CN115677834A - 一种降血压活性肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降血压活性肽及其应用。本发明利用分子对接技术探究广东糯米酒肽MGYTSY(720.2789Da)的作用机制，发现它能与ACE的活性位点发生相互作用，形成紧密的复合体。探究了活性肽的体外ACE抑制活性，并发现MGYTSY(IC50＝0.123mg/mL)对ACE的抑制模式属于非竞争性抑制。此外，活性肽MGYTSY能显著提升EA.hy926细胞内NO释放量，且降低细胞内ET‑1的释放量，是降血压功能性食品配料和/或降血压药物的理想原料来源。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降血压活性肽及其应用。
背景技术
广东糯米酒中的生物活性肽是在发酵过程中通过分泌微生物酶降解蛋白质产生的，一般以数个氨基酸组合而成。目前对广东糯米酒中活性肽的具体组成和功效的研究尚浅。
近年来，心血管疾病已成为导致死亡的主要因素，而高血压与心血管疾病息息相关。高血压是一种常见的慢性疾病，患者容易引发心肌梗塞、心力衰竭等重大疾病。因此，降压治疗可以有效预防心血管疾病。
人体血压主要受肾素-血管紧张素系统(RAS)与激肽释放酶-激肽系统(KKS)调节，其中血管紧张素转换酶(ACE)发挥重要作用。在RAS中，ACE可以将血管紧张素I转化为具有强血管收缩活性的血管紧张素II，引起血管收缩。在KKS中，ACE可以使血管舒张剂缓激肽失活，最终导致血压升高。因此，抑制ACE的活性是治疗高血压患者的一种有效途径。
目前已有研究表明，化学合成的抗高血压药物有许多副作用，并不适合患者长时间服用。因此，副作用少且容易获得的食源性ACE抑制剂，引起广泛关注，成为抗高血压药物的理想替代品或补充物。近年来，有许多降血压肽从多种食源性蛋白质中提取和鉴定出来，并且发现它们具有不俗于化学药物的ACE抑制活性。比如来自于酪蛋白的NMAINPSKENLCSTFCK和罗非鱼蛋白中的LSGYGP。
发明内容
为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供一种降血压活性肽。
本发明的另一目的在于提供上述降血压活性肽的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述降血压活性肽的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种降血压活性肽，其氨基酸序列为MGYTSY(Met-Gly-Tyr-Thr-Ser-Tyr)。
上述活性肽的制备方法，按照所述的活性肽的氨基酸序列，利用固相多肽合成技术，使氨基酸从羧基端向氨基端不断添加、反应、合成，得到所述的活性肽。
上述活性肽在制备ACE抑制剂、降血压功能性食品配料和/或降血压药物中的应用。
进一步地，在所述的应用中，所述的ACE抑制剂为非竞争性ACE抑制剂。
进一步地，在所述的应用中，所述的降血压功能性食品配料和/或降血压药物具有促进NO的释放以及降低ET-1释放的作用。
进一步地，在所述的应用中，所述ACE抑制剂、降血压功能性食品配料和/或降血压药物是以所述的活性肽作为活性成分，可添加食品上或药物学上可接受的载体或辅料。
一种ACE抑制剂，包含所述的活性肽作为活性成分。
进一步地，所述的ACE抑制剂中还包含药物学上可接受的载体或辅料。
一种降血压功能性食品配料，包含所述的活性肽作为活性成分。
进一步地，所述的降血压功能性食品配料中还包含食品上可接受的载体或辅料。
一种降血压药物，包含所述的活性肽作为活性成分。
进一步地，所述的降血压药物中还包含药物学上可接受的载体或辅料。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明利用分子对接技术探究广东糯米酒肽MGYTSY(720.2789Da)的降血压作用机制，发现它能与ACE的活性位点发生相互作用，形成紧密的复合体。探究了活性肽的体外ACE抑制活性，并发现MGYTSY(IC50＝0.123mg/mL)对ACE的抑制模式属于非竞争性抑制。此外，活性肽MGYTSY能显著提升EA.hy926细胞内NO释放量，且降低细胞内ET-1的释放量，是降血压功能性食品配料和/或降血压药物的理想原料来源。
附图说明
图1为肽MGYTSY的二级质谱图；
图2为肽MGYTSY与ACE抑制肽的分子对接结果图；A是活性肽MGYTSY结构示意图；B是降血压活性肽的分子对接结果示意图；
图3为肽MGYTSY对ACE的抑制作用结果图；
图4为肽MGYTSY抑制ACE的Lineweaver-Burk图；
图5为肽MGYSTY的细胞毒性研究结果图；
