CN115536729A - 一种具有降尿酸活性的二肽及其编码基因与应用 - Google Patents
一种具有降尿酸活性的二肽及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有降尿酸活性的二肽及其编码基因与应用。本发明的具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的二肽名称为HH,氨基酸序列为:His‑His,其中,His为组氨酸残基。经体外黄嘌呤氧化酶抑制活性实验及高尿酸秀丽隐杆线虫模型证明,本发明的二肽具有显著体外抑制黄嘌呤氧化酶活性,从而有效抑制机体产生尿酸,可广泛应用于制备降尿酸食品或药物,能有效治疗及预防高尿酸血症,并缓解痛风症状,具有良好社会经济效益。
Description
技术领域
本发明属于多肽技术领域,具体涉及一种具有降尿酸活性的二肽及其编码基因与应用。
背景技术
高尿酸血症属于代谢疾病,主要诱因包括尿酸生成过多及尿酸排泄受阻,当血清尿酸浓度过高时,易产生尿酸盐结晶沉积于关节处,引起痛风症状。目前三种常见降尿酸药物的作用机制及对应药物分别为:1)抑制尿酸生成,主要为别嘌呤醇、非布司他等;2)促进尿酸排泄,主要为丙磺舒、苯溴马隆等;3)分解尿酸,该类药是酶类物质,如尿酸酶。然而,上述药物存在不同程度的副作用,轻者出现恶心、皮疹等不良反应,重者引起肾脏损伤、肝脏炎症等。因此找寻一种安全、有效的化合物至关重要。
多肽作为目前功能活性成分研究中重要的原料之一,具有丰富的生理活性,如抗氧化性、抗菌性、抗炎症活性等,且其具有易吸收、无毒或低毒性等优点。而多肽的降尿酸活性,尤其是黄嘌呤氧化酶抑制活性,逐渐成为世界范围内的研究热点。Weiwei He等人在氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠中证实了金枪鱼肉水解物具有体内降尿酸活性,分离纯化并鉴定出一条具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的二肽FH,其IC50为25.7mM(别嘌呤醇IC50为22.0μM),经氧嗪酸钾诱导的高尿酸大鼠模型评价FH具有体内降尿酸活性;Qingyong Li等人对核桃粉进行酶解,鉴定得到七种黄嘌呤氧化酶抑制肽WDD、HCPF、WDQW、PPKNW、WPPKN、ADIYTE和WSREEQE,相应IC50分别为2.41mM、15.07mM、0.95mM、2.21mM、2.06mM、7.37mM和1.88mM(别嘌呤醇IC50为5.71μM),并从结构上分析得出质子供体氨基酸残基含量越高,多肽的黄嘌呤氧化酶抑制活性越高,而组氨酸(His)的侧链平衡解离常数约为7.0,既可作为质子供体,又可作为质子受体。因此,含有His的多肽可能具有潜在黄嘌呤氧化酶抑制活性。
目前,获得降尿酸活性肽的研究思路主要通过食源性蛋白经酶解、纯化,并鉴别黄嘌呤氧化酶抑制活性较高的组分,而后质谱解析该组分中多肽序列,这种方法通常具有盲目性,且耗时费力,仅从常见的食物蛋白入手,缺乏广泛性。而鲜有报道从批量虚拟筛选入手,从所有可能的二肽、三肽序列或更长多肽序列中筛选出具有潜在黄嘌呤氧化酶抑制活性的多肽序列,再通过人工合成或生物工程方法获得目标序列多肽并进行功能验证。此研究思路能更全面、更快速、更高效地找到目标多肽序列,并可结合蛋白数据库(如NCBI等),借助BLAST技术找到含有目标肽段的食源性蛋白,采用模拟酶切得到目标多肽,或采用固相合成及微生物发酵的方法获得目标多肽。此外,此研究思路在应用于制备预防或治疗高尿酸血症的食品或药物,或者应用于制备缓解痛风症状的食品或药物具有十分广阔的发展前景。
现有文献报道了多肽FH,具有黄嘌呤氧化酶抑制活性,但其IC50为25.7mM(别嘌呤醇IC50为22.0μM),表明黄嘌呤氧化酶抑制活性较弱(He W,Su G,Sun-Waterhouse D,etal.In vivo anti-hyperuricemic and xanthine oxidase inhibitory properties oftuna protein hydrolysates and its isolated fractions[J].Food Chemistry,2019,272:453-461.)。
