CN117616046A - 抗ccr8抗体及其用途 - Google Patents

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范国煌
王建飞
杜娟
王娜
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Abstract

本发明涉及抗CCR8抗体和使用抗CCR8抗体的方法。本文所述的抗CCR8抗体可用于诊断和治疗由CCR8和/或CCLl介导的疾病，诸如多种癌症和与异常CCL1/CCR8轴相关的神经性疼痛。

Description

抗CCR8抗体及其用途
技术领域
本发明涉及新型抗CCR8抗体或其抗原结合片段、编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、包括所述核酸的载体和宿主细胞、用于产生所述抗体或其抗原结合片段的方法、含有所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分的药物组合物以及所述抗体在治疗由CCR8介导的疾病中的用途。
背景技术
趋化因子是参与炎症中细胞募集和激活的低分子量趋化细胞因子家族。趋化因子通过与作为G蛋白偶联受体的趋化因子受体结合来调节广泛的细胞功能并发挥其作用，从而引起免疫系统中各种细胞亚群的趋化性和激活。根据蛋白质内N末端半胱氨酸残基的位置，趋化因子被分为不同类别，包括CC、CXC、CX3C和XC。CC类趋化因子含有前两个半胱氨酸不被任何氨基酸隔开的CC基序，而CXC类趋化因子含有前两个半胱氨酸被随机氨基酸隔开的CXC基序。趋化因子的活性主要通过与其在白细胞表面上的受体紧密结合来介导。
在正常生理条件下，趋化因子和趋化因子受体的表达受到精细且严格的调节，趋化因子和趋化因子受体的表达和激活失调通常引起诸如自身免疫性疾病或癌症等疾病。
身体有许多旨在防止癌症发生的内在机制。在这方面，免疫系统被认为在消灭携带基因突变的细胞中发挥着关键作用。因此，推断癌细胞通常通过不断进化的方式持续存在，以避免被免疫系统的细胞识别。特别地，已经表明，外周循环内和肿瘤微环境内调节性T淋巴细胞(其可以在本文中称为“Treg细胞”)的水平升高都是在癌症患者中观察到的免疫抑制的基础。存在Treg细胞的数量增加也已经被确定为成功实施癌症免疫疗法的障碍。
CCR8(C-C基序趋化因子受体8)主要在Treg细胞和Th2细胞上表达，但是不在Th1细胞上表达。已经证明，这个表达CCR8的CD4+Foxp3+Treg细胞(CCR8+Treg细胞)子集是免疫抑制的主要驱动因素，并且对Treg功能和抑制至关重要。此外，CCR8是一种在若干肿瘤类型中被肿瘤驻留Treg细胞选择性上调的特异性标志物。许多报道表明，CCR8+Treg细胞的增加对肿瘤逃逸机制有益。在临床上，乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌和许多其他癌症类型的肿瘤微环境中Treg细胞的增加与预后不良相关。就机制而言，Treg细胞不仅抑制广泛的抗肿瘤免疫反应，而且还促进肿瘤微环境血管的再生。肿瘤微环境中的癌细胞和免疫细胞分泌CCL1(CCR8的特异性配体)，从而将CCR8+Treg细胞募集到肿瘤微环境中。CCR8还在肿瘤微环境中的Treg增殖和扩增中发挥作用。已经表明，CCR8抑制剂可减少肿瘤浸润的Treg细胞，从而防止肿瘤生长。因此，CCR8被认为是癌症的潜在治疗靶标。
CCR8在脊髓神经元中表达，脊髓神经元也是脊髓CCL1的主要来源。CCL1是一种来自CC亚家族的充分表征的趋化因子。它通过与细胞表面趋化因子受体CCR8相互作用来吸引免疫细胞。CCL1和CCR8神经元信号传导还在糖尿病、脊髓损伤等诱发的神经性疼痛中发挥重要作用。因此，CCL1/CCR8轴可能是治疗糖尿病性神经病的药物开发的有希望的新型靶标。
据报道，CCL1-CCR8相互作用还在诸如IgG4相关硬化性胆管炎(ISC)等IgG4相关疾病(IgG4-RD)中发挥关键作用。
最近鉴定出的另一种CCR8配体是CCL18，它是一种来自β-趋化因子亚家族的趋化因子。与原发性舍格伦综合征和对照受试者相比，IgG4-RD患者的唇唾液腺(LSG)和泪腺中的CCL18-CCR8轴特异性上调。基于其重要的致病作用，诸如各种细胞的趋化性、纤维化的诱导和IgG4产生的增强，该轴可能是IgG4-RD中潜在的新型治疗靶标。
鉴于CCR8在多种疾病的发病机制中的作用，希望制备抑制CCR8活性的抗体，所述抗体可用于治疗由CCR8介导的疾病，诸如癌症、神经性疼痛、IgG4相关疾病(IgG4-RD)，包括但不限于自身免疫性胰腺炎、嗜酸性血管中心纤维化、纤维化纵隔炎、肥厚性硬脑膜炎、伴有广泛肾小管间质沉积的特发性低补体血症性肾小管间质性肾炎、炎性主动脉瘤、炎性假瘤、Küttner肿瘤(慢性硬化性涎腺炎)、纵隔纤维化、米库利兹综合征、多灶性纤维硬化、主动脉周炎和动脉周炎、腹膜后纤维化(奥蒙德病(Ormond's disease))、里德尔氏甲状腺炎(Riedel's thyroiditis)、硬化性肠系膜炎、硬化性胰腺炎和硬化性胆管炎等。
总结起来，本领域需要包含抗CCR8抗体的更有效的治疗剂，所述治疗剂有效地抑制CCR8信号传导，同时在人中引起最小的不良副作用。
发明内容
本发明的目的是提供特异性结合CCR8的抗CCR8抗体或其抗原结合片段，它们通过抑制由特异性表达CCR8的Treg细胞等介导的免疫抑制来激活免疫。另外，本文公开的抗CCR8抗体或其抗原结合片段可以通过调节CCL1/CCR8轴来减轻神经性疼痛。此类抗体或抗原结合片段可以用于靶向表达CCR8的细胞以用于治疗和诊断目的。
本发明的诸位发明人还发现，本文公开的人源化抗体不仅与CCR8特异性结合，而且还显示出强烈的CCL1-CCR8信号传导阻断和改善的物种交叉反应性。因此，本发明的主要优点包括：
(a)根据本发明的抗体具有出色的生物活性和特异性，它对细胞表面CCR8具有良好的结合亲和力，并且可以用作靶向CCR8的抗体；
(b)根据本发明的全人抗体不仅具有与免疫抗体相当的活性，而且还具有较低的免疫原性；
(c)根据本发明的抗体不仅在抑制CCLl诱导的趋化性中具有显著效果，而且还适用于其他异常CCL1/CCR8轴相关疾病。
在第一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链可变区，所述重链可变区包含选自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
a)SEQ ID NO:2、3和4；或
b)SEQ ID NO:2、3和10；或
c)SEQ ID NO:2、16和17；或
d)SEQ ID NO:22、23和24；或
e)SEQ ID NO:32、33和34；或
f)SEQ ID NO:40、41和42；或
g)SEQ ID NO:47、48和49；或
h)SEQ ID NO:40、3和55；或
i)SEQ ID NO:58、59和60；或
j)SEQ ID NO:58、3和63；或
k)SEQ ID NO:2、3和67；或
l)SEQ ID NO:72、73和74；或
m)SEQ ID NO:58、79和80；或
n)SEQ ID NO:58、83和84；或
o)SEQ ID NO:58、83和88；或
并且包含至少一个轻链可变区，所述轻链可变区包含选自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)SEQ ID NO:6、7和8；或
b)SEQ ID NO:12、7和14；或
c)SEQ ID NO:19、7和14；或
d)SEQ ID NO:26、20和27；或
e)SEQ ID NO:30、20和27；或
f)SEQ ID NO:36、37和38；或
g)SEQ ID NO:44、37和45；或
h)SEQ ID NO:51、52和53；或
i)SEQ ID NO:6、7和8；或
j)SEQ ID NO:6、7和14；或
k)SEQ ID NO:65、7和14；或
l)SEQ ID NO:69、70和13；或
m)SEQ ID NO:76、37和77；或
n)SEQ ID NO:86、7和14，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR8；并且以上氨基酸序列中的任一个进一步包括通过任选地添加、缺失、修饰和/或取代1-5(或1、2、3)个氨基酸而形成并且能够保留CCR8结合能力的衍生序列。
在优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)SEQ ID NO:2、3、4、6、7和8；或
b)SEQ ID NO:2、3、10、12、7和14；或
c)SEQ ID NO:2、16、17、19、7和14；或
d)SEQ ID NO:22、23、24、26、20和27；或
e)SEQ ID NO:22、23、24、30、20和27；或
f)SEQ ID NO:32、33、34、36、37和38；或
g)SEQ ID NO:40、41、42、44、37和45；或
h)SEQ ID NO:47、48、49、51、52和53；或
i)SEQ ID NO:40、3、55、6、7和8；或
j)SEQ ID NO:58、59、60、6、7和14；或
k)SEQ ID NO:58、3、63、65、7和14；或
l)SEQ ID NO:2、3、67、69、70和13；或
m)SEQ ID NO:72、73、74、76、37和77；或
n)SEQ ID NO:58、79、80、6、7和14；或
o)SEQ ID NO:58、83、84、86、7和14；或
p)SEQ ID NO:58、83、88、86、7和14。
在优选实施方案中，所述重链进一步包括重链恒定区和/或所述轻链进一步包括轻链恒定区。
在优选实施方案中，所述抗体的3个HCDR和3个LCDR中添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸的数量为1-5(诸如1-3，优选1-2，更优选1)。
在优选实施方案中，所述抗体的重链可变区进一步包含人或人源化框架区，和/或所述抗体的轻链可变区进一步包含人或人源化框架区。
在优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
a)具有SEQ ID NO:1的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:5的多肽序列的轻链可变区；或
b)具有SEQ ID NO:9的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:11的多肽序列的轻链可变区；或
c)具有SEQ ID NO:15的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区；或
d)具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:25的多肽序列的轻链可变区；或
e)具有SEQ ID NO:28的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:29的多肽序列的轻链可变区；或
f)具有SEQ ID NO:31的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:35的多肽序列的轻链可变区；或
g)具有SEQ ID NO:39的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:43的多肽序列的轻链可变区；或
h)具有SEQ ID NO:46的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:50的多肽序列的轻链可变区；或
i)具有SEQ ID NO:54的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:56的多肽序列的轻链可变区；或
j)具有SEQ ID NO:57的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:61的多肽序列的轻链可变区；或
k)具有SEQ ID NO:62的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:64的多肽序列的轻链可变区；或
l)具有SEQ ID NO:66的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:68的多肽序列的轻链可变区；或
m)具有SEQ ID NO:71的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:75的多肽序列的轻链可变区；或
n)具有SEQ ID NO:78的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:81的多肽序列的轻链可变区；或
o)具有SEQ ID NO:82的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:85的多肽序列的轻链可变区；或
p)具有SEQ ID NO:87的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:89的多肽序列的轻链可变区；或
q)具有SEQ ID NO:90的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:91的多肽序列的轻链可变区；或
r)具有SEQ ID NO:92的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:93的多肽序列的轻链可变区；或
s)具有SEQ ID NO:94的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:95的多肽序列的轻链可变区；或
t)具有SEQ ID NO:96的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:97的多肽序列的轻链可变区；或
u)具有SEQ ID NO:92的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:98的多肽序列的轻链可变区；或
v)具有SEQ ID NO:92的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:99的多肽序列的轻链可变区；或