图6为肽MGYSTY对细胞NO分泌的影响结果图；
图7为肽MGYSTY对细胞内ET-1分泌的影响结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中的实验材料来源分别为：广东糯米酒由广东河源绿纯食品有限公司提供，血管紧张素转换酶(ACE，来自兔肺)，羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，呋喃丙烯酰三肽(FAPGG)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯)；人脐静脉细胞融合细胞(EA.hy926)购自中国科学院细胞库；DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和0.25％胰酶购自美国Gibco公司；其他化学品和试剂均为分析纯。
实施例1：血管紧张素转换酶抑制活性肽的合成与测定
1.分子对接
采用MarvinSketch软件对活性肽进行结构绘制，并进行能量最小化结构优化，输出为mol2格式文件，用于后续对接。从PDB数据库(RCSB PDB:Homepage)中下载受体分子ACE蛋白(1O8A)的晶体结构，并用Pymol软件去除受体中含有的配体和水分子，最后保存为pdb格式文件。用AutodockTools 1.5.6软件对受体分子与合成肽进行加氢和计算电荷等处理并输出为pdbqt格式文件后使用Vina进行对接。根据Vina对接结合能进行排序，并选择亲和力较强的肽用Pymol与Discovery Studio 4.5软件进行可视化分析。
2.降血压活性肽的合成
降血压活性肽MGYTSY由南京Synpeptide有限公司合成。采用高效液相色谱法测定合成肽的纯度为98％，LC/ESI-MS法测定合成肽的分子质量。通过体外实验与细胞实验验证其ACE抑制活性。
3.降血压活性肽理化性质分析
对降血压活性肽MGYTSY的毒性、疏水性和稳定性等理化特性进行了评估。利用ToxinPred工具(ToxinPred(iiitd.edu.in))预测肽的毒性。利用PepDeaw工具(PepDraw(tulane.edu))预测肽的疏水性。利用ProtParam tool工具(http://web.expasy.org/protparam/)预测肽的稳定性。
4.ACE抑制活性测定
取40μL样品溶液，与50μL 1.0mmol/L FAPPG混合，空白组使用40μL 80mmol/LHEPES缓冲液与50μL FAPPG混合。两组同时加入10μL 0.1U/mL ACE。加入ACE后，立即在340nm波长处测量两组的吸光值，空白组记录为A1，实验组记录为B1。经37℃避光培养后取出，在340nm处再次测量两组的吸光度值，分别记录为A2、B2。所得数据按以下公式(1)计算：
ACE 抑制率 (％)＝[(A1-A2)-(B1-B2)]/(A1-A2)×100 (1)。
5.ACE抑制动力学测定
用0.33,0.67,1.33,3.08mmol/L的底物分别与0.5,1.0mg/mL的肽混合，再加入ACE酶反应，以1/V为纵坐标，1/S为横坐标做出Lineweaver-Burk图。
6.ACE抑制肽对EA.hy 926细胞的影响
6.1细胞毒性实验
把EA.hy926细胞置于完全培养基(DMEM中加入20％胎牛血清、1％非必需氨基酸和1％青霉素-链霉素溶液)中培养。培养液储存在37℃，5％二氧化碳的环境中。细胞毒性通过MTT法测定，在白色96孔板中接种每孔100μL的细胞悬液，得到接种密度为每孔1×104个细胞，并在37℃下孵育24h。为避免周围环境变化，将PBS加入到板的最外层孔中。细胞培养24h后进行换液，正常组加入100μL完全培养基，实验组加入100μL不同浓度(0.025,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2mg/mL)肽，对照组加入相同浓度的卡托普利继续培养24h。细胞培养24h后进行换液，每孔分别加入100μL0.5 mg/mL MTT溶液，避光培养4h，弃去MTT溶液后用PBS清洗并加入100μL DMSO，充分震荡10min用酶标仪于490nm下测OD值。细胞存活率按公式(2)计算：
存活率(％)＝实验组OD值/正常组OD值×100(2)。
6.2一氧化氮(NO)含量的测定
在白色96孔板中接种每孔100μL的细胞悬液，得到接种密度为每孔1×104个细胞，并在37℃下孵育24h。24h后换液，正常组加入100μL完全培养基，实验组加入100μL不同浓度(0.1,0.25,0.5mg/mL)的肽，对照组加入相同浓度的卡托普利，孵育24h。取细胞上清液保存待测。参考NO试剂盒测定细胞的NO含量。