现有文献报道了通过蛋白酶酶解核桃蛋白,基于黄嘌呤氧化酶抑制活性分离并鉴定得到7条黄嘌呤氧化酶抑制肽,但肽链长度普遍大于3个氨基酸残基,且实验验证部分肽经胃肠消化后结构不稳定,影响活性。此外,该实验依照传统研究思路,耗时费力、具有盲目性,且仅从常见食物蛋白入手缺乏广泛性(黎青勇.核桃源降尿酸肽靶向抑制黄嘌呤氧化酶活性的构效机制研究[D].华南理工大学,2018)。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种具有降尿酸活性的二肽及其编码基因与应用。该二肽能抑制黄嘌呤氧化酶活性,从而有效抑制机体产生尿酸,可广泛应用于制备降尿酸食品或药物,能有效治疗及预防高尿酸血症,并缓解痛风症状。
本发明的目的在于提供编码所述的一种具有降尿酸活性的二肽。
本发明的目的在于提供编码所述的一种具有降尿酸活性的二肽的编码基因。
本发明的目的在于提供所述的一种具有降尿酸活性的二肽的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
本发明提供一种具有降尿酸活性的二肽,所述二肽名称为HH,氨基酸序列为His-His;
其中,His为组氨酸残基。
进一步地,所述具有降尿酸活性的二肽的制备方法包括但不限于化学合成法、酶解法或基因工程法。
进一步地,所述具有降尿酸活性的二肽的筛选方法为基于四个维度包括黄嘌呤氧化酶结合稳定性、多肽分子物理特征、多肽分子结构相似性及分子间作用力分析,对含D/L构型的潜在抑制黄嘌呤氧化酶活性多肽(包括但不限于二肽)进行高通量虚拟筛选,最终得到目标多肽序列。
进一步地,所述具有降尿酸活性的二肽的体内降尿酸活性功能验证方法为基于高尿酸秀丽隐杆线虫模型,比较单位线虫产生尿酸浓度的高低,从而验证该二肽的体内降尿酸功能。
本发明提供一种编码上述具有降尿酸活性的二肽的基因,所述编码基因的碱基序列为CACCAC、CAUCAC、CACCAU或CAUCAU;基因长度为6个碱基;
其中,CAC或CAU为组氨酸的密码子。
本发明还提供一种上述具有降尿酸活性的二肽的应用,所述一种具有降尿酸活性的二肽在制备预防或治疗高尿酸血症的食品或药物,或者在制备缓解痛风症状的食品或药物中的应用。
进一步地,所述食品或药物的制备方法,包括以下步骤:将本发明所述的一种具有降尿酸活性的二肽与食品基质匀浆混合,并加入辅料混匀,而后借助喷雾干燥制得粉剂,制备得到含有具有降尿酸活性二肽的食品或药物。
进一步地,所述食品基质匀浆包括食物原浆和食物浓缩浆中的一种以上。
进一步地,所述辅料包括玉米淀粉和微晶纤维素中的一种以上。
进一步地,所述功能性食品的剂型包括乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、软糖、糖浆剂或口服液。
进一步地,所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、散剂、糖浆剂或口服液。
进一步地,所述药物可采用涂抹、贴敷或微针刺穿等方式从皮肤递送。
一种上述具有降尿酸活性多肽的筛选方法,具体为,基于黄嘌呤氧化酶结合稳定性、多肽分子物理特征、多肽分子结构相似性及分子间作用力分析等角度,对含D/L构型的潜在抑制黄嘌呤氧化酶活性多肽(包括但不限于二肽)进行高通量虚拟筛选,最终得到目标多肽序列。
一种上述具有降尿酸活性二肽的功能验证方法,具体为,基于高尿酸秀丽隐杆线虫模型,比较单位线虫产生尿酸浓度的高低,从而验证该二肽的体内降尿酸功能。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和有益效果:
1、本发明提供的一种具有降尿酸活性的二肽,经体外黄嘌呤氧化酶抑制活性实验及高尿酸秀丽隐杆线虫模型证明,该二肽具有显著降尿酸功效。
2、本发明提供的具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的二肽可广泛应用于制备降尿酸食品或药物,能有效治疗及预防高尿酸血症,并缓解痛风症状,具有良好社会经济效益。
附图说明