w)具有SEQ ID NO:100的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:101的多肽序列的轻链可变区；或
x)具有SEQ ID NO:102的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:103的多肽序列的轻链可变区；或
y)具有SEQ ID NO:104的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:105的多肽序列的轻链可变区；或
z)具有SEQ ID NO:106的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:107的多肽序列的轻链可变区；或
aa)具有SEQ ID NO:108的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:109的多肽序列的轻链可变区；或
bb)具有SEQ ID NO:110的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:111的多肽序列的轻链可变区。
在优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在优选实施方案中，所述抗体是双链抗体或单链抗体。
在优选实施方案中，所述抗体是全长抗体蛋白或抗原结合片段。
在优选实施方案中，所述抗体是重组抗体。
在优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
在优选实施方案中，所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
在另一个优选实施方案中，所述CCR8特异性抗体选自：(i)单链抗体、单链可变片段(scFv)、缺乏铰链区的单价抗体或微抗体；(ii)Fab、Fab'或F(ab')2片段；(iii)全抗体；和(iv)包含人IgG Fc结构域的抗体。
在优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。
在优选实施方案中，所述抗体是人抗CCR8抗体。
在优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:1、9、15、21、28、31、39、46、54、57、62、66、71、78、82、87、90、92、94、96、100、102、104、106、108或110至少(≥)85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO:5、11、18、25、29、35、43、50、56、61、64、68、75、81、85、89、91、93、95、97、98、99、101、103、105、107、109或111至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽序列的轻链可变区。
在特别优选的实施方案中，所述CCR8特异性抗体的VH链和VL链与选自以下的相应VH链和VL链的氨基酸序列分别具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性：SEQ ID NO:1和5；或SEQ ID NO:9和11；或SEQ ID NO:15和18；或SEQ ID NO:21和25；或SEQ ID NO:28和29；或SEQ ID NO:31和35；或SEQ ID NO:39和43；或SEQ ID NO:46和50；或SEQ ID NO:54和56；或SEQ ID NO:57和61；或SEQ ID NO:62和64；或SEQ ID NO:66和68；或SEQ ID NO:71和75；或SEQ ID NO:78和81；或SEQ ID NO:82和85；或SEQ ID NO:87和89；或SEQ ID NO:90和91；或SEQ ID NO:92和93；或SEQ ID NO:94和95；或SEQ ID NO:96和97；或SEQ ID NO:92和98；或SEQ ID NO:92和99；或SEQ ID NO:100和101；或SEQ ID NO:102和103；或SEQ ID NO:104和105；或SEQ ID NO:106和107；或SEQ ID NO:108和109；或SEQ ID NO:110和111。
在一些实施方案中，本文公开了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段在包含选自人CCR8的Y94至K107的一个或多个氨基酸残基的表位处与人CCR8结合。
在一些实施方案中，本文公开了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段在包含选自人CCR8的Y94、L95、L96、D97、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一个或多个氨基酸残基的表位处与人CCR8结合。
在一些实施方案中，本文公开了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段在包含选自人CCR8的Y94、L95、L96、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一个氨基酸残基的表位处与人CCR8结合。
在其他特别优选的实施方案中，所述CCR8特异性抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。
在另一个优选实施方案中，所述CCR8特异性抗体是选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和合成IgG的IgG。
在优选实施方案中，所述抗体呈药物缀合物的形式。
在第二方面，提供了一种重组蛋白(或多肽)，所述重组蛋白(或多肽)包含：
(i)根据本发明的第一方面的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)有助于表达和/或纯化的任选标签序列。
在优选实施方案中，所述标签序列包括6His标签。
在优选实施方案中，所述重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在优选实施方案中，所述重组蛋白是单体、二聚体或多聚体。
在第三方面，提供了分离的核酸，所述分离的核酸编码第一方面中的单克隆抗体或抗原结合片段或本发明的第二方面中的重组蛋白。
在第三方面，提供了分离的核酸，所述分离的核酸编码第一方面中的抗体或抗原结合片段或本发明的第二方面中的重组蛋白。
在第四方面，提供了一种载体，所述载体包含所述分离的核酸，所述分离的核酸编码第一方面中的抗体或抗原结合片段或本发明的第二方面中的重组蛋白。
在优选实施方案中，所述载体包括细菌质粒，噬菌体，酵母质粒，植物细胞病毒，哺乳动物细胞病毒诸如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒，或其他载体。
在第五方面，提供了一种抗体缀合物，所述抗体缀合物包含：
(i)选自本发明的第一方面中的抗体或其抗原结合片段或本发明的第二方面中的重组蛋白或它们的组合的抗体部分；和
(ii)与所述抗体部分偶联的偶联部分，其中所述偶联部分选自可检测标签、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶或其组合。
在优选例子中，所述抗体部分和所述偶联部分通过化学键或接头偶联。
在第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)第一方面中的抗体或其抗原结合片段、第二方面中的重组蛋白、第三方面中的分离的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四方面中的载体、第五方面中的抗体缀合物或它们的组合，和(ii)药学上可接受的载剂。
在优选实施方案中，所述抗体具有去除肿瘤浸润性Treg细胞的作用。
在第七方面，提供了一种用于治疗由CCR8和/或CCLl介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的第一方面中的抗体或其抗原结合片段、第二方面中的重组蛋白、第三方面中的分离的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四方面中的载体、第五方面中的抗体缀合物或第七方面中的药物组合物或它们的组合施用给有需要的受试者；或第一方面中的抗体或其抗原结合片段、第二方面中的重组蛋白、第三方面中的分离的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四方面中的载体、第五方面中的抗体缀合物或第七方面中的药物组合物或它们的组合在制造用于治疗由CCR8和/或CCLl介导的疾病的药物中的用途；或用于在治疗由CCR8和/或CCLl介导的疾病中使用的第一方面中的抗体或其抗原结合片段、第二方面中的重组蛋白、第三方面中的分离的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四方面中的载体、第五方面中的抗体缀合物或第七方面中的药物组合物或它们的组合。
在优选实施方案中，所述由CCR8和/或CCLl介导的疾病是癌症。
在一个特别优选的实施方案中，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌或胰腺癌。
在一个优选实施方案中，所述疾病与异常CCL1/CCR8轴相关。
在一个特别优选的实施方案中，所述与异常CCL1/CCR8轴相关的疾病是神经性疼痛。
在一个特别优选的实施方案中，所述神经性疼痛是由糖尿病或脊髓损伤诱发的。
在一个特别优选的实施方案中，所述疾病是IgG4相关疾病。
在一个特别优选的实施方案中，所述IgG4相关疾病是硬化性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、嗜酸性血管中心纤维化、纤维化纵隔炎、肥厚性硬脑膜炎、伴有广泛肾小管间质沉积的特发性低补体血症性肾小管间质性肾炎、炎性主动脉瘤、炎性假瘤、Küttner肿瘤(慢性硬化性涎腺炎)、纵隔纤维化、米库利兹综合征、多灶性纤维硬化、主动脉周炎和动脉周炎、腹膜后纤维化(奥蒙德病)、里德尔氏甲状腺炎、硬化性肠系膜炎或硬化性胰腺炎。
在第八方面，提供了一种确定受试者的CCR8水平的方法，所述方法包括(a)从所述受试者获得样品；(b)使所述样品与本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)确定所述受试者的CCR8水平。
优选地，所述样品是组织样品或血液样品，并且所述组织样品可以是癌组织样品。
在第九方面，提供了活性成分用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备用以预防和/或治疗与CCR8相关的疾病的药物的用途，其中所述活性成分选自第一方面中的抗体或其抗原结合片段、第二方面中的重组蛋白、第三方面中的分离的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四方面中的载体、第五方面中的抗体缀合物以及它们的组合。
在优选实施方案中，所述诊断试剂是测试条或测试板。
在优选实施方案中，所述与CCR8相关的疾病包括癌症。
在一个特别优选的实施方案中，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌或胰腺癌。
在优选实施方案中，所述诊断试剂或试剂盒用于：
(i)检测样品中的CCR8蛋白；和/或
(ii)检测脊髓神经元中的内源性CCR8蛋白；和/或
(iii)检测表达CCR8蛋白的调节性T淋巴细胞。
在优选实施方案中，所述抗体呈抗体-药物缀合物(ADC)的形式。
在第十方面，提供了一种用于体外检测(包括诊断性或非诊断性检测)样品中的CCR8蛋白的方法，所述方法包括：
(i)使所述样品在体外与本发明的第一方面中的抗体接触；以及
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中所述复合物的形成表明所述样品中存在CCR8蛋白。
在第十一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)含有本发明的抗体作为一抗的第一容器；和
(ii)含有抗本发明的一抗的二抗的第二容器。
在第十三方面，提供了一种用于制备重组多肽的方法，所述方法包括：
(i)在适合表达的条件下培养本发明的第五方面中的工程化宿主细胞；以及
(ii)从所述培养物中分离重组多肽，其中所述重组多肽是第一方面中的抗体或其抗原结合片段或第二方面中的重组蛋白。
附图说明
图1A和1B描绘了在克隆103G4、118H1、101E4、84B4、170G6、172E7、2P15、3C11、3O20、4M13、2L15、4D24、1G17、3F11、3F6和4G19的FACS结合分析中，抗体对过表达CCR8的293F细胞(293F-CCR8)具有结合能力；图1C和1D描绘了在一些克隆的FACS结合分析中，抗体不与亲本293F细胞结合。
图2A、2B、2C、2D和2E分别示出了抗CCR8抗体(即，抗体克隆84B4、101E4、170G6、3C11、2P15)在MDA-MB-231异种移植中的抗肿瘤功效的结果。
图3示出了3F11hz4和3F11对小鼠CCR8 CHOK1的结合亲和力的结果。
图4A、4B、4C、4D和4E分别示出了在使用293T细胞系和CHOK1细胞系的FACS结合分析中，抗体3F11hz4对过表达人CCR8的293T细胞(人CCR8-293T)、过表达大鼠CCR8的293T细胞(大鼠CCR8-293T)、过表达狗CCR8的293T细胞(狗CCR8-293T)、过表达小鼠CCR8的CHOK1细胞(小鼠CCR8-CHOK1)和过表达猕猴CCR8的293T细胞(猕猴CCR8-293T)具有结合能力。
图5A和5B示出了3F11hz4对突变体CCR8 293T的结合亲和力。
图6A和6B示出了3F11hz4对hCCR4 293T和hCX3CR1 293T的结合亲和力的结果。
图7示出了3F11hz4抗体对HCC827肺癌皮下肿瘤(CD34人源化模型)的抗肿瘤功效。
图8示出了3F11hz4抗体对H22肝癌皮下肿瘤(同基因模型)的抗肿瘤功效。
