浓度
为了优化RKO摄取次黄嘌呤的最佳给药浓度，进行如下实验设计：
(1)细胞接种：将RKO细胞接种于24孔板中，接种量4.0×105～5.0×105个/孔，DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+5％双抗)体积250μL，待细胞贴壁后，移出培养基，加入适量DMEM基础培养基预孵育5min。
(2)实验组：分别加入终浓度50、100、200、500及1000μmol/L次黄嘌呤，于37℃、5％CO2的条件下培养，于第4.0h时移去含有次黄嘌呤的DMEM培养基。
(3)对照组：加入等体积DMEM基础培养基，于37℃、5％CO2的条件下培养，于第4.0h时移去DMEM培养基。
(4)细胞裂解：用1×PBS清洗细胞表层2～3次，加入高效RIPA细胞裂解液于冰上裂解20min，并吹打细胞使得其充分裂解。将裂解液与12000rpm、4℃下离心10min，收集上清液，HPLC检测上清液次黄嘌呤含量，BCA法检测上清液蛋白含量。以上实验每组均设置三个平行。
如图2所示，随着次黄嘌呤给药浓度逐渐升高，RKO摄入胞内的次黄嘌呤含量亦逐渐升高，表明RKO细胞对次黄嘌呤摄入量存在浓度依赖性。当次黄嘌呤给药浓度超过200μmol/L时，RKO胞内次黄嘌呤含量显著高于未给予次黄嘌呤培养组(p<0.05)。由于200μmol/L次黄嘌呤干预可显著升高胞内次黄嘌呤含量，且为造模最低剂量，故本发明中实验的最佳给药浓度为200μmol/L。采用单因素ANOVA进行显著性分析，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。
3、四肽AYLH干预对RKO胞内次黄嘌呤含量的影响
为了评价四肽AYLH对RKO细胞摄取次黄嘌呤的影响，进行如下实验设计：
(1)细胞接种：将RKO细胞接种于24孔板中，接种量4.0×105～5.0×105个/孔，DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+5％双抗)体积250μL，待细胞贴壁后，移出培养基，加入适量DMEM基础培养基预孵育5min。
(2)样品准备：将AYLH用DMEM基础培养基配制成浓度为6.0mol/L的溶液，并用0.22μm滤头过滤多肽溶液，再与次黄嘌呤溶液混合，并涡旋30s得到摩尔浓度比为AYLH：次黄嘌呤＝1：2的样品。
(3)实验分组：
AYLH组：分别将(2)中制得的样品加入24孔板中，次黄嘌呤终浓度为200μmol/L，AYLH终浓度为100μmol/L，于37℃、5％CO2的条件下培养，于第4.0h时移去含有次黄嘌呤的DMEM培养基。
模型组：加入终浓度为200μmol/L次黄嘌呤，于37℃、5％CO2的条件下培养，于第4.0h时移去含有次黄嘌呤的DMEM培养基。
对照组：加入等体积DMEM基础培养基，于37℃、5％CO2的条件下培养，于第4.0h时移去DMEM培养基。
(4)用1×PBS清洗细胞表层2～3次，加入高效RIPA细胞裂解液于冰上裂解20min，并吹打细胞使得其充分裂解。将裂解液与12000rpm、4℃下离心10min，收集上清液，HPLC检测上清液次黄嘌呤含量，BCA法检测上清液蛋白含量。以上实验每组均设置三个平行。
如图3所示，在最佳给药浓度(200μmol/L次黄嘌呤)和最佳孵育时间(4h)的条件下，加入终浓度为100μmol/L的AYLH进行干预，模型组次黄嘌呤摄入量显著高于对照组(p<0.05)，表明模型组RKO摄取次黄嘌呤模型可靠；AYLH干预后虽未能显著降低第4h时RKO胞内次黄嘌呤含量，然而展现出明显的下降趋势(p＝0.056)，表明本发明四肽AYLH具有抑制RKO摄取次黄嘌呤的能力，可潜在调控次黄嘌呤吸收过程。采用单因素ANOVA进行显著性分析，*表示p<0.05。
实施例4
基于离体肠囊吸收代谢模型验证四肽AYLH对次黄嘌呤吸收代谢的影响
根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)转录组数据库中关于小鼠不同组织尿酸酶转录组数据可知，绝大部分的小鼠尿酸酶在肝脏进行转录，空肠段内未检测出尿酸酶的mRNA。由于人类缺乏尿酸酶基因，肠道无尿酸酶表达，与小鼠空肠相似，故小鼠空肠适用于人类的嘌呤吸收代谢相关研究。本发明将采用离体肠囊吸收代谢模型验证四肽AYLH对次黄嘌呤吸收代谢的影响。
1、Krebs-Ringer缓冲液的配制
称取7.80g NaCl、0.35g KCl、1.37g NaHCO3、0.32g NaH2PO4、0.37g CaCl2、0.02gMgCl2和1.40g葡萄糖，用蒸馏水定容至1000mL，得到Krebs-Ringer缓冲液，以下简称“K-R缓冲液”。
2、离体肠囊吸收代谢模型的构建