图1为HH与非布司他结构相似性贡献图。
图2a为HH高效液相色谱图。
图2b为HH质谱图。
图3a为不同浓度下HH对黄嘌呤氧化酶的抑制率柱状图。
图3b为别嘌呤醇与HH对黄嘌呤氧化酶半抑制浓度IC50柱状图。
图4a为别嘌呤醇对单位线虫产生尿酸总量的影响柱状图。
图4b为高尿酸秀丽隐杆线虫模型评价合成二肽体内降尿酸活性柱状图。
图4c为基于高尿酸秀丽隐杆线虫模型对比HH与鹅肌肽、肌肽的体内降尿酸活性柱状图。
图5MTT实验评价不同浓度HH对LO-2细胞存活率影响柱状图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明技术方案作进一步详细的描述,但本发明的具体实施方式及保护范围不限于此。
本发明的具有降尿酸活性的二肽,名称为HH,氨基酸序列为:His-His;
其中,His为组氨酸残基。
本发明具有降尿酸活性的二肽的结构式如下:
编码上述的具有降尿酸活性的二肽的基因,HH的编码基因的碱基序列为CACCAC、CAUCAC、CACCAU或CAUCAU;基因长度为6个碱基;
其中,CAC或CAU为组氨酸的密码子。
具体实施例中,本发明的具有降尿酸活性的二肽在应用过程中,首先基于黄嘌呤氧化酶关键作用位点结合能、分子结构相似性、分子间作用力及分子结构与物理特征等要素,通过高通量虚拟筛选技术对含D/L构型的1521条二肽进行初步筛选,得到潜在的黄嘌呤氧化酶肽类抑制剂;其次采用体外黄嘌呤氧化酶抑制实验及高尿酸秀丽隐杆线虫模型,对上述潜在的黄嘌呤氧化酶肽类抑制剂进行体内及体外降尿酸功能验证;最后经过MTT实验验证二肽对LO-2细胞存活率的影响,证明本发明的二肽具有黄嘌呤氧化酶抑制活性,进而能有效降低尿酸的生成,同时具有较低细胞毒性。
实施例1
高通量虚拟筛选潜在具有降尿酸活性的二肽
1、二肽数据集的建立
首先设置一个含有D/L构型的39种氨基酸矩阵,以大写字母表示L-氨基酸,小写字母表示D-氨基酸(如A表示L-Ala,a表示D-Ala),基于Python将设置的矩阵作笛卡尔乘积,以得到1521组多肽的可能序列,而后通过读取该表格并执行生成多肽结构的操作,以得到1521组二肽的结构文件。基于上述方法可快速生成含D/L构型的1521组二肽数据集。
2、二肽相关物理特征与结构描述符计算
借助Python的计算化学库,通过读取Excel文件的二肽序列,逐个计算出分子的相对分子质量(MolWt)、氢键受体数量(NumHAcceptors)、氢键供体数量(NumHDonors)、分子油水分配系数(MollogP)、可旋转键数(NumRotatableBonds)、芳香环数目(NunAromaticRings)、脂肪环数量(NumAliphaticRings)、拓扑极性表面积(TPSA)、饱和杂环数量(NumSaturatedHeterocycles)、饱和碳环数量(NumSaturatedCarbocyles),将这些物理与结构特征作为描述符,同时在数学上将这些值转换成一个十维向量与二肽序列相关联以便于后续分析操作。在完成计算物理结构特征后,需计算每个二肽分子的分子指纹信息。因为此前已经使用物理结构特征来描述分子局部结构,故在此选择了拓扑或称路径结构描述符来整体度量分子结构。
考虑到目前现有的各类描述符难以表征出手性分子的差异性,因此改进为于相似性计算后添加修正项,在此以L-氨基酸为标准氨基酸,则D-氨基酸为对应手性氨基酸。除去分子完全相同的情况,补充一个统计项以统计手性氨基酸出现的次数,除以总的原子数目即可得到一个微小的修正值W,该值能够区分含手性氨基酸二肽的结构上的手性差异。具体公式如下:
式中:
A,B——二肽的向量元素即分子描述符表征下的二肽分子结构;
A*B——两个向量间乘积;
||A||2——向量A的模;
||B||2——向量B的模。
3、黄嘌呤氧化酶文件获取分析与预处理
本发明采用分辨率为的黄嘌呤氧化酶结构文件,PDB编号为3NVZ,以文件编号为6的活性位点作为分子对接位点,其坐标为(37.7825,21.6461,18.0794),半径为8.9。在确定对接活性位点后,需要对黄嘌呤氧化酶结构文件进行预处理,包括补全缺损残基、分子加氢、去除水分子、去除多余蛋白链、添加力场环境及删去占据6号位点的吲哚-3-醛。