图9示出了3F11hz4抗体对LLC肺癌皮下肿瘤(同基因模型)的抗肿瘤功效。
图10示出了Treg细胞的迁移测试。
具体实施方式
经过广泛深入的研究，诸位发明人意外获得了一组具有全新氨基酸序列的全人CCR8抗体。本发明的CCR8抗体与CCR8蛋白具有出色的高亲和力，因此可用于治疗CCR8相关疾病，诸如同种免疫疾病、自身免疫性疾病、过敏、炎性疾病、肿瘤、神经性疼痛或IgG4相关疾病。已经在此基础上完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有如说明书中阐述的含义。
必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。
除非另外陈述，否则任何数值(诸如本文所述的浓度或浓度范围)都应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值通常包括列举值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括此类范围内的整数和所述值的分数。
除非另外指示，否则在一系列要素之前的术语“至少”应被理解为是指所述系列中的每个要素。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在被本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”或其任何其他变型将被理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但是不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含一系列要素的组合物、混合物、过程、方法、物品或设备不一定仅限于那些要素，而是可以包括其他未明确列出或这种组合物、混合物、过程、方法、物品或设备所固有的要素。此外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而不是排他性的或。例如，条件A或B满足以下中的任一种：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)并且B为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。
如本文所用，多个列举要素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独和组合选项两者。例如，在两个要素通过“和/或”连接的情况下，第一选项是指第一要素适用而第二要素不适用。第二选项是指第二要素适用而第一要素不适用。第三选项是指第一要素和第二要素一起适用。这些选项中的任一个都被理解为落入所述含义内，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。所述选项中的多于一个同时适用也被理解为落入所述含义内，因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，如在整个说明书和权利要求书中所用的术语“由……组成(consistsof)”或变型诸如“由……组成(consist of)”或“由……组成(consisting of)”指示包括任何列举的整数或整数组，但是没有另外的整数或整数组可以添加到指定方法、结构或组合物中。
如本文所用，如在整个说明书和权利要求书中所用的术语“基本上由……组成(consists essentially of)”或变型诸如“基本上由……组成(consist essentiallyof)”或“基本上由……组成(consisting essentially of)”指示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质性改变指定方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“受试者”意指任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选人。
词语“右”、“左”、“下”和“上”表示参考的附图中的方向。
还应当理解，本文所用的术语“约”、“大约”、“大体上”、“基本上”和类似术语在指代优选发明的部件的尺寸或特征时指示所描述的尺寸/特征不是严格的边界或参数，并且不排除功能相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的。至少，包括数字参数的此类指代将包括使用本领域接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字的变化。
在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，抗CCR8抗体和编码它们的多核苷酸、CCR8多肽和编码它们的CCR8多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指在比较和比对以获得最大对应时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，如使用以下序列比较算法中的一种或通过目视检查所测量的。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与其进行比较。在使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于所指定的程序参数来计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可以进行序列的最佳比对以供比较，例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(威斯康星州麦迪逊科学大道575号(575Science Dr.)的Genetics Computer Group的威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过目视检查(一般参见Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编辑,CurrentProtocols,Greene Publishing Associates,Inc.与John Wiley&Sons,Inc.之间的合资公司,(1995年增刊)(Ausubel))。
适合确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定询问序列中长度W的短字码来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字码在与数据库序列中相同长度的字码比对时匹配或符合某个正值阈值得分T。T被称为相邻字码得分阈值(Altschul等人,同上)。这些初始相邻字码命中用作开始搜索的种子，以发现含有它们的较长HSP。然后沿每个序列在两个方向上延长字码命中，只要可以增加累积比对得分即可。
对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最大达成值下降数量X时；在累积得分由于一个或多个负评分残基比对的积累而变为零或以下时；或在到达任一序列的末端时，停止每个方向上的字码命中延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认设置。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10以及BLOSEIM62评分矩阵作为默认设置(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.ETSA 89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.NatT.Acad.Sci.ETSA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性量度是最小总和概率(P(N))，它提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则核酸被认为与参考序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的进一步指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性，如下所述。因此，例如，在一个多肽和第二多肽的区别仅在于保守取代的情况下，这两个肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。
如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有如下常识，即核酸是多核苷酸，多核苷酸可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段(即，使用普通克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列)和通过合成手段。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体的短链以及在本领域中通常称为蛋白质的有许多类型的长链。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用的术语“抗原结合片段”是指含有与目标抗原结合的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段，在本文所述的特别优选的实施方案中，所述抗原是C-C基序趋化因子受体8(CCR8)。在这方面，本文所述的抗体的抗原结合片段可以包含来自结合CCR8的抗体的本文阐述的VH和/或VL序列的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个CDR。本文所述的CCR8特异性抗体的抗原结合片段能够与CCR8结合。在其他实施方案中，抗原结合片段的结合防止或抑制一种或多种CCR8配体与CCR8受体的结合，从而中断原本将由配体与受体结合引起的生物学反应。在某些实施方案中，抗原结合片段与CCR8特异性结合和/或抑制或调节CCR8的生物学活性。
术语“抗原”是指如下分子或分子的一部分，其能够被选择性结合剂(诸如抗体)结合并且另外能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何决定簇，优选多肽决定簇。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，说所述抗体特异性结合抗原。根据某些实施方案，在抗体-抗原结合的平衡解离常数小于或等于10-6M或小于或等于10-7M或小于或等于10-8M时，可以说抗体特异性结合抗原。在一些实施方案中，平衡解离常数可以小于或等于10- 9M或小于或等于10-10M。
使用术语“载体”来指代用于将编码信息转移到宿主细胞中的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适合转化宿主细胞并且含有指导和/或控制插入的异源核酸序列的表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于诸如转录、翻译和RNA剪接(如果存在内含子的话)等过程。
C-C基序趋化因子受体8(CCR8)
CCR8(以前也称为Cy6、CKR-L1或TER1)是一种在胸腺、脾脏等中表达的G蛋白偶联的7次跨膜CC趋化因子受体蛋白。编码该蛋白质的基因位于人类染色体3p21上。人CCR8由355个氨基酸组成。已知CCL1是CCR8的内源性配体。人CCR8 cDNA由GenBank ACC编号M_005201.3表示的核苷酸序列构成，并且小鼠CCR8 cDNA由GenBank ACC编号NM_007720.2表示的核苷酸序列构成。
本发明的CCR8包括来源于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猪和灵长类哺乳动物(包括猴和人)的那些。人CCR8是优选的。
抗体
本发明总体上涉及分离的抗CCR8抗体、编码所述抗体的核酸和表达载体、含有所述载体的重组细胞以及包含所述抗体的组合物。还提供了制备所述抗体的方法以及使用所述抗体治疗包括癌症在内的疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种期望的功能特性，包括但不限于与CCR8的高亲和力结合、对CCR8的高特异性以及当单独施用或与其他抗癌疗法组合施用时在有需要的受试者和动物模型中抑制肿瘤生长的能力。