6.3内皮素(ET-1)含量的测定
在白色96孔板中接种每孔100μL的细胞悬液，得到接种密度为每孔1×104个细胞，并在37℃下孵育24h。24h后换液，正常组加入100μL完全培养基，实验组加入100μL不同浓度(0.1,0.25,0.5mg/mL)的肽，对照组加入相同浓度的卡托普利，孵育24h。24h后取细胞培养液经1000xg离心后取上清液待测。参考ET-1试剂盒测定细胞的ET-1含量。
7.统计分析
统计分析使用SPSS20.0统计分析软件完成。所有实验重复三次，结果以平均值±标准差表示。经单因素方差分析，p<0.05时表明差异有显著性。
7.1分子对接可视化分析
有研究表明，ACE抑制肽的抑制活性与其序列中C末端的肽段有关。而肽与ACE的结合效果同样与序列中的芳香族氨基酸(Phe、Trp和Tyr)或脯氨酸(Pro)，以及支链侧链氨基酸(Ala、Gly、Ile、Leu、Met和Val)有明显的关联。因此，我们筛选出MGYTSY与ACE受体蛋白进行分子对接，探究它的ACE抑制机制。
有研究表明，ACE共有3个活性口袋，分别是S1、S2和S1’，其中S1包含Ala354,Glu384,and Tyr 523；S2包含Gln 281,His 353,Lys 511,His 513,and Tyr 520,S1’包含Glu162。ACE抑制肽与这些活性口袋中的关键位点以不同作用力结合，形成稳定的复合体结构，从而达到抑制ACE在血压调节系统中发挥作用的目的。降血压活性肽MGYTSY与ACE受体蛋白的理论结合模式如图2中的B所示。MGYTSY与关键位点Ala354、Tyr523形成氢键，此外还与其他位点Asn70、Asn66形成氢键，与Ser355形成碳氢键、与Phe512形成Pi-Pi键、与Ala63形成疏水相互作用，与Zn701形成相互作用力。
肽-ACE复合体的稳定性是通过不同作用力维持的，包括氢键、碳氢键、盐桥、疏水相互作用、范德华力、Metal-Acceptor等等，其中最重要的作用力是氢键。如表1所示，MGYTSY对接结合能为-9.1，氢键数量为8个，而且能与ACE蛋白中三个活性口袋的关键位点有不同程度的结合。这表明MGYTSY能与ACE受体蛋白有较好的结合效果。
此外，ACE抑制剂与ACE中的锌离子结合产生相互作用时同样能抑制ACE的活性。卡托普利、依那普利、福辛普利这些ACE抑制剂均能与ACE的锌离子形成化学键。这一结果在近几年的研究中得以证实：从柠檬罗勒籽中提取的GPAGPAGL在分子对接中能够与锌离子形成Metal-Acceptor键，从比目鱼中提取的MEVFVP也在分子对接中与锌离子形成Metal-Acceptor键。在本次研究中，MGYTSY同样能与Zn701形成Metal-Acceptor键，由此可以推断这个活性肽与ACE具有明确的作用位点并形成稳定的复合体。
表1.活性肽与ACE蛋白对接能量及相互作用位点
7.2降血压活性肽理化性质分析
由于体内与体外的评价系统有成本高、操作复杂等特点，具有可以初步预测肽序列理化性质的分析工具已被广泛使用。通过分析工具对肽MGYTSY的毒性、疏水性和稳定性进行评估，结果如表2所示。生物活性肽虽然具有活性强、生产成本低、易被吸收等特点，但其潜在毒性仍然是食品加工生产中值得关注的问题。结果显示MGYTSY没有毒性，可以作为活性物质参与功能性食品的开发中。由于ACE的C端结构域是一个疏水环境，所以疏水性高的降血压活性肽更容易与其结合，发挥抑制作用。MGYTSY具有良好的疏水性，为7.67kcal/mol。在稳定性方面，MGYTSY的不稳定指数为-19.97，被分析工具判定为稳定。
表2.降血压活性肽的理化性质预测
7.3降血压活性肽的ACE抑制活性测定
肽MGYTSY和阳性对照物卡托普利的ACE抑制活性IC50值如图3所示。MGYTSY表现出较强的ACE抑制活性，是一种新型有效的ACE抑制剂，其活性显著高于已报道的酵母蛋白肽YGKPVAVPAR(IC50＝0.42mg/mL)和鲣鱼肌肉蛋白肽VDRYF(IC50＝0.28mg/mL)，以及发明人前期专利CN202210484022.4-广东糯米酒抗氧化和ACE抑制活性肽及其应用中的肽VLSGA(IC50＝0.50mg/mL)和VISGA(IC50＝0.81mg/mL)。因此，将进一步探究活性肽MGYTSY的ACE抑制模式以及在细胞水平的降血压活性。
7.4降血压活性肽ACE抑制动力学测定