4、分子对接
首先通过力场CHARMm将1521种二肽分子进行批量能量最小化处理,使用Discovery Studio 2019的分子对接模块以对1521种多肽序列小分子同黄嘌呤氧化酶在钼喋呤中心的结合稳定性进行评估,采用软件Libdock半柔性对接方法。
5、筛选得到目标二肽序列
综合分子对接结果、分子结构相似性、分子间作用力及分子结构与物理特征四个维度的评价参数,得到具有潜在抑制黄嘌呤氧化酶活性的二肽——HH(L-His-L-His)。由图1可知HH与非布司他在结构上相似,故具有潜在抑制黄嘌呤氧化酶活性的功能。
实施例2
具有降尿酸活性的二肽的固相合成
1、合成顺序:从序列C端到N端,步骤如下:首先,称取0.05mol树脂放入反应器,加入10mL DCM(二氯甲烷)溶胀30min,抽去DCM,加入序列中第一个氨基酸0.10mol,再加0.1mol的DIEA(二异丙基乙胺),15mLDMF(二甲基甲酰胺),氮气鼓泡反应60min,然后加入0.25mol甲醇,反应30min,抽去反应液,用DMF和甲醇洗净;其次,向反应器中加入0.10mol的序列中第二个氨基酸,再加入0.10mol HBTU(1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及DIEA,氮气鼓泡反应30min,茚三酮检测,而后用吡啶和乙酸酐封端,最后洗净,加入脱帽液中反应2h去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基,所述脱帽液为三氟乙酸、酒石酸乙二胺、蒸馏水和胰蛋白酶抑制剂(TIS)的混合液,其中三氟乙酸:酒石酸乙二胺:蒸馏水:胰蛋白酶抑制剂(TIS)的体积比为94.5:2.5:2:1,洗净并茚三酮检测;此外,将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下,导入烧瓶中,加入15mL切割液,所述切割液为三氟乙酸、乙二硫醇、三异丙基硅烷和蒸馏水的混合液,其中三氟乙酸:乙二硫醇:三异丙基硅烷:蒸馏水的体积比为95:2:2:1,震荡,滤掉树脂;最后,向滤液中加入50mL乙醚,析出粗产物,采用高效液相色谱将粗品提纯至95%以上纯度,冻干成粉末。
以上过程均在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中完成,所合成的多肽经SHIMADZU高效液相色谱仪纯化,纯度达到99%以上,并采用HPLC-MS进行定性分析,测定其氨基酸序列。
合成的潜在具有降尿酸活性功能的二肽的高效液相色谱图和质谱图如图2a和图2b所示,合成的二肽一级氨基酸序列为His-His,即得到目标具有降尿酸活性的二肽。
实施例3
合成具有降尿酸活性的二肽的体外黄嘌呤氧化酶抑制活性测定
黄嘌呤氧化酶是体内生成尿酸的关键酶,本发明基于抑制黄嘌呤氧化酶(XO)活性,从而减少尿酸的生成,采用体外黄嘌呤氧化酶抑制实验可初步判断二肽的降尿酸活性。具体操作如下:用1×PBS溶解二肽粉末,并配制浓度为0.5mM、1.0mM、2.0mM、4.0mM、6.0mM、9.0mM及12.0mM二肽溶液。称取1.1mg别嘌呤醇粉末,溶于1×PBS溶液中得到20mM母液,并以此用1×PBS溶液稀释成10μM、20μM、30μM、40μM及80μM别嘌呤醇溶液作为对照组。将上述配制好的溶液与XO在37℃孵育10min,同时加入终浓度为0.4mM黄嘌呤溶液,在37℃下开始酶促反应,并记录反应体系在290nm处吸光值的动力学变化,循环间隔时间为30s。酶促反应初始速率记为V0,二肽存在时酶促反应速率记为VS,V0和VS的单位均为mol/(L·min)按照如下公式计算样品对黄嘌呤氧化酶的抑制率:
图3a表示在不同浓度(0.5mM、1.0mM、2.0mM、4.0mM、6.0mM、9.0mM、12.0mM)下HH对黄嘌呤氧化酶的抑制率,发现HH对黄嘌呤氧化酶抑制率存在剂量效应。将不同浓度取相应10为底数的对数作为x,将不同浓度对应的黄嘌呤氧化酶抑制率作为y,拟合直线得到二肽浓度的对数与抑制率的线性方程,据此计算出HH的黄嘌呤氧化酶半数抑制浓度(IC50)得到图3b,同时以别嘌呤醇为阳性对照。现已公开的具有降尿酸活性的多肽,如二肽FH的IC50值为25.7mM(别嘌呤醇IC50值为2.2×10-2mM)、四肽HCPF的IC50值为15.07mM(别嘌呤醇IC50值为5.71×10-3mM),本发明二肽HH的IC50值为5.60±0.18mM(别嘌呤醇IC50值为3.02×10-2mM),相较之下本发明二肽HH具有更强的黄嘌呤氧化酶抑制活性,因此具有更好的应用前景。