在一个一般方面，本发明涉及特异性结合CCR8的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”在广义上使用并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括单克隆或多克隆的人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及抗体片段。一般来讲，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是熟知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，免疫球蛋白可以被归为五个主要类别(即，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG被进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以属于五种主要类别或相应亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。基于恒定结构域的氨基酸序列，脊椎动物物种的抗体轻链可以被归为两种明显不同的类型(即κ和λ)中的一种。因此，本发明的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构域。根据特定实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，所述轻链可变区和重链可变区各自含有三个结构域(即，互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域可替代地被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且重链可变区结构域可替代地被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与CCR8特异性结合的分离的抗体基本上不含不与CCR8结合的抗体)。另外，分离的抗体基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的各个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变外。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组DNA方法来制备。例如，单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(诸如转基因小鼠或大鼠)获得的B细胞。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如像双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv1)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体部分形成的多特异性抗体、驼源化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段所结合的相同抗原结合。根据实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd区段。根据其他实施方案，抗原结合片段包括Fab和F(ab')。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域的常规单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单结构域抗体”是指本领域的常规单结构域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指如下非人抗体，其经过修饰以增加与人抗体的序列同源性，使得保留抗体的抗原结合特性，但是其在人体内的抗原性降低。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链的可变区通常都对应于来源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区对应于来源于另一个哺乳动物物种(例如，人)的抗体的序列，以避免在该物种中引发免疫反应。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚蛋白的不同亚基))上。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两种抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚蛋白的不同亚基))上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方案中，第一表位位于CCR8上，并且第二表位位于PD-l、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD47、CD73、爱帕琳肽(apelin)、DLL3、密封蛋白l8.2、TIP-l、CD3和/或其他肿瘤相关免疫抑制因子或表面抗原上。
如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”意指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体也可以与来自一个或多个物种的该抗原结合。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个例子中，与抗原特异性结合的抗体也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binding)”可以用于指代抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以意味着所述相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合至特定蛋白质结构，而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A(或游离的未标记的A)的分子的存在将减少与所述抗体结合的标记的A的量。
在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括分别插入在重链与轻链框架区(FR)组之间的重链和轻链CDR组，所述框架区为CDR提供支持并限定CDR相对于彼此的空间关系。如本文所用，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包括来自重链和轻链V区各自的CDR集。包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。对许多抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明，CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛的接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
如本文所用，术语“FR组”是指作为重链或轻链V区的CDR组的CDR的框架的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，特别是直接与CDR相邻的FR残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列都含有约90个氨基酸残基的内部二硫化物环。在V区折叠成结合位点时，CDR显示为形成抗原结合表面的突出环基序。通常公认的是，存在FR的保守结构区，其影响CDR环折叠形状成某些“典范”结构，而不管精确的CDR氨基酸序列如何。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链和轻链的相互作用的非共价结构域间接触。
免疫球蛋白可变区的结构和位置可以通过参考以下来确定：Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,USDepartment of Healthand Human Services,1987及其更新版(现在可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得)，Chothia、AbM和IMGT(参见例如Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997)ImMunoGenTics(IMGT)numbering(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。抗原结合位点的定义还描述于以下文献中：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121-153(1991)；和Rees等人,SternbergM.J.E.(编辑),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。例如，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基被编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基被编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基被编号为大约26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基被编号为大约27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据Kabat编号)。根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align来确定抗体的CDR区。除非另外指定，否则根据IMGT编号方案确定本文公开的CDR和框架区的位置。
如本文所用的“抗体重链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中的较大者。来自任何脊椎动物物种的重链都可以被归为五种不同类别(或同种型)中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别也分别被指定为α、δ、ε、γ和μ。基于序列和功能的差异，IgG和IgA类别被进一步分为亚类。人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
如本文所用的“抗体轻链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用的术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由如本文所述的噬菌体表达的抗体。所述术语还应当被解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子(并且所述DNA分子表达抗体蛋白)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用本领域可用且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
本发明的抗体可以在其N末端或C末端与另外的蛋白质融合(Clinical CancerResearch,2004,10,1274-1281)。待融合的蛋白质可以由本领域技术人员适当地选择。
在优选实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的多肽序列选自：
1.SEQ ID NO:2、3、4、6、7和8；或
2.SEQ ID NO:2、3、10、12、7和14；或
3.SEQ ID NO:2、16、17、19、7和14；或
4.SEQ ID NO:22、23、24、26、20和27；或
5.SEQ ID NO:22、23、24、30、20和27；或
6.SEQ ID NO:32、33、34、36、37和38；或
7.SEQ ID NO:40、41、42、44、37和45；或
8.SEQ ID NO:47、48、49、51、52和53；或
9.SEQ ID NO:40、3、55、6、7和8；或
10.SEQ ID NO:58、59、60、6、7和14；或
11.SEQ ID NO:58、3、63、65、7和14；或
12.SEQ ID NO:2、3、67、69、70和13；或
13.SEQ ID NO:72、73、74、76、37和77；或
14.SEQ ID NO:58、79、80、6、7和14；或
15.SEQ ID NO:58、83、84、86、7和14；或
16.SEQ ID NO:58、83、88、86、7和14，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR8、优选人CCR8，
其中根据IMGT编号方案确定CDR的位置。
根据另一个特定方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:1、9、15、21、28、31、39、46、54、57、62、66、71、78、82、87、90、92、94、96、100、102、104、106、108或110中的一个至少85％、优选90％、更优选95％或更多(诸如95％、96％、97％、98％或99％)相同的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO:5、11、18、25、29、35、43、50、56、61、64、68、75、81、85、89、91、93、95、97、98、99、101、103、105、107、109或111中的一个至少85％、优选90％、更优选95％或更多(诸如95％、96％、97％、98％或99％)相同的多肽序列的轻链可变区。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守变体，保守变体意指与本发明的抗体的氨基酸序列相比，有最多10个、优选最多8个、更优选最多至5个、最优选最多3个氨基酸被具有相似或相似特性的氨基酸替换以形成多肽。优选地通过根据表A的氨基酸取代产生这些保守变体多肽。
表A
本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员将理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下改变(例如，替换、缺失、插入等)蛋白质的编码序列。因此，本领域技术人员将理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
多核苷酸、载体、宿主细胞和制备方法
本发明还提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码本文公开的任何一种抗体。在一些实施方案中，本文公开了编码与CCR8结合的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或抗体片段包含具有SEQ ID NO:58、79和80中所示的氨基酸序列的三个轻链CDR；和/或具有SEQ ID NO:6、7和14中所示的氨基酸序列的三个重链CDR。在一些实施方案中，本文公开了编码与CCR8结合的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或抗体片段包含具有SEQ ID NO:58、79和80中所示的氨基酸序列的三个轻链CDR；和具有SEQ ID NO:6、7和14中所示的氨基酸序列的三个重链CDR。在一些实施方案中，本文公开了编码与CCR8结合的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或抗体片段包含具有选自以下的多肽序列的重链可变区和轻链可变区：SEQ ID NO:96和97；SEQ ID NO:78和81；SEQ ID NO:90和91；SEQ ID NO:92和93；SEQ ID NO:94和95；SEQ ID NO:92和98；或SEQ ID NO:92和99。