取体重为20±1g的C57BL/6小鼠3只，实验前禁食12h，期间自由饮水，腹腔注射0.05mL 2％戊巴比妥钠溶液，麻醉后将其固定于手术台上，用75％酒精喷洒腹腔周围，沿腹中线剪开腹腔，小心分离出空肠段，将肠系膜与空肠分离，并用手术剪刀截取长度约20cm的空肠段，将其均匀剪断，分别用预热至37℃的K-R缓冲液冲洗肠内容物。将空肠的一端用手术线扎紧，从另一端注入受试溶液，直至肠囊充盈饱和后，用手术线扎紧肠段注入口并立即将肠段置于通有95％O2及5％CO2的K-R缓冲液离心管中，并于37℃水浴。
3、四肽AYLH干预对次黄嘌呤吸收代谢的影响
根据如上操作进行实验，空白对照组的受试溶液为K-R缓冲液，模型组的受试溶液为200μmol/L次黄嘌呤溶液，多肽组的受试溶液为次黄嘌呤-多肽混合溶液(多肽100μmol/L，次黄嘌呤200μmol/L)。用手术线扎紧肠段后立即置于通有95％O2及5％CO2的K-R缓冲液离心管中，并于37℃水浴，同时开始计时。于第0.5、1.0及1.5h分别吸取200μL肠段外溶液待测。第1.5h时取出肠段，测量其长度，收集肠内溶液，于12000rpm、4℃条件下离心10min，取上清液待HPLC检测其尿酸含量。
本实验色谱条件为：色谱柱采用Microsorb-MV C18柱(150mm×4.60mm，5μm)，流动相A：0.20mol/L KH2PO4+0.52mmol/L戊烷磺酸钠(pH 3.80)；流动相B：0.20mol/LK2HPO4+0.52mmol/L戊烷磺酸钠+10％乙睛(pH 3.80)；柱温35℃，检测波长254nm，进样量20μL，流速1.00mL/min。流动相洗脱采用的梯度洗脱条件为：0～6.00min，100％流动相A等度洗脱；6.00～14.00min，100％流动相A～30％流动相A+70％流动相B梯度洗脱；14.00～17.40min，30％流动相A+70％流动相B等度洗脱；17.40～17.50min，30％流动相A+70％流动相B～100％流动相A梯度洗脱；17.50～35.00min，100％流动相A等度洗脱。
通过计算空肠尿酸平均释放速率，评价多肽对次黄嘌呤于空肠段吸收代谢的影响，尿酸平均释放速率计算公式如下：
式中：
n1.5——第1.5h时空肠单位长度尿酸释放量，×10-3μmol/cm；
n0.5——第0.5h时空肠单位长度尿酸释放量，×10-3μmol/cm。
如图4A所示，在相同时间下，单位长度尿酸释放量由高到低依次为模型组>AYLH组>空白组，表明当离体肠囊内含有次黄嘌呤时，能够促进肠囊对次黄嘌呤的吸收并代谢为尿酸。而在本发明四肽AYLH干预下，次黄嘌呤在肠囊的吸收代谢过程被明显抑制。如图4B所示，分别计算空白组、模型组及AYLH组在0.5h～1.5h内的尿酸平均释放速率，空白组显著低于模型组(p<0.001)，且AYLH组亦显著低于模型组(p<0.05)，表明本发明四肽AYLH能对次黄嘌呤在空肠的吸收代谢过程产生明显的影响，并显著降低次黄嘌呤转化为尿酸的效率。采用单因素ANOVA进行显著性分析，*表示p<0.05；***表示p<0.001。
实施例5
四肽AYLH对RKO细胞存活率的影响
用胰酶将RKO细胞消化，在37℃、1000rpm条件下离心5min，弃去上清液，加入适量DMEM完全培养基重悬细胞，用血球计数板估计细胞密度，再以1×104个/孔的细胞密度接种于96孔板中。待细胞贴壁后，移去培养基，用PBS清洗细胞2次，并用不同浓度的AYLH溶液(0、100、200及500μmol/L)于37℃、5％CO2条件下培养RKO细胞4h，再移去培养基，每孔加入20μL5mg/mL MTT溶液和180μL完全培养基，置于37℃、5％CO2条件下培养4h后，移去上清液，每孔加入200μL DMSO溶液，震荡5min，使生成的紫色甲瓒溶解充分，于490nm处检测吸光值。
细胞存活率计算公式如下：
式中：
X——细胞存活率，％；
As——实验组吸光值；
A0——对照组吸光值；
由图5可知，本发明四肽AYLH在0.1～0.5mmol/L给药浓度范围内，对RKO细胞存活率无显著影响(p>0.05)，表明本发明四肽AYLH在低剂量摄入时无细胞毒性。采用单因素ANOVA进行显著性分析，ns表示p>0.05。
对比例1
对比本发明四肽与黄嘌呤氧化酶抑制肽的调控次黄嘌呤吸收代谢能力
根据黎青勇的研究结果，WDQW(Trp-Asp-Gln-Trp，序列如SEQ ID No:2所示)、CFPH(Cys-Phe-Pro-His，序列如SEQ ID No:3所示)及VWPP(Val-Trp-Pro-Pro，序列如SEQ IDNo:4所示)均具有黄嘌呤氧化酶抑制活性(黎青勇.核桃源降尿酸肽靶向抑制黄嘌呤氧化酶活性的构效机制研究[D].广州:华南理工大学,2018)，由于该酶抑制活性是目前公认的降尿酸研究靶点，本发明四肽AYLH的降尿酸机制为抑制次黄嘌呤吸收代谢，故选用上述三个黄嘌呤氧化酶抑制肽与本发明四肽进行降尿酸活性对比。