实施例4
基于高尿酸秀丽隐杆线虫模型验证合成二肽体内降尿酸活性
高尿酸动物模型有啮齿类及禽类动物,但啮齿类动物体内存在尿酸酶,能进一步氧化尿酸生成尿囊素,因此可采用尿酸酶基因敲除小鼠作为研究对象,但缺陷型小鼠较正常小鼠更易死亡,使得造模困难;禽类动物虽体内无尿酸酶,但与人类基因同源性低,不便于实验室饲养。而有相关报道称秀丽隐杆线虫可通过简单手段造成高尿酸模型,且繁殖周期短,基因同源性高(Li Z,Xue Y,Wang N,et al.High uric acid model inCaenorhabditiselegans[J].Food Science and Human Wellness,2019,8(1):63-66.DOI:10.1016/j.fshw.2019.02.003),故本发明采用高尿酸秀丽隐杆线虫模型对合成二肽进行体内降尿酸活性功能验证。具体操作如下:
1、线虫培养
配制线虫固体培养基NGM,将OP50菌悬液涂布于NGM中央,供野生型N2线虫摄食并繁殖。
2、线虫同期化
当L4期线虫及虫卵占培养皿面积的3/4以上时,用M9缓冲液将其冲洗至1.5mL离心管,并在1000rpm、20℃条件下离心1min,重复操作两次,弃上清后加入600μL M9缓冲液,再加入300μL提前配制的线虫裂解液(5M NaOH水溶液和50mg/mLNaClO水溶液等体积混合),充分摇匀5min,可在灯光下观察线虫是否完全裂解,并在2000rpm、20℃下离心1min,再用M9缓冲液冲洗2次,加入1.5mLS-Medium于20℃培养箱中过夜培养,待虫卵孵化即可得到生长时期一致的L1期幼虫。
3、高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建
将同期化且孵化成L1期的幼虫悬液以相同体积分别移入含有OP50的NGM培养基上,于20℃培养72h可得到L4期成虫。而后用M9缓冲液将其冲洗至1.5mL离心管,并在1000rpm、20℃条件下离心1min,重复操作两次,弃上清后加入900μLS-Medium重悬均匀,再分别吸取300μL移入24孔板中,体视镜下拍照,并用ImageJ软件计数。对照组仅给予1mL S-Medium于20℃下培养24h,三个平行;模型组先给予900μLS-Medium于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;别嘌呤醇组先给予880μL S-Medium及20μL浓度为0.02mg/mL的别嘌呤醇溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行。取线虫虫体和上清液,采用HPLC检测其中尿酸含量,并计算单位线虫产生尿酸的总量。
如图4a所示,别嘌呤醇组单位线虫产生尿酸的总量与对照组相比无显著性差异(p>0.05),而显著低于模型组(p<0.05),表明高尿酸秀丽隐杆线虫模型造模成功。采用单因素ANOVA进行显著性分析,其中a与b之间存在显著性差异,p<0.05,相同字母表示组间无显著性差异,p>0.05。
4、基于高尿酸秀丽隐杆线虫模型评价合成二肽的体内降尿酸活性
将同期化且孵化成L1期的幼虫悬液等体积移入含有OP50的NGM培养基上,于20℃培养72h可得到L4期成虫。而后用M9缓冲液将其冲洗至1.5mL离心管,并在1000rpm、20℃条件下离心1min,重复操作两次,弃上清后加入900μL S-Medium重悬均匀,再分别吸取300μL移入24孔板中,体视镜下拍照,并用ImageJ软件计数。对照组仅给予1mLS-Medium于20℃下培养24h,三个平行;模型组先给予900μLS-Medium于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;HH组先给予890μL S-Medium及10μL浓度为80.0mM的HH溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行。取线虫虫体和上清液,采用HPLC检测其中尿酸含量,并计算单位线虫产生尿酸的总量。