本发明还提供了载体，所述载体包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。可以使用本领域技术人员鉴于本公开文本已知的任何载体，诸如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可以包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够将核酸递送至细胞的许多表达载体是本领域已知的并且可以在本文中用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可以用于产生根据本发明的实施方案的重组表达载体。此类技术是本领域技术人员鉴于本公开文本熟知的。
本发明还提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。本领域技术人员鉴于本公开文本已知的任何宿主细胞都可以用于本发明的抗体或其抗原结合片段的重组表达。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44细胞、293F细胞、CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据实施方案，通过常规方法(诸如化学转染、热激或电穿孔)将重组表达载体转化到宿主细胞中，在所述宿主细胞中，它被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得有效表达重组核酸。
本发明还提供了产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或细胞培养物(例如，从上清液)中回收所述抗体或其抗原结合片段。可以从细胞中收获表达的抗体或其抗原结合片段，并且根据本领域已知的常规技术且如本文所述进行纯化。
如本领域技术人员将理解的，多核苷酸可以包括表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等的基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及较小工程化基因区段。此类区段可以是天然分离的或由技术人员合成修饰。
如技术人员也将认识到的，多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包括含有内含子并以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子和不含有内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于根据本公开文本的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其他分子和/或支持材料连接。多核苷酸可以包含天然序列或可以包含编码这样的序列的变体或衍生物的序列。
通常，多核苷酸变体将含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地使得由变体多核苷酸编码的抗体的结合亲和力相对于由本文具体阐述的多核苷酸序列编码的抗体基本上不减弱。
本文所述的多核苷酸或其片段(无论编码序列本身的长度如何)可以与其他DNA序列(诸如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等)组合，使得它们的总长度可能相差很大。因此，预期可以采用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受到制备和在预期的重组DNA方案中使用的容易性的限制。例如，预期总长度为约10000、约5000、约3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有中间长度)的说明性多核苷酸区段是有用的。
位点特异性诱变允许通过如下方式来产生突变体：使用编码所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸，以提供大小和序列复杂性足够的引物序列，从而在被穿过的缺失连接的两侧形成稳定的双链体。可以在所选择的多核苷酸序列中采用突变以改善、改变、减少、修饰或以其他方式改动多核苷酸本身的特性，和/或改变编码的多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是指非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应。在优选实施方案中，此类细胞是人细胞。虽然不希望限于任何特定的作用机制，但这些介导ADCC的细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)中。为了评估分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和NK细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如，在动物模型中，诸如Clynes等人,PNAS(USA),95:652-656(1998)中公开的动物模型)评估目标分子的ADCC活性。
“效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。在优选实施方案中，效应细胞是人细胞。
使用术语“Fc受体”或“FcR”来描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在其胞质结构域方面不同的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetech和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods,4:25-34(1994)；和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来要鉴定的那些。所述术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人,Immunol.,117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.,24:249(1994))。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
补体依赖性细胞毒性(CDC)是指分子在补体的存在下启动补体激活和裂解靶标的能力。通过使补体系统的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如，抗体)结合来启动补体激活途径。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如如Gazzano-Santaro等人,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
抗体-药物缀合物(ADC)
本发明还提供了基于根据本发明的抗体的抗体-药物缀合物(ADC)。
通常，抗体-药物缀合物包含抗体和效应分子，其中所述抗体与所述效应分子缀合，并且化学缀合是优选的。优选地，效应分子是治疗活性药物。另外，效应分子可以是毒性蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
根据本发明的抗体和效应分子可以通过偶联剂偶联。偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链和利用二硫键的偶联剂中的任何一种或多种。非选择性偶联剂是指使效应分子与抗体之间经由共价键连接的化合物，诸如戊二醛等。利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐偶联剂(诸如顺乌头酸酐)和酰腙偶联剂(偶联位点为酰腙)中的任何一种或多种。
使用抗体上的某些残基(诸如Cys或Lys等)来连接多种官能团，包括显像剂(诸如发色团和荧光团)、诊断剂(诸如MRI造影剂和放射性同位素)、稳定剂(诸如聚(乙二醇))和治疗剂。抗体可以与功能剂缀合以形成抗体-功能剂的缀合物。功能剂(例如，药物、检测试剂、稳定剂)与抗体缀合(共价连接)。功能剂可以直接或经由接头间接与抗体连接。
抗体可以与药物缀合以形成抗体-药物缀合物(ADC)。通常，ADC包含药物与抗体之间的接头。接头可以是可降解或不可降解接头。通常，可降解接头在细胞内环境中容易降解，例如，接头在靶位点处降解，从而从抗体中释放药物。合适的可降解接头包括例如酶可降解接头，包括可以被细胞中的蛋白酶(例如，溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)降解的含肽基接头；或糖接头，例如可以被葡糖醛酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括例如二肽，诸如缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸或缬氨酸-丙氨酸。其他合适的可降解接头包括例如pH敏感接头(例如，在低于5.5的pH下水解的接头，诸如腙接头)和在还原条件下降解的接头(例如，二硫键接头)。不可降解接头通常在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
在连接到抗体之前，接头具有能够与某些氨基酸残基反应的反应基团，并且通过反应基团实现连接。硫醇特异性反应基团是优选的，其包括例如马来酰亚胺化合物、卤化(例如，碘、溴或氯取代)酰胺、卤化(例如，碘、溴或氯取代)酯、卤化(例如，碘、溴或氯取代)甲基酮、苄基卤化物(例如，碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、汞衍生物(诸如3,6-二-(汞甲基)二噁烷，其中抗衡离子为CH3COO-、Cl-或NO3 -)和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括例如经由硫代琥珀酰亚胺与抗体连接的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制药物。在一个实施方案中，抗体经由接头与药物连接，并且药物具有可以与接头形成键的官能团。例如，药物可以具有可与接头形成键的氨基、羧基、硫醇基、羟基或酮基。在药物直接与接头连接时，药物在与抗体连接之前具有反应基团。
有用的药物包括例如抗微管蛋白药物、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂、抗生素、叶酸拮抗剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物的例子包括例如DNA小沟结合剂、DNA烷化剂和微管蛋白抑制剂；典型的细胞毒性药物包括例如澳瑞他汀(auristatin)、喜树碱、多卡霉素(docamycin/duocarmycin)、依托泊苷、美登素和美登素类化合物(例如，DM1和DM4)、紫杉烷、苯二氮卓或含有苯二氮卓的药物(例如，吡咯并[1,4]苯二氮卓(PBD)、吲哚啉并苯二氮卓(indolinobenzodiazepine)和噁唑烷并苯二氮卓(oxazolidinobenzodiazepine))和长春花生物碱。
在本发明中，药物-接头可以用于在简单的步骤过程中形成ADC。在其他实施方案中，双功能接头化合物可以用于在两步或多步过程中形成ADC。例如，在第一步骤中使半胱氨酸残基与接头的反应部分反应，然后在随后的步骤中使接头上的官能团与药物反应，从而形成ADC。
一般来讲，这样选择接头上的官能团使得其可以与药物部分上的合适反应基团特异性反应。作为非限制性例子，基于叠氮化物的部分可以用于与药物部分上的反应炔基特异性反应。药物通过叠氮化物与炔基之间的1,3-偶极环加成与接头共价结合。其他有用的官能团包括例如酮和醛(适合与酰肼和烷氧基胺反应)；膦类化合物(适合与叠氮化物反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺和醇反应)；和活化酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺和醇反应)。这些和其他连接策略(例如，描述于Bioconjugation Technology(第2版(Elsevier))中的那些)是本领域技术人员熟知的。本领域技术人员可以理解，在选择互补对的反应官能团用于药物部分与接头之间的选择性反应时，互补对的每个成员都可以用于接头，并且也可以用于药物。
本发明进一步提供了用于制备ADC的方法，所述方法可以进一步包括：在足以形成抗体-药物缀合物(ADC)的条件下，使抗体与药物-接头化合物结合。
在某些实施方案中，根据本发明的方法包括：在足以形成抗体-接头缀合物的条件下，使抗体与双功能接头化合物结合。在这些实施方案中，根据本发明的方法进一步包括：在足以经由接头将药物部分与抗体共价连接的条件下，使抗体-接头缀合物与药物部分结合。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物(ADC)具有如下的式：
Ab-(LU-D)p
其中：
Ab是抗体；
LU是接头；
D是药物；
并且下标p是选自1至8的值。
药物组合物和其他用途