采用Lineweaver-Burk图分析肽MGYTSY对ACE的抑制模式。如图4所示，MGYTSY对ACE主要呈非竞争性抑制，这表明MGYTSY不仅能够与游离ACE进行结合，还不占据底物与ACE结合的活性区域，具有与底物-ACE复合物结合的能力。在肽与游离ACE结合的情况下，肽降低了ACE与底物的结合能力；而肽与底物-ACE复合物结合，能够阻止复合物生成反应产物，也能达到降血压的目的。类似地，从比目鱼肌肉蛋白中提取出的VSQLTR同样是非竞争性ACE抑制剂。这些结果也进一步验证了分子对接技术的可行性，从MGYTSY的可视化分析可以得出，它主要是与ACE的非活性位点结合，不需要与底物竞争ACE的活性区域。因此，我们认为糯米酒源降血压活性肽有望作为功能性食品配料与卡托普利等化学药物协同使用，在保证降血压疗效的同时降低病患对化学药物的依赖程度。
7.5降血压活性肽对EA.hy926细胞的影响
7.5.1细胞毒性实验
为了进一步验证降血压活性肽的安全性，我们基于MTT法评估MGYSTY在0.025～2mg/mL下的细胞毒性，结果如图5所示。卡托普利在0.025～2mg/mL时的细胞活性均在90％以上，但MGYSTY在2mg/mL时的细胞存活率小于90％。综上所述，活性肽MGYSTY在1mg/mL浓度范围内对EA.hy926细胞均无细胞毒性。
7.5.2活性肽对细胞一氧化氮(NO)含量的影响
有研究表明，使用ACE抑制剂进行降血压治疗主要是通过内皮依赖性血管舒张实现的，这是由于肾素血管紧张素系统(RAS)中内皮型一氧化氮合酶产生血管舒张因子NO，维持机体正常的血压水平。如图6所示，经不同浓度的肽MGYTSY处理后，细胞NO释放量与空白组相比均显著增加。在0.5mg/mL时，MGYTSY使细胞的NO释放量达到最高，分别2.79μmol/L，是空白组的4.7倍。目前已报道来自于海鞘的AHIII和来自于南极磷虾的YRK都具有抑制ACE活性和增加细胞NO生成的能力。因此，糯米酒源降血压活性肽可以抑制血管扩张剂的分解，直接刺激内皮细胞释放NO。
7.5.3活性肽对细胞内皮素(ET-1)含量的影响
除了肾素血管紧张素系统(RAS)，内皮素系统在血压调节方面的作用越来越被重视，其中ET-1的过度表达会导致机体动脉硬化、高血压等心血管疾病。因此，能够降低机体内ET-1的水平的肽也具有潜在的降血压活性。结果如图7所示，与空白组相比，肽MGYSTY都可以显著降低细胞内ET-1的水平，且低、中、高剂量组间存在明显的剂量依赖关系，表明其具有潜在的降血压活性。在0.5mg/mL时，MGYSTY使细胞内ET-1含量达到最低水平，为47.77pg/mL，相比空白组降低了27.1％。这一结果可以媲美卡托普利的效果。
7.6结论
在本次研究中，我们发现糯米酒源活性肽MGYTSY具有潜在降血压活性。它能与ACE的关键位点以不同作用力结合，还与Zn701形成Metal-Acceptor键。活性肽MGYTSY对ACE有明显的抑制作用，对ACE属于非竞争性抑制。细胞实验结果表明MGYTSY与卡托普利都可以通过诱导细胞提高NO释放量与降低ET-1释放量来发挥降血压的作用。我们认为肽MGYTSY有望作为一种能够降血压的膳食补充剂或功能性食品配料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种降血压活性肽，其特征在于：其氨基酸序列为Met-Gly-Tyr-Thr-Ser-Tyr。
2.权利要求1中所述的活性肽的制备方法，其特征在于：按照所述的活性肽的氨基酸序列，利用固相多肽合成技术，使氨基酸从羧基端向氨基端不断添加、反应、合成，得到所述的活性肽。
3.权利要求1中所述的活性肽在ACE抑制剂、降血压功能性食品配料和/或降血压药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的ACE抑制剂为非竞争性ACE抑制剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的降血压功能性食品配料和/或降血压药物具有促进NO的释放以及降低ET-1释放的作用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的ACE抑制剂、降血压功能性食品配料和/或降血压药物以所述的活性肽作为活性成分。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的ACE抑制剂、降血压功能性食品配料和/或降血压药物还包含食品上或药物学上可接受的载体或辅料。
8.一种ACE抑制剂，其特征在于：包含权利要求1中所述的活性肽作为活性成分。
9.一种降血压功能性食品配料，其特征在于：包含权利要求1中所述的活性肽作为活性成分。
10.一种降血压药物，其特征在于：包含权利要求1中所述的活性肽作为活性成分。
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