如图4b所示,HH组单位线虫产生尿酸的总量与对照组相比无显著性差异(p>0.05),而显著低于模型组(p<0.05),表明在高尿酸秀丽隐杆线虫模型上,HH表现出较强的体内降尿酸活性。采用单因素ANOVA进行显著性分析,其中*,p<0.05。
实施例5
合成具有降尿酸活性的二肽对LO-2细胞存活率的影响
将对数生长期的LO-2细胞于37℃用胰酶消化裂解细胞1min,使胞间粘连消失呈单细胞悬浮状态后,加入细胞完全培养液终止裂解过程。移入96孔板中使每孔中细胞数量为5×103,置于恒温37℃培养箱培养24h至细胞贴壁生长。在培养期间,配置含HH的细胞培养液,浓度分别为1.0mM和0.1mM。移除96孔板中溶液,加入含HH的细胞培养液,并于37℃下培养24h后去除,再加入MTT溶液(包括180μL完全培养基和20μL MTT),于37℃孵育4h后,弃去孔内的溶液,加入150μL二甲基亚砜溶解后置于摇床震荡10min,最后用酶标仪读取其在490nm下吸光值。以完全培养基为空白对照组,以含HH的完全培养基为实验组,LO-2细胞存活率如下公式计算:
由图5可知,HH在0.1mM给药浓度下对LO-2细胞存活率无显著影响(p>0.05),而在1.0mM给药浓度下可显著降低LO-2细胞存活率至80%(p<0.01),表明本发明二肽HH在低剂量摄入时无细胞毒性,高剂量摄入时存在轻微细胞毒性,需在投入实际应用时注意添加量。
对比例1
对比本发明二肽与相似结构二肽或氨基酸的体内降尿酸活性
将同期化且孵化成L1期的幼虫悬液等体积移入含有OP50的NGM培养基上,于20℃培养72h可得到L4期成虫。而后用M9缓冲液将其冲洗至1.5mL离心管,并在1000rpm、20℃条件下离心1min,重复操作两次,弃上清后加入900μL S-Medium重悬均匀,再分别吸取300μL移入24孔板中,体视镜下拍照,并用ImageJ软件计数。对照组仅给予1mLS-Medium于20℃下培养24h,三个平行;模型组先给予900μLS-Medium于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;HH组先给予890μL S-Medium及10μL浓度为80.0mM的HH溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;HY组先给予890μL S-Medium及10μL浓度为80.0mM HY溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;H组先给予880μL S-Medium及20μL浓度为80.0mM游离组氨酸溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行。取线虫虫体和上清液,采用HPLC检测其中尿酸含量,并计算单位线虫产生尿酸的总量。
如图4b所示,本发明的HH组与替换N端氨基酸残基的二肽HY组及其游离氨基酸H组相比,HH组单位线虫产生尿酸的总量最低,且与模型组单位线虫产生尿酸的总量相比显著降低单位线虫产生尿酸的总量(p<0.05),HY及H组与模型组单位线虫产生尿酸的总量相比均未显著降低(p>0.05),表明本发明二肽HH具有结构优势,进而具有最佳降尿酸活性。采用单因素ANOVA进行显著性分析,其中*表示与空白组对比存在显著性,p<0.05;#表示与模型组对比存在显著性,p<0.05。
对比例2
对比本发明二肽与鹅肌肽、肌肽的体内降尿酸活性