CCL1/CCR8信号传导是包括癌症、炎性疾病和糖尿病性神经病等在内的几种疾病的发病机制中的重要途径。特别地，本文所述的抗体以出乎意料的高亲和力与CCR8特异性结合并且在某些实施方案中具有阻断CCR8信号传导的能力，从而抑制CCLl诱导的趋化性。已知CCR8+Treg细胞对肿瘤逃逸机制有益。在一些方面，本文提供了通过抑制由CCR8+Treg细胞等介导的免疫抑制来降低受试者体内存在的肿瘤中肿瘤浸润性调节性T细胞(TITR)的数量或活性的方法，并且提供了用于经由这种机制治疗癌症的药物组合物。这样的癌症包括但不限于与预后不良相关的乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌和许多其他癌症类型。在一些方面，本文提供了通过向受试者施用抗CCR8抗体来增加受试者肿瘤中T效应细胞的量的方法。细胞毒性可以是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。药剂可以是抗体(例如，肽)小分子、蛋白质药物缀合物或干扰核酸。另外，本发明还可以调节CCL1/CCR8轴，从而可能治疗诸如糖尿病性神经病、脊髓损伤和IgG4相关疾病(诸如硬化性胆管炎(ISC))等疾病。说明性抗体或其抗原结合片段或它们的互补决定区(CDR)的氨基酸序列。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂。如本文所用的术语“药物组合物”意指包含本发明的活性成分以及药学上可接受的载剂的产品，其中活性成分选自：第一方面中的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二方面中的重组蛋白、第三方面中的分离的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四方面中的载体、第六方面中的抗体缀合物、第七方面中的免疫细胞或它们的组合。本发明的活性成分和包含它们的组合物还可用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。
如本文所用的术语“治疗”疾病是指降低受试者所经历的疾病或障碍的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
所施用的量将取决于诸如待治疗的疾病或适应证的类型和程度、患者的整体健康状况、抗体的体内效力、药物配制品、抗体的血清半衰期和施用途径等变量。
施用频率可以根据诸如施用途径、剂量量、抗体或融合蛋白的血清半衰期和所治疗的疾病等因素而变化。
在一些实施方案中，本发明的抗体用于非治疗目的，诸如诊断测试和测定。例如，抗体可用于确定来自受试者的样品中的CCR8水平。提供了通过使样品与本发明的CCR8特异性抗体接触并检测样品中抗体与CCR8之间的免疫反应性的方法。
检测应用和试剂盒
根据本发明的抗体或其ADC可以用于检测应用中，例如用于在检测样品中使用以提供诊断信息。
在本发明中，所使用的标本(样品)包括细胞、组织样品和活检标本。在本发明中使用的术语“活检”应当包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此，在本发明中使用的活检标本可以包括例如肿瘤的切除样品以及通过内窥镜方法或器官的穿刺或针穿刺活检制备的组织样品。
在本发明中使用的样品包括固定或保存的细胞或组织样品。
本发明进一步提供了试剂盒，所述试剂盒仅包含根据本发明的抗体(或其片段)；在本发明的一个优选例子中，所述试剂盒进一步包括容器、说明书、缓冲液等。在优选例子中，根据本发明的抗体可以固定在测试板上。
根据本发明的另一方面，通过检测样品中CCR8蛋白的存在或量来诊断受试者的CCR8介导的疾病。
本发明提供了用于预测或诊断癌症预后的试剂盒，所述试剂盒包含抗CCR8抗体。本发明的试剂盒可以进一步包含本领域已知的用于ELISA的工具和/或试剂。如果需要，本发明的试剂盒可以进一步包含用于混合各种组分的管、孔板、描述如何使用的说明手册等。
通过参考以下实施例来进一步描述本发明。应当理解，以下实施例仅用于描述本发明，而不是限制本发明的范围。以下实施例中的未指示具体条件的实验方法通常根据常规条件来进行，所述常规条件例如Sambrook等人,Molecular Cloning:Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件或制造商推荐的条件。除非另外指定，否则百分比和份数是指重量百分比和重量份数。细胞系是市售的或从ATCC购买的常规产品，并且所有质粒都是市售的产品。
细胞系：
293F细胞系从Thermo Fisher(R79007)获得，并且在Expi293 TM表达培养基中培养。
实施例1.抗CCR8单克隆抗体的产生
通过用过表达CCR8的293F细胞免疫SJL小鼠来开发抗CCR8单克隆抗体。简而言之，将293F细胞通过聚凝胺(8μg/mL)用编码CCR8的慢病毒载体转染，在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的培养基中选择，并且通过FACS测试CCR8的表达。选择对CCR8具有最大MFI的单个克隆用于后续研究。
通过标准方法将来自这些小鼠的脾脏和淋巴结细胞与骨髓瘤细胞(SP20)融合以生成产生独特抗体的杂交瘤。通过基于细胞的ELISA测试含有由这些细胞池产生的抗体的上清液与过表达CCR8的细胞的反应性。基于细胞的ELISA总体上如下进行。在96孔板中每个孔接种大约3×104个293F-CCR8细胞，并且在过夜培养后，将细胞用1×PBS-T洗涤，之后添加100μL 4％多聚甲醛溶液以将细胞固定并交联到微孔板上。将细胞用1×PBS-T洗涤两次。然后将细胞与取自杂交瘤培养物(包括空白和阳性对照)的纯上清液在37℃下一起孵育60分钟。随后，将细胞用1×PBS-T洗涤四次。然后将细胞与山羊抗小鼠IgG二抗(在100μL PBS中的1:10000稀释液)在37℃下一起孵育60分钟，之后用1×PBS-T洗涤四次。将100μL TMB添加到96孔板中。在孵育10-12分钟后，在450nm波长下扫描并检测板。
然后通过荧光激活细胞分选(FACS)确认这些阳性克隆的上清液。FACS分析总体上如下进行。每个样品制备大约5×105个293F-CCR8细胞，并且将其用小鼠BD Fc Block封闭。将细胞分配到96孔圆底聚苯乙烯板中，并且与取自杂交瘤培养物的纯上清液在冰上一起孵育20-30分钟。接下来，将细胞用PBS/0.5％ BSA洗涤并离心。然后将沉淀的细胞样品与用FITC标记的抗小鼠IgG的二抗(在100μL PBS/0.5％ BSA中的1:300稀释液)在冰上一起孵育30分钟，然后用PBS/0.5％ BSA洗涤并离心。将细胞沉淀重新悬浮于PBS/0.5％ BSA中，并且在CYTOFLEX(Beckman)上分析样品。通常，对未转染的亲本细胞的相同上清液进行测试，以确认反应抗体特异性识别CCR8。
鉴定阳性池并通过有限稀释进行亚克隆。在三次融合后，获得产生独特抗体的九个克隆，所述抗体通过FACS测得特异性识别CCR8过表达细胞，它们是：101E4、172E7、103G4、118H1、170G6、84B4、2P15、3C11、3O20、4M13、2L15、4D24、1G17、3F11、3F6和4G19。杂交瘤以与从中产生的抗体相同的名称提及(例如，杂交瘤84B4产生抗体84B4)。所有抗CCR8抗体克隆都具有高亲和力抗体，它们的VH和VL的氨基酸序列示于表1中。
表1.克隆C3、G3和G6的抗CCR8抗体的氨基酸序列(其中CDR(包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)加下划线并且基于IMGT编号方案)。
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表2.抗体的VH、VL和CDR的序列ID。
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实施例2.抗CCR8抗体对表达CCR8的细胞的结合亲和力
通过FACS评价抗CCR8抗体的亲和力。将293F-CCR8(其具有在细胞表面上表达的高水平CCR8)用于结合测试中。亲和力分析总体上如下进行。每个样品制备大约5×105个293F-CCR8细胞，并且将其用人BD Fc Block封闭。将测试抗体用PBS/0.5％ BSA稀释(从225μg/mL至0.00381μg/mL的1:3系列稀释液)。将转染的细胞与未转染的亲本细胞一起分配到96孔圆底聚苯乙烯板中，并且与稀释的抗体在冰上一起孵育20-30分钟。接下来，将样品用PBS/0.5％ BSA洗涤，并且将细胞离心。将沉淀的细胞样品与抗小鼠IgG-FITC的二抗(在100μL PBS/0.5％ BSA中的1:300稀释液)在冰上一起孵育30分钟，然后用PBS/0.5％BSA洗涤，之后沉淀细胞。将细胞沉淀重新悬浮于PBS/0.5％ BSA中用于读数，并且使用CYTOFLEX(Beckman)分析样品。
结果显示，这些抗体与过表达人CCR8的293F细胞结合，但是不与没有CCR8过表达的细胞结合，如图1所示。图1A和1B证明这些抗体对过表达CCR8的293F细胞(293F-CCR8)具有结合能力，但是对293F亲本细胞没有结合能力(图1C和1D)。显示出结合能力的克隆的EC50总结于表3中：
表3：显示出结合能力的克隆的EC50
克隆 103G4 118H1 101E4 84B4 170G6 172E7 2P15 3C11
EC50(nM) 20.56 0.4664 0.4088 0.195 0.3021 6.989 0.3052 4.254
克隆 3O20 4M13 2L15 4D24 1G17 3F11 3F6 4G19
EC50(nM) 1.293 0.775 0.8257 0.888 2.939 0.9572 2.293 4.487
实施例3.抗CCR8抗体阻断CCL1-CCR8信号
为了确定上述哪些抗体可以阻断CCL1-CCR8信号，构建Tango-CCR8-Gal4-CHO-K1细胞。将细胞沉淀并且以1×104个细胞/70μL/孔重新悬浮，将细胞分配到96孔板中，在饥饿培养基(F12K、1％ FBS、1％青霉素-链霉素)中在5％ CO2中在37℃下孵育6小时，添加测试抗体并且孵育1小时，然后添加CCL1(R&D，目录号：272-I)并且在5％ CO2中在37℃下孵育24小时。
在过夜培养后，将细胞与ONE-Glo工作试剂在室温下避光孵育10分钟，然后使用微孔板发光读数器在560nm下测量每个样品的相对发光单位(RLU)并进行记录。
来自克隆(诸如101E4、170G6、3O20、4M13、4D24、3F11、3F6)的抗体显示出强烈的CCL1-CCR8信号传导阻断。来自每个克隆的抗体的信号阻断能力示于表4中。
表4：抗体的Tango测定结果。
实施例4.抗CCR8抗体的抗肿瘤功效测试
在用人外周血单个核细胞(hu-PBMC，Milestone Biotechnologies)重构的人源化小鼠中评价体内抗肿瘤功效。为了促进研究，建立MDA-MB-231小鼠异种移植模型。将人乳腺癌MDA-MB-231细胞(5×106/小鼠)皮下接种到雌性NCG小鼠前方右侧背部的皮肤中。在移植肿瘤的平均大小达到80-100mm3时，选择肿瘤大小相近的荷瘤小鼠，并且随机分组，并且经尾静脉注射2×106个来源于健康供体的hu-PBMC。一小时后，每周一次将CCR8抗体腹膜内注射到小鼠体内。每周两次用卡尺测量肿瘤大小，并且肿瘤大小按体积(mm3)表示，且公式为：V＝0.5a×b2。(a和b分别表示肿瘤的长径和短径)。如图2(A-E)所示，来自克隆84B4、101E4、170G6、3C11和2P15的抗体具有显著的抗肿瘤作用，其中P≤0.001。
结果示于图2中。根据肿瘤生长曲线，与媒介物治疗组相比，注射抗CCR8抗体的小鼠组的肿瘤生长显著受到抑制(P<0.001)。
实施例5.抗CCR8抗体与猕猴CCR8的结合能力
将293F细胞通过聚凝胺(8μg/mL)用编码猕猴CCR8的慢病毒载体转染，在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的培养基中选择，并且通过FACS测试猕猴CCR8的表达。
使用过表达猕猴CCR8的293F细胞系和亲本293F细胞系通过流式细胞术研究抗体与猕猴CCR8的特异性结合。结果显示，抗体84B4、170G6、172E7、3C11、3O20、1G17、3F11和4G19结合表达猕猴CCR8的293F细胞，但是不结合293F细胞。
实施例6.抗体3F11、3O20和1G17的人源化
通过将先导抗体的CDR移植到所选择的人IgG种系框架中使抗体3F11、3O20和1G17人源化。基于两个框架(FR)内的序列相似性选择人种系IGHV3-73*01、IGKV2-28*01、IGHV1-46*01和IGKV2-30*02。为了维持典型的环结构和链界面，将人种系框架中的某些残基回复突变为相应的小鼠残基(表5)。
计算机预测暗示3F11的CDR中存在高风险序列易感性。例如，3F11的CDR-L1区中存在NG基序。评价轻链中N33位置处的一种易感性突变，以查看是否可以在不影响活性的情况下去除VL中的潜在脱酰胺位点。
3F11、3O20和1G17的人源化产生单克隆抗体3F11hz0、3F11hz1、3F11hz2、3F11hz3、3F11hz4、3F11hz5和3F11hz6；3O20hz0、3O20hz1、3O20hz2和3O20hz3；以及1G17hz0、1G17hz1、1G17hz2和1G17hz3。
表5：3F11、3O20和1G17的人源化
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所有优化的抗体都被证实与表达人CCR8的293F结合。抗体3F11、3O20和1G17的人源化形式的亲和力常数示于表6中。3F11hz4、3O20hz2、1G17hz3的亲和力与嵌合抗体(诸如3F11hz0、3O20hz0、1G17hz0)相似或比它们更好。
表6.抗CCR8人源化抗体亲和力
然后像实施例5一样通过FACS测试3F11hz4、3O20hz2、1G17hz3是否与小鼠CCR8和猕猴CCR8具有交叉反应性。人源化抗体3F11hz4和3F11与小鼠CCR8结合的亲和力示于图3中。在人源化后，3F11hz4与小鼠CCR8结合的亲和力从681.9nM增加到1.926nM。在人源化后，3O20hz2和1G17hz3与猕猴CCR8结合的亲和力分别为6418nM和3142nM。3O20hz2和1G17hz3显示出较弱的与猕猴CCR8的结合亲和力。
实施例7.人源化抗体的钙动员测定
钙动员测定是一种基于细胞的第二信使测定，用于测量与G蛋白偶联受体激活或抑制相关的钙通量。荧光强度的变化与响应于目标受体的配体激活而释放到细胞质中的细胞内钙的量直接相关。使用所述测定来确定上述哪些人源化抗体可以阻断CCL1-CCR8信号。
在钙动员测定中使用在培养箱中(37℃，5％ CO2)在完全培养基(DMEM培养基、10％FBS、1％青霉素-链霉素、0.75μg/mL嘌呤霉素、400μg/mL G418)中传代的hCCR8-Gqi5-293T细胞(由Genomeditech构建)。
将荧光膜渗透性钙结合染料(FLIPR Calcium 6测定试剂盒)溶解于测定缓冲液(20mM含1*Hank平衡盐溶液(HBSS)的HEPES缓冲液，pH 7.4)中。用含有5mM丙磺舒的染料溶液制备上样缓冲液。将丙磺舒制备成在1N NaOH中的500mM储备溶液，然后在使用前在HBSS缓冲液中稀释至250mM。