基于前文提及的离体肠囊吸收代谢模型进行实验，对照组的受试溶液为K-R缓冲液，模型组的受试溶液为200μmol/L次黄嘌呤溶液，多肽组的受试溶液为次黄嘌呤-多肽混合溶液(多肽100μmol/L，次黄嘌呤200μmol/L)。用手术线扎紧肠段后立即置于通有95％O2及5％CO2的K-R缓冲液离心管中，并于37℃水浴，同时开始计时。于第0.5、1.0及1.5h分别吸取200μL肠段外溶液待测。第1.5h时取出肠段，测量其长度，收集肠内溶液，于12000rpm、4℃条件下离心10min，取上清液待HPLC检测其尿酸含量。
如图6所示，本发明四肽AYLH组与黄嘌呤氧化酶抑制肽WDQW组、VWPP组及CFPH组相比，AYLH组尿酸平均释放速率低于WDQW组及CFPH组，与VWPP组基本持平，其中WDQW组及CFPH组尿酸平均释放速率与模型组相比均未显著降低(p>0.05)，表明本发明四肽AYLH具有降尿酸活性优势。采用单因素ANOVA进行显著性分析，*表示p<0.05。

Claims (10)

1.一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽，其特征在于，所述四肽名称为AYLH，氨基酸序列为：Ala-Tyr-Leu-His，序列如SEQ ID No:1所示；
其中，Ala为丙氨酸残基，Tyr为酪氨酸残基，Leu为亮氨酸残基，His为组氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽，其特征在于，所述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的制备方法包括化学合成法、酶解法或基因工程法。
3.根据权利要求1所述的一种结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽，其特征在于，所述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的筛选方法为基于自构建或现有多肽数据库，采用分子对接或现有实验数据及多肽分子描述符，对次黄嘌呤结合肽进行构效关系分析，根据结构特征实现次黄嘌呤结合肽高通量高效虚拟筛选，最终得到目标多肽序列。
4.根据权利要求1所述的一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽，其特征在于，所述具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的抑制次黄嘌呤吸收代谢能力验证方法为，基于细胞模型比较胞内次黄嘌呤含量的高低，基于离体肠囊模型比较尿酸平均释放速率的高低，从而验证该四肽的抑制次黄嘌呤吸收能力。
5.权利要求1所述的具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的编码基因及其互补序列与编码RNA，其特征在于，所述编码基因的碱基序列为GCATATCTACAC，长度为12个碱基；
所述编码RNA的碱基序列为GCAUAUCUACAC，长度为12个碱基；
其中，GCA为丙氨酸的密码子，UAU为酪氨酸的密码子，CUA为亮氨酸的密码子，CAC为组氨酸的密码子。
6.权利要求1所述的一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽在制备预防高尿酸血症/痛风的功能性食品或治疗高尿酸血症/痛风的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防高尿酸血症/痛风的功能性食品或治疗高尿酸血症/痛风的药物的制备方法，包括以下步骤：将权利要求1所述一种具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽与食品基质匀浆混合，并加入辅料混匀，而后借助喷雾干燥制得粉剂，制备得到含有具有结合次黄嘌呤能力的降尿酸四肽的食品或药物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防高尿酸血症/痛风的功能性食品的剂型包括乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、软糖、糖浆剂或口服液。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗高尿酸血症/痛风的药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、散剂、糖浆剂或口服液。
10.根据权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于，所述预防高尿酸血症/痛风的功能性食品或治疗高尿酸血症/痛风的药物的递送方法包括涂抹、贴敷或微针刺穿的方式从皮肤递送。
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