将同期化且孵化成L1期的幼虫悬液等体积移入含有OP50的NGM培养基上,于20℃培养72h可得到L4期成虫。而后用M9缓冲液将其冲洗至1.5mL离心管,并在1000rpm、20℃条件下离心1min,重复操作两次,弃上清后加入900μL S-Medium重悬均匀,再分别吸取300μL移入24孔板中,体视镜下拍照,并用ImageJ软件计数。对照组仅给予1mL S-Medium于20℃下培养24h,三个平行;模型组先给予900μL S-Medium于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;HH组先给予890μL S-Medium及10μL浓度为80.0mM的HH溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL的黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;肌肽组先给予890μLS-Medium及10μL浓度为80.0mM肌肽溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行;鹅肌肽组先给予890μL S-Medium及10μL浓度为80.0mM鹅肌肽溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养6h,再给予100μL浓度为1.0mg/mL黄嘌呤溶液(溶剂为含有体积分数1.5%DMSO的S-Medium)于20℃下培养18h,三个平行。取线虫虫体和上清液,采用HPLC检测其中尿酸含量,并计算单位线虫产生尿酸的总量。
如图4c所示,与目前证实具有降尿酸活性的二肽——鹅肌肽与肌肽单位线虫产生尿酸的总量与模型组单位线虫产生尿酸的总量相比均未显著降低(p>0.05)相比,HH干预后与模型组单位线虫产生尿酸的总量相比显著降低单位线虫产生尿酸的总量(p<0.05),表明基于高尿酸秀丽隐杆线虫模型,本发明二肽HH的降尿酸活性优于当前公认降尿酸肽。
Claims (10)
1.一种具有降尿酸活性的二肽,其特征在于,所述二肽名称为HH,氨基酸序列为His-His,其中,His为组氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的一种具有降尿酸活性的二肽,其特征在于,所述具有降尿酸活性的二肽的制备方法包括化学合成法、酶解法或基因工程法。
3.根据权利要求1所述的一种具有降尿酸活性的二肽,其特征在于,所述具有降尿酸活性的二肽的筛选方法为基于四个维度包括黄嘌呤氧化酶结合稳定性、多肽分子物理特征、多肽分子结构相似性及分子间作用力分析,对含D/L构型的潜在抑制黄嘌呤氧化酶活性多肽进行高通量虚拟筛选,最终得到目标多肽序列。
4.根据权利要求1所述的一种具有降尿酸活性的二肽,其特征在于,所述具有降尿酸活性的二肽的体内降尿酸活性功能验证方法为基于高尿酸秀丽隐杆线虫模型,比较单位线虫产生尿酸浓度的高低,从而验证该二肽的体内降尿酸功能。
5.权利要求1所述的具有降尿酸活性的二肽的编码基因,其特征在于,所述编码基因的碱基序列为CACCAC、CAUCAC、CACCAU或CAUCAU,基因长度为6个碱基;
其中,CAC或CAU为组氨酸的密码子。
6.权利要求1所述的一种具有降尿酸活性的二肽的应用,其特征在于,所述一种具有降尿酸活性的二肽在制备预防或治疗高尿酸血症的功能性食品或药物,或者在制备缓解痛风症状的食品或药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述食品或药物的制备方法,包括以下步骤:将权利要求1所述一种具有降尿酸活性的二肽与食品基质匀浆混合,并加入辅料混匀,而后借助喷雾干燥制得粉剂,制备得到含有具有降尿酸活性二肽的食品或药物。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述功能性食品的剂型包括乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、软糖、糖浆剂或口服液。
9.权利要求6所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、散剂、糖浆剂或口服液。
10.根据权利要求6-9所述的应用,其特征在于,所述药物采用涂抹、贴敷或微针刺穿的方式从皮肤递送。
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