将大约1.5*104个hCCR8-Gqi5-293T细胞接种到384孔板中，并且在25μL饥饿培养基(DMEM、1％ FBS、1％青霉素-链霉素)中在5％ CO2中在37℃下孵育16小时。然后，用25μL测定缓冲液完全更换饥饿培养基，并且将25μL上样缓冲液添加到所需孔中。在添加染料后，将细胞板在37℃和5％ CO2下孵育2小时，然后在室温下保存直至使用。将12.5μL测定缓冲液中所需浓度(5×)的化合物添加到每个孔中，并且在室温下与细胞一起孵育30分钟。在孵育后，将微孔板转移到FLIPR仪器中，并且如仪器的用户指南中所述开始钙测定。在测定过程中添加12.5μL含有或不含CCL1的测定缓冲液。将MAX比率值对抗体浓度作图，并且在GraphPad Prism中进行分析以生成浓度曲线。
所有人源化抗体都显示出CCL1-CCR8信号传导阻断，并且3F11hz4显示出最强的CCL1-CCR8信号传导阻断。本文公开的代表性抗体的信号传导阻断能力示于表7中。
表7：人源化抗CCR8抗体的钙动员测定结果。
克隆 钙动员IC50(nM)
3F11hz4 4
3O20hz2 7.39
1G17hz3 25.3
实施例8.人源化抗体稳定性验证
单克隆抗体本质上是蛋白质，并且容易出现不稳定性问题。单克隆抗体的稳定性测试是它们作为治疗性生物分子进行开发和商业化的关键监管要求。在表8所示的应激条件下测试人源化抗体(诸如3F11hz4、3O20hz2、1G17hz3)的稳定性和活性。
表8.稳定性测试项
***5FT是指5个冷冻/解冻循环
以与实施例2和7类似的方式，进行人源化抗体在不同时间点的结合亲和力和钙动员。结果示于表9中。3F11hz4显示出比其他人源化抗体更好的稳定性。
表9：人源化抗体在应激条件下的亲和力EC50和钙动员IC50
实施例9.3F11hz4与293F/CHOK1大鼠、狗、小鼠和猕猴CCR8的交叉反应性
将293F细胞通过聚凝胺(8μg/mL)用编码大鼠和狗CCR8的慢病毒载体转染，在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的培养基中选择，并且通过FACS测试大鼠和狗CCR8的表达。将CHOK1细胞通过聚凝胺(8μg/mL)用编码小鼠CCR8的慢病毒载体转染，在含有嘌呤霉素(6μg/mL)的培养基中选择，并且通过FACS测试小鼠CCR8的表达。
使用过表达人、大鼠、狗、小鼠和猕猴CCR8的293F细胞系或CHOK1细胞系和亲本293F细胞系或CHOK1细胞系，通过流式细胞术研究人源化抗体与人、大鼠、狗、小鼠和猕猴CCR8的特异性结合。
结果示于图4A-4E中。根据结合亲和力，3F11hz4结合表达人(4A)、大鼠(4B)、狗(4C)、小鼠(4D)和猕猴(4E)CCR8的HEK293/CHOK1细胞，但是不结合亲本细胞。
实施例10.人源化单克隆抗体的表位分析
分析人、大鼠、狗、小鼠和猕猴CCR8序列。结果显示，人、大鼠、狗、小鼠和猕猴CCR8的ECD2区相似(表10)。假设3F11hz4人源化抗体与ECD2结合，通过在293F细胞中瞬时表达ECD2的每个突变体并使突变体与人源化3F11hz4抗体的抗体溶液反应来进行结合评价，所述抗体溶液通过从25μg/mL开始进行14次系列稀释3倍制备而来。在4℃下反应1小时后，使其与Alexa Fluor 488亲和纯山羊抗人Ig(H+L)(Jackson，109-545-003)反应，并且进行流式细胞术分析。假设连续稀释液的最高MFI为100％，根据以下公式计算抑制百分比。
抑制％＝(最高MFI-MFI)/最高MFI*100％
结果示于图5A-B和表11中。与人CCR8相比，CCR8中97个氨基酸的突变体可以将EC50从0.2335nM提高到23.96nM。
表10：CCR8基因同源性
表11. 3F11hz4在突变体CCR8中的结合活性
突变体 抑制EC50(nM)
hCCR8(Y94A) 0.3064
hCCR8(L95A) 0.4588
hCCR8(L96A) 0.2796
hCCR8(D97A) 23.96
hCCR8(Q98A) 0.194
hCCR8(V100A) 0.2368
hCCR8(T103A) 0.3114
hCCR8(V104A) 0.3414
hCCR8(M105A) 0.3338
hCCR8(K107A) 0.22
hCCR8 0.2335
实施例11.3F11hz4人源化抗体与人CCR4和人CX3CR1结合的研究
通过流式细胞术测试3F11hz4人源化抗体与过表达CCR4和CX3CR1的细胞的结合。简而言之，将293F细胞通过聚凝胺(8μg/mL)用编码人CCR4和CX3CR1的慢病毒载体转染，在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的培养基中选择，并且使用CCR4(Biolegend，359408)和CX3CR1(Biolegend，341610)抗体通过FACS测试人CCR4和CX3CR1的表达。通过在293F细胞中表达人CCR4和CXCR1并使细胞与人源化3F11hz4抗体的抗体溶液反应来进行结合评价，所述抗体溶液通过从25μg/mL开始进行14次系列稀释3倍制备而来。在4℃下反应1小时后，使其与AlexaFluor 488亲和纯山羊抗人Ig(H+L)(Jackson，109-545-003)反应，并且进行流式细胞术分析。
如图6A-6B所示，人源化3F11hz4抗体结合表达人CCR8的293F细胞(4A)，但是不结合表达人CCR4(6A)、人CX3CR1(6B)的293F细胞或293F细胞(4A)。
实施例12.3F11hz4人源化抗体与其他CCR8抗体比较
研究本文公开的抗体3F11hz4人源化抗体和其他现有技术CCR8抗体的结合亲和力、物种交叉反应性和信号传导阻断。根据相关参考文献产生和表征现有技术CCR8抗体。具体地，通过CHO细胞表达Gilead(WO 2021163064)、Shionogi(EP3903817A1)、Surface(SRF-114)和Bayer(TPP-23411，WO 2021152186)的CCR8抗体序列。通过亲和力(EC50)、物种交叉反应性和钙动员(IC50)比较各种抗体。结果示于表12中。
表12：3F11hz4当前竞争物比较结果
如表12所示，3F11hz4在结合亲和力、物种交叉反应性和信号阻断Ca2+方面显示出优势。
实施例13.3F11hz4抗体在CD34人源化小鼠中的抗肿瘤功效
hu-HSC-NPG人免疫系统小鼠模型的制备和检测：将4周龄的雌性NPG小鼠用X射线生物辐照器辐照4-24h，并且通过尾静脉注射来源于脐带血的CD34+造血干细胞。在移植后十六周，通过眼眶收集血液样品，并且用EDTA-Na2抗凝管收集血液样品。使用流式细胞术来分析动物外周血中人CD45、CD3、CD4和CD8阳性细胞的含量，以确定所植入的人T细胞的比例。选择具有高T细胞植入率的hu-HSC-NPG来建立荷瘤模型。
肿瘤接种：将肺癌(HCC827)培养并扩增至足够数量，悬浮于PBS溶液中，并且以5×106个细胞/0.2ml的剂量注射到背侧皮下区域中。每轮实验共接种45只小鼠，并且在皮下肿瘤清晰可见时观察体积。在7-14天后，皮下肿瘤长到50-100mm3。移出一些皮下肿瘤过大或过小的小鼠，并且随机分为4组，每组10只小鼠。如下分类：第1组：IgG1 10mpk，iv，biw；第2组：CCR8-Ab-IgG1 1mpk，iv，biw；第3组：CCR8-Ab-IgG1 3mpk，iv，biw；第4组：CCR8-Ab-IgG110mpk，iv，biw。用CCR8抗体静脉内(I.V.)注射动物。根据皮下肿瘤的生长速度，每周两次施用抗体，共施用5-6次。每周两次测量皮下肿瘤的体积和小鼠的体重。肿瘤体积计算公式：体积＝长径×短径×短径/2。
统计方法：使用数据分析GraphPad Prism 8.0统计分析软件来分析在CCR8抗体治疗组与同种型对照组之间皮下肿瘤体积是否存在统计差异。首先，对数据进行正态分布和方差齐性检验。符合正态分布(P>0.20)和方差齐性(P>0.10)：通过单因素方差分析方法检验多组之间的比较，并且P<0.05被认为统计上显著；如果不符合正态分布或方差，则使用非参数检验的kruskal-Wallis H方法进行分析。如下计算肿瘤体积抑制率(TGI)：TGI＝100％×[1-RTV(实验组)/RTV(对照组)]。
结论：3F11hz4抗体对皮下肺癌(HCC827细胞系)的剂量依赖性抗肿瘤作用已经在CD34人源化动物模型中得到证实(图7)。
实施例14.3F11hz4抗体在同基因模型中的抗肿瘤功效
在实体瘤模型(诸如肺癌和肝癌)中，研究3F11hz4的剂量-效应关系，以探索最低有效剂量和最大有效剂量。
肺癌和肝癌的同基因移植肿瘤模型在小鼠中的体内功效验证：每轮实验准备50只8周龄的雌性小鼠。将1x 106个小鼠肺癌(LLC)和肝癌(H22)细胞在200μL PBS中皮下接种于小鼠腹部右侧，并且将接种日期记录为第0天。在4-7天后，皮下肿瘤长到50-100mm3。根据皮下肿瘤的体积，移出一些皮下肿瘤过大或过小的小鼠，并且随机分为4组，每组10只小鼠。如下分类：第1组：mIgG2a 10mpk，ip，biw；第2组：CCR8-Ab-mIgG2a 1mpk，ip，biw；第3组：CCR8-Ab-mIgG2a 3mpk，ip，biw；第4组：CCR8-Ab-mIgG2a 10mpk，ip，biw。用CCR8抗体腹膜内(I.P.)注射动物。根据皮下肿瘤的生长速度，每周两次施用抗体，共施用3-6次。每周两次测量皮下肿瘤的体积和小鼠的体重。肿瘤体积计算公式：体积＝长径×短径×短径/2。使用GraphPad软件来分析在CCR8抗体治疗组与同型对照组之间皮下肿瘤体积是否存在统计差异。
结论：3F11hz4抗体对皮下肺癌(HCC827细胞系)的剂量依赖性抗肿瘤作用已经在CD34人源化动物模型中(图7)以及在小鼠肝癌(H22细胞系)和同基因小鼠肺癌(LLC细胞系)中(图8和9)得到证实。
实施例15.Treg细胞迁移测试
Treg细胞迁移测试：通过磁珠分选方法富集小鼠H22皮下肿瘤中的CD4+CD25+Treg细胞，并且使用CCR8抗体流式细胞术来检测富集的Treg细胞的CCR8表达率，并且在CCR8表达率大于80％时进行迁移测试。将CD4+CD25+Treg细胞用饥饿培养基1640+1％ FBS(Ce)+1％ P/S处理3h。收集细胞，离心计数，并且在1640+0.5％ BSA培养基中悬浮至2.66x 106/mL。用迁移培养基1640+0.5％ BSA+1％ P/S稀释CCR8抗体：首先，将2μL10mg/mL CCR8抗体添加到998μL 1640+0.5％ BSA+1％ P/S培养基中，并且稀释至50μg/mL；根据5倍6个点的梯度稀释设置无CCR8抗体的阳性对照组。将75μL稀释的CCR8抗体与75μL细胞悬浮液混合，置于37℃培养箱中，并且孵育30min。将CCL1用迁移培养基1640+0.5％ BSA+1％ P/S稀释(每8个孔1mL)。将100μL 10ng/mL CCL1稀释液预先添加到Transwell板的下层中。将75μL与CCR8抗体共孵育的细胞添加到Transwell板的上层中。在37℃培养箱中培养3小时。通过流式细胞术对下层细胞的数量进行计数，并且将高速设置为60ul/min和1min。GraphPad Prism处理数据以分析CCR8抗体对Treg细胞迁移的抑制程度。
结论：使用选自H22肝癌皮下肿瘤组织的Treg细胞来验证CCR8抗体可以抑制Treg细胞的迁移(图10)。
将在本发明中提及的所有文件都通过引用并入本申请，其程度如同每个单独文件被具体且单独地指示通过引用并入一样。另外，应当理解，在阅读本发明所教导的内容后，本领域技术人员可以对本发明进行各种修改和改变，并且这些等效方案也落入权利要求所限定的范围内。

Claims (36)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链可变区，所述重链可变区包含选自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
a)SEQ ID NO:58、79和80；或
b)SEQ ID NO:2、3和4；或
c)SEQ ID NO:2、3和10；或
d)SEQ ID NO:2、16和17；或
e)SEQ ID NO:22、23和24；或
f)SEQ ID NO:32、33和34；或
g)SEQ ID NO:40、41和42；或
h)SEQ ID NO:47、48和49；或
i)SEQ ID NO:40、3和55；或
j)SEQ ID NO:58、59和60；或
k)SEQ ID NO:58、3和63；或
l)SEQ ID NO:2、3和67；或
m)SEQ ID NO:72、73和74；或
n)SEQ ID NO:58、83和84；或
o)SEQ ID NO:58、83和88；或
并且包含至少一个轻链可变区，所述轻链可变区包含选自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)SEQ ID NO:6、7和14；或
b)SEQ ID NO:6、7和8；或
c)SEQ ID NO:12、7和14；或
d)SEQ ID NO:19、7和14；或
e)SEQ ID NO:26、20和27；或
f)SEQ ID NO:30、20和27；或
g)SEQ ID NO:36、37和38；或
h)SEQ ID NO:44、37和45；或
i)SEQ ID NO:51、52和53；或
j)SEQ ID NO:6、7和8；或
k)SEQ ID NO:65、7和14；或
l)SEQ ID NO:69、70和13；或
m)SEQ ID NO:76、37和77；或
n)SEQ ID NO:86、7和14，
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR8；并且以上氨基酸序列中的任一个进一步包括通过任选地添加、缺失、修饰和/或取代1-5(或1、2、3)个氨基酸而形成并且能够保留CCR8结合能力的衍生序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)SEQ ID NO:58、79、80、6、7和14；或
b)SEQ ID NO:2、3、4、6、7和8；或
c)SEQ ID NO:2、3、10、12、7和14；或
d)SEQ ID NO:2、16、17、19、7和14；或
e)SEQ ID NO:22、23、24、26、20和27；或
f)SEQ ID NO:22、23、24、30、20和27；或
