TW202325732A - 抗-ccr8抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及抗CCR8抗體和使用抗CCR8抗體的方法。本文所述的抗CCR8抗體可用於診斷和治療由CCR8和/或CCL1介導的疾病，諸如多種癌症和與異常CCL1/CCR8軸相關的神經性疼痛。
Description
本發明涉及新型抗CCR8抗體或其抗原結合片段、編碼所述抗體或其抗原結合片段的核酸、包括所述核酸的載體和宿主細胞、用於產生所述抗體或其抗原結合片段的方法、含有所述抗體或其抗原結合片段作為活性成分的醫藥組合物以及所述抗體在治療由CCR8介導的疾病中的用途。
趨化介素是參與炎症中細胞募集和啟動的低分子量趨化細胞介素家族。趨化介素通過與作為G蛋白偶聯受體的趨化介素受體結合來調節廣泛的細胞功能並發揮其作用，從而引起免疫系統中各種細胞亞群的趨化性和啟動。根據蛋白質內N末端半胱胺酸殘基的位置，趨化介素被分為不同類別，包括CC、CXC、CX3C和XC。CC類趨化介素含有前兩個半胱胺酸不被任何胺基酸隔開的CC基序，而CXC類趨化介素含有前兩個半胱胺酸被隨機胺基酸隔開的CXC基序。趨化介素的活性主要通過與其在白細胞表面上的受體緊密結合來介導。
在正常生理條件下，趨化介素和趨化介素受體的表現受到精細且嚴格的調節，趨化介素和趨化介素受體的表現和啟動失調通常引起諸如自身免疫性疾病或癌症等疾病。
身體有許多旨在防止癌症發生的內在機制。在這方面，免疫系統
被認為在消滅攜帶基因突變的細胞中發揮著關鍵作用。因此，推斷癌細胞通常通過不斷進化的方式持續存在，以避免被免疫系統的細胞識別。特別地，已經表明，外周循環內和腫瘤微環境內調節性T淋巴細胞(其可以在本文中稱為“Treg細胞＂)的水準升高都是在癌症患者中觀察到的免疫抑制的基礎。存在Treg細胞的數量增加也已經被確定為成功實施癌症免疫療法的障礙。
CCR8(C-C基序趨化介素受體8)主要在Treg細胞和Th2細胞上表現，但是不在Th1細胞上表現。已經證明，這個表現CCR8的CD4+ Foxp3+ Treg細胞(CCR8+ Treg細胞)子集是免疫抑制的主要驅動因素，並且對Treg功能和抑制至關重要。此外，CCR8是一種在若干腫瘤類型中被腫瘤駐留Treg細胞選擇性上調的特異性標誌物。許多報導表明，CCR8+ Treg細胞的增加對腫瘤逃逸機制有益。在臨床上，乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌和許多其他癌症類型的腫瘤微環境中Treg細胞的增加與預後不良相關。就機制而言，Treg細胞不僅抑制廣泛的抗腫瘤免疫反應，而且還促進腫瘤微環境血管的再生。腫瘤微環境中的癌細胞和免疫細胞分泌CCL1(CCR8的特異性配體)，從而將CCR8+ Treg細胞募集到腫瘤微環境中。CCR8還在腫瘤微環境中的Treg增殖和擴增中發揮作用。已經表明，CCR8抑制劑可減少腫瘤浸潤的Treg細胞，從而防止腫瘤生長。因此，CCR8被認為是癌症的潛在治療靶標。
CCR8在脊髓神經元中表現，脊髓神經元也是脊髓CCL1的主要來源。CCL1是一種來自CC亞家族的充分表徵的趨化介素。它通過與細胞表面趨化介素受體CCR8相互作用來吸引免疫細胞。CCL1和CCR8神經元信號傳導還在糖尿病、脊髓損傷等誘發的神經性疼痛中發揮重要作用。因此，CCL1/CCR8軸可能是治療糖尿病性神經病的藥物開發的有希望的新型靶標。
據報導，CCL1-CCR8相互作用還在諸如IgG4相關硬化性膽管炎(ISC)等IgG4相關疾病(IgG4-RD)中發揮關鍵作用。
最近鑒定出的另一種CCR8配體是CCL18，它是一種來自β-趨化介素亞家族的趨化介素。與原發性舍葛籣症候群和對照受試者相比，IgG4-RD患者的唇唾液腺(LSG)和淚腺中的CCL18-CCR8軸特異性上調。基於其重要的致病作用，諸如各種細胞的趨化性、纖維化的誘導和IgG4產生的增強，該軸可能是IgG4-RD中潛在的新型治療靶標。
鑒於CCR8在多種疾病的發病機制中的作用，希望製備抑制CCR8活性的抗體，所述抗體可用於治療由CCR8介導的疾病，諸如癌症、神經性疼痛、IgG4相關疾病(IgG4-RD)，包括但不限於自身免疫性胰腺炎、嗜酸性血管中心纖維化、纖維化縱隔炎、肥厚性硬腦膜炎、伴有廣泛腎小管間質沉積的特發性低補體血症性腎小管間質性腎炎、炎性主動脈瘤、炎性假瘤、Küttner腫瘤(慢性硬化性涎腺炎)、縱隔纖維化、米庫里茲症候群、多灶性纖維硬化、主動脈周炎和動脈周炎、腹膜後纖維化(奧蒙德病(Ormond's disease))、裡德爾氏甲狀腺炎(Riedel's thyroiditis)、硬化性腸系膜炎、硬化性胰腺炎和硬化性膽管炎等。
總結起來，本領域需要包含抗CCR8抗體的更有效的治療劑，所述治療劑有效地抑制CCR8信號傳導，同時在人中引起最小的不良副作用。
本發明的目的是提供特異性結合CCR8的抗CCR8抗體或其抗原結合片段，它們通過抑制由特異性表現CCR8的Treg細胞等介導的免疫抑制來啟動免疫。另外，本文公開的抗CCR8抗體或其抗原結合片段可以通過調節
CCL1/CCR8軸來減輕神經性疼痛。此類抗體或抗原結合片段可以用於靶向表現CCR8的細胞以用於治療和診斷目的。
本發明的諸位發明人還發現，本文公開的人類化抗體不僅與CCR8特異性結合，而且還顯示出強烈的CCL1-CCR8信號傳導阻斷和改善的物種交叉反應性。因此，本發明的主要優點包括：
(a)根據本發明的抗體具有出色的生物活性和特異性，它對細胞表面CCR8具有良好的結合親和力，並且可以用作靶向CCR8的抗體；
(b)根據本發明的全人抗體不僅具有與免疫抗體相當的活性，而且還具有較低的免疫原性；
(c)根據本發明的抗體不僅在抑制CCL1誘導的趨化性中具有顯著效果，而且還適用於其他異常CCL1/CCR8軸相關疾病。
在第一態樣，提供了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含至少一個重鏈可變區，所述重鏈可變區包含選自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
a)SEQ ID NO：2、3和4；或
b)SEQ ID NO：2、3和10；或
c)SEQ ID NO：2、16和17；或
d)SEQ ID NO：22、23和24；或
e)SEQ ID NO：32、33和34；或
f)SEQ ID NO：40、41和42；或
g)SEQ ID NO：47、48和49；或
h)SEQ ID NO：40、3和55；或
i)SEQ ID NO：58、59和60；或
j)SEQ ID NO：58、3和63；或
k)SEQ ID NO：2、3和67；或
l)SEQ ID NO：72、73和74；或
m)SEQ ID NO：58、79和80；或
n)SEQ ID NO：58、83和84；或
o)SEQ ID NO：58、83和88；或
並且包含至少一個輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含選自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)SEQ ID NO：6、7和8；或
b)SEQ ID NO：12、7和14；或
c)SEQ ID NO：19、7和14；或
d)SEQ ID NO：26、20和27；或
e)SEQ ID NO：30、20和27；或
f)SEQ ID NO：36、37和38；或
g)SEQ ID NO：44、37和45；或
h)SEQ ID NO：51、52和53；或
i)SEQ ID NO：6、7和8；或
j)SEQ ID NO：6、7和14；或
k)SEQ ID NO：65、7和14；或
l)SEQ ID NO：69、70和13；或
m)SEQ ID NO：76、37和77；或
n)SEQ ID NO：86、7和14，
其中所述抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR8；並且以上胺基酸序列中的任一個進一步包括通過任選地添加、缺失、修飾和/或取代1-5(或1、2、3)個胺基酸而形成並且能夠保留CCR8結合能力的衍生序列。
在優選實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)SEQ ID NO：2、3、4、6、7和8；或
b)SEQ ID NO：2、3、10、12、7和14；或
c)SEQ ID NO：2、16、17、19、7和14；或
d)SEQ ID NO：22、23、24、26、20和27；或
e)SEQ ID NO：22、23、24、30、20和27；或
f)SEQ ID NO：32、33、34、36、37和38；或
g)SEQ ID NO：40、41、42、44、37和45；或
h)SEQ ID NO：47、48、49、51、52和53；或
i)SEQ ID NO：40、3、55、6、7和8；或
j)SEQ ID NO：58、59、60、6、7和14；或
k)SEQ ID NO：58、3、63、65、7和14；或
l)SEQ ID NO：2、3、67、69、70和13；或
m)SEQ ID NO：72、73、74、76、37和77；或
n)SEQ ID NO：58、79、80、6、7和14；或
o)SEQ ID NO：58、83、84、86、7和14；或
p)SEQ ID NO：58、83、88、86、7和14。
在優選實施例中，所述重鏈進一步包括重鏈恒定區和/或所述輕鏈進一步包括輕鏈恒定區。
在優選實施例中，所述抗體的3個HCDR和3個LCDR中添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸的數量為1-5(諸如1-3，優選1-2，更優選1)。
在優選實施例中，所述抗體的重鏈可變區進一步包含人或人類化架構區，和/或所述抗體的輕鏈可變區進一步包含人或人類化架構區。
在優選實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區：
a)具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的輕鏈可變區；或
b)具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：11的多肽序列的輕鏈可變區；或
c)具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：18的多肽序列的輕鏈可變區；或
d)具有SEQ ID NO：21的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：25的多肽序列的輕鏈可變區；或
e)具有SEQ ID NO：28的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：29的多肽序列的輕鏈可變區；或
f)具有SEQ ID NO：31的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：35的多肽序列的輕鏈可變區；或
g)具有SEQ ID NO：39的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：43的多肽序列的輕鏈可變區；或
h)具有SEQ ID NO：46的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：50的多肽序列的輕鏈可變區；或
i)具有SEQ ID NO：54的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：56的多肽序列的輕鏈可變區；或
j)具有SEQ ID NO：57的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：61的多肽序列的輕鏈可變區；或
k)具有SEQ ID NO：62的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：64的多肽序列的輕鏈可變區；或
l)具有SEQ ID NO：66的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：68的多肽序列的輕鏈可變區；或
m)具有SEQ ID NO：71的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：75的多肽序列的輕鏈可變區；或
n)具有SEQ ID NO：78的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：81的多肽序列的輕鏈可變區；或
o)具有SEQ ID NO：82的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：85的多肽序列的輕鏈可變區；或
p)具有SEQ ID NO：87的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：89的多肽序列的輕鏈可變區；或
q)具有SEQ ID NO：90的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：91的多肽序列的輕鏈可變區；或
r)具有SEQ ID NO：92的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：93的多肽序列的輕鏈可變區；或
s)具有SEQ ID NO：94的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：95的多肽序列的輕鏈可變區；或
t)具有SEQ ID NO：96的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：97的多肽序列的輕鏈可變區；或
u)具有SEQ ID NO：92的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：98的多肽序列的輕鏈可變區；或
v)具有SEQ ID NO：92的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：99的多肽序列的輕鏈可變區；或
w)具有SEQ ID NO：100的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：101的多肽序列的輕鏈可變區；或
x)具有SEQ ID NO：102的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：103的多肽序列的輕鏈可變區；或
y)具有SEQ ID NO：104的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：105的多肽序列的輕鏈可變區；或
z)具有SEQ ID NO：106的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：107的多肽序列的輕鏈可變區；或
aa)具有SEQ ID NO：108的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：109的多肽序列的輕鏈可變區；或
bb)具有SEQ ID NO：110的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：111的多肽序列的輕鏈可變區。
在優選實施例中，所述抗體是單株抗體。
在優選實施例中，所述抗體是雙鏈抗體或單鏈抗體。
在優選實施例中，所述抗體是全長抗體蛋白或抗原結合片段。
在優選實施例中，所述抗體是重組抗體。
在優選實施例中，所述抗體或其抗原結合片段是嵌合的。
在優選實施例中，所述抗體是雙特異性抗體或多特異性抗體。
在另一個優選實施例中，所述CCR8特異性抗體選自：(i)單鏈抗體、單鏈可變片段(scFv)、缺乏鉸鏈區的單價抗體或微抗體；(ii)Fab、Fab'或F(ab')2片段；(iii)全抗體；和(iv)包含人IgG Fc結構域的抗體。
在優選實施例中，所述抗體或其抗原結合片段是人的或人類化的。
在優選實施例中，所述抗體是人抗CCR8抗體。
在優選實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO：1、9、15、21、28、31、39、46、54、57、62、66、71、78、82、87、90、92、94、96、100、102、104、106、108或110至少(
)85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO：5、11、18、25、29、35、43、50、56、61、64、68、75、81、85、89、91、93、95、97、98、99、101、103、105、107、109或111至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的多肽序列的輕鏈可變區。
在特別優選的實施例中，所述CCR8特異性抗體的VH鏈和VL鏈與選自以下的相應VH鏈和VL鏈的胺基酸序列分別具有至少80%、優選至少90%、更優選至少95%、甚至更優選至少99%的序列同一性：SEQ ID NO：1和5；或SEQ ID NO：9和11；或SEQ ID NO：15和18；或SEQ ID NO：21和25；或SEQ ID NO：28和29；或SEQ ID NO：31和35；或SEQ ID NO：39和43；或SEQ ID NO：46和50；或
SEQ ID NO：54和56；或SEQ ID NO：57和61；或SEQ ID NO：62和64；或SEQ ID NO：66和68；或SEQ ID NO：71和75；或SEQ ID NO：78和81；或SEQ ID NO：82和85；或SEQ ID NO：87和89；或SEQ ID NO：90和91；或SEQ ID NO：92和93；或SEQ ID NO：94和95；或SEQ ID NO：96和97；或SEQ ID NO：92和98；或SEQ ID NO：92和99；或SEQ ID NO：100和101；或SEQ ID NO：102和103；或SEQ ID NO：104和105；或SEQ ID NO：106和107；或SEQ ID NO：108和109；或SEQ ID NO：110和111。
在一些實施例中，本文公開了一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段在包含選自人CCR8的Y94至K107的一個或多個胺基酸殘基的表位處與人CCR8結合。
在一些實施例中，本文公開了一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段在包含選自人CCR8的Y94、L95、L96、D97、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一個或多個胺基酸殘基的表位處與人CCR8結合。
在一些實施例中，本文公開了一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段在包含選自人CCR8的Y94、L95、L96、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一個胺基酸殘基的表位處與人CCR8結合。
在其他特別優選的實施例中，所述CCR8特異性抗體是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。
在另一個優選實施例中，所述CCR8特異性抗體是選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和合成IgG的IgG。
在優選實施例中，所述抗體呈藥物綴合物的形式。
在第二態樣，提供了一種重組蛋白(或多肽)，所述重組蛋白(或
多肽)包含：
(i)根據本發明的第一態樣的抗體或其抗原結合片段；和
(ii)有助於表現和/或純化的任選標籤序列。
在優選實施例中，所述標籤序列包括6His標籤。
在優選實施例中，所述重組蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在優選實施例中，所述重組蛋白是單體、二聚體或多聚體。
在第三態樣，提供了分離的核酸，所述分離的核酸編碼第一態樣中的單株抗體或抗原結合片段或本發明的第二態樣中的重組蛋白。
在第三態樣，提供了分離的核酸，所述分離的核酸編碼第一態樣中的抗體或抗原結合片段或本發明的第二態樣中的重組蛋白。
在第四態樣，提供了一種載體，所述載體包含所述分離的核酸，所述分離的核酸編碼第一態樣中的抗體或抗原結合片段或本發明的第二態樣中的重組蛋白。
在優選實施例中，所述載體包括細菌質體，噬菌體，酵母質體，植物細胞病毒，哺乳動物細胞病毒諸如腺病毒、慢病毒、反轉錄病毒，或其他載體。
在第五態樣，提供了一種抗體綴合物，所述抗體綴合物包含：
(i)選自本發明的第一態樣中的抗體或其抗原結合片段或本發明的第二態樣中的重組蛋白或它們的組合的抗體部分；和
(ii)與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，其中所述偶聯部分選自可檢測標籤、藥物、毒素、細胞介素、放射性核素、酶或其組合。
在優選例子中，所述抗體部分和所述偶聯部分通過化學鍵或連接
子偶聯。
在第六態樣，提供了一種醫藥組合物，所述醫藥組合物包含(i)第一態樣中的抗體或其抗原結合片段、第二態樣中的重組蛋白、第三態樣中的分離的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四態樣中的載體、第五態樣中的抗體綴合物或它們的組合，和(ii)醫藥上可接受的載劑。
在優選實施例中，所述抗體具有去除腫瘤浸潤性Treg細胞的作用。
在第七態樣，提供了一種用於治療由CCR8和/或CCL1介導的疾病的方法，所述方法包括將有效量的第一態樣中的抗體或其抗原結合片段、第二態樣中的重組蛋白、第三態樣中的分離的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四態樣中的載體、第五態樣中的抗體綴合物或第七態樣中的醫藥組合物或它們的組合施用給有需要的受試者；或第一態樣中的抗體或其抗原結合片段、第二態樣中的重組蛋白、第三態樣中的分離的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四態樣中的載體、第五態樣中的抗體綴合物或第七態樣中的醫藥組合物或它們的組合在製造用於治療由CCR8和/或CCL1介導的疾病的藥物中的用途；或用於在治療由CCR8和/或CCL1介導的疾病中使用的第一態樣中的抗體或其抗原結合片段、第二態樣中的重組蛋白、第三態樣中的分離的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四態樣中的載體、第五態樣中的抗體綴合物或第七態樣中的醫藥組合物或它們的組合。
在優選實施例中，所述由CCR8和/或CCL1介