g)SEQ ID NO:32、33、34、36、37和38；或
h)SEQ ID NO:40、41、42、44、37和45；或
i)SEQ ID NO:47、48、49、51、52和53；或
j)SEQ ID NO:40、3、55、6、7和8；或
k)SEQ ID NO:58、59、60、6、7和14；或
l)SEQ ID NO:58、3、63、65、7和14；或
m)SEQ ID NO:2、3、67、69、70和13；或
n)SEQ ID NO:72、73、74、76、37和77；或
o)SEQ ID NO:58、83、84、86、7和14；或
p)SEQ ID NO:58、83、88、86、7和14。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述重链进一步包括重链恒定区和/或所述轻链进一步包括轻链恒定区。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体的重链可变区进一步包含人或人源化框架区，和/或所述抗体的轻链可变区进一步包含人或人源化框架区。
5.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述多肽序列选自：
a)具有SEQ ID NO:96的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:97的多肽序列的轻链可变区；或
b)具有SEQ ID NO:78的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:81的多肽序列的轻链可变区；或
c)具有SEQ ID NO:1的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:5的多肽序列的轻链可变区；或
d)具有SEQ ID NO:9的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:11的多肽序列的轻链可变区；或
e)具有SEQ ID NO:15的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区；或
f)具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:25的多肽序列的轻链可变区；或
g)具有SEQ ID NO:28的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:29的多肽序列的轻链可变区；或
h)具有SEQ ID NO:31的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:35的多肽序列的轻链可变区；或
i)具有SEQ ID NO:39的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:43的多肽序列的轻链可变区；或
j)具有SEQ ID NO:46的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:50的多肽序列的轻链可变区；或
k)具有SEQ ID NO:54的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:56的多肽序列的轻链可变区；或
l)具有SEQ ID NO:57的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:61的多肽序列的轻链可变区；或
m)具有SEQ ID NO:62的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:64的多肽序列的轻链可变区；或
n)具有SEQ ID NO:66的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:68的多肽序列的轻链可变区；或
o)具有SEQ ID NO:71的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:75的多肽序列的轻链可变区；或
p)具有SEQ ID NO:82的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:85的多肽序列的轻链可变区；或
q)具有SEQ ID NO:87的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:89的多肽序列的轻链可变区；或
r)具有SEQ ID NO:90的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:91的多肽序列的轻链可变区；或
s)具有SEQ ID NO:92的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:93的多肽序列的轻链可变区；或
t)具有SEQ ID NO:94的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:95的多肽序列的轻链可变区；或
u)具有SEQ ID NO:92的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:98的多肽序列的轻链可变区；或
v)具有SEQ ID NO:92的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:99的多肽序列的轻链可变区；或
w)具有SEQ ID NO:100的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:101的多肽序列的轻链可变区；或
x)具有SEQ ID NO:102的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:103的多肽序列的轻链可变区；或
y)具有SEQ ID NO:104的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:105的多肽序列的轻链可变区；或
z)具有SEQ ID NO:106的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:107的多肽序列的轻链可变区；或
aa)具有SEQ ID NO:108的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:109的多肽序列的轻链可变区；或
bb)具有SEQ ID NO:110的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:111的多肽序列的轻链可变区。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:1、9、15、21、28、31、39、46、54、57、62、66、71、78、82、87、90、92、94、96、100、102、104、106、108或110至少(≥)85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO:5、11、18、25、29、35、43、50、56、61、64、68、75、81、85、89、91、93、95、97、98、99、101、103、105、107、109或111至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽序列的轻链可变区。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
8.根据权利要求7中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自：(i)单链抗体、单链可变片段(scFv)、缺乏铰链区的单价抗体或微抗体；(ii)Fab、Fab'或F(ab')2片段；(iii)全抗体；和(iv)包含人IgG Fc结构域的抗体。
9.根据权利要求7所述的抗体，其中所述抗体是人的或人源化的。
10.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是能够结合人CCR8的CCR8特异性抗体。
11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是能够结合人CCR8并阻断CCL1-CCR8信号传导的CCR8特异性抗体。
12.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段在包含选自人CCR8的Y94至K107的一个或多个氨基酸残基的表位处与CCR8特异性结合。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段在包含选自人CCR8的Y94、L95、L96、D97、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一个或多个氨基酸残基的表位处与人CCR8特异性结合。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段在包含选自人CCR8的Y94、L95、L96、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一个氨基酸残基的表位处与人CCR8特异性结合。
15.一种重组蛋白，所述重组蛋白包含：
(i)根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)有助于表达和/或纯化的任选标签序列。
16.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求15所述的重组蛋白。
17.一种载体，所述载体包含根据权利要求16所述的分离的核酸分子。
18.根据权利要求17所述的载体，所述载体包括细菌质粒，噬菌体，酵母质粒，植物细胞病毒，哺乳动物细胞病毒诸如腺病毒、慢病毒或逆转录病毒。
19.一种工程化宿主细胞，所述工程化宿主细胞在其基因组中包含根据权利要求16所述的核酸，或包含根据权利要求17所述的载体。
20.一种足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸是根据权利要求16所述的核酸分子或其互补序列的片段。
21.一种抗体缀合物，所述抗体缀合物包含：
(i)选自根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求15所述的重组蛋白或其组合的抗体部分；和
(ii)与所述抗体部分偶联的偶联部分，其中所述偶联部分选自可检测标签、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶或其组合。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求15所述的重组蛋白、根据权利要求16所述的分离的核酸分子、根据权利要求17所述的载体、根据权利要求21所述的抗体缀合物或它们的组合，和(ii)药学上可接受的载剂。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述抗CCR8的抗体具有去除肿瘤浸润性Treg细胞的作用。
24.一种用于治疗由CCR8和/或CCLl介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求15所述的重组蛋白、根据权利要求16所述的分离的核酸分子、根据权利要求17所述的载体、根据权利要求21所述的抗体缀合物或根据权利要求22所述的药物组合物施用给有需要的受试者。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病是癌症。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌或胰腺癌。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病是神经性疼痛。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述神经性疼痛是由糖尿病或脊髓损伤诱发的。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病是IgG4相关疾病。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述IgG4相关疾病是IgG4相关硬化性胆管炎。
31.一种确定受试者的CCR8水平的方法，所述方法包括(a)从所述受试者获得样品；(b)使所述样品与根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)确定所述受试者的CCR8水平。
32.活性成分用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备用以预防和/或治疗与CCR8相关的疾病的药物的用途，其中所述活性成分选自根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求15所述的重组蛋白、根据权利要求16所述的分离的核酸分子、根据权利要求17所述的载体、根据权利要求20所述的抗体缀合物以及它们的组合。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述疾病是癌症。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述疾病是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌或胰腺癌。
35.一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含：
(i)含有根据权利要求1-14中任一项所述的抗体作为一抗的第一容器；和
(ii)含有抗所述一抗的二抗的第二容器。
36.一种用于制备根据权利要求1-10中任一项所述的重组多肽的方法，所述方法包括：
(i)在适合表达的条件下培养工程化宿主细胞；以及
(ii)从所述培养物中分离重组多肽，其中所述重组多肽是抗体、其抗原结合片段或重组蛋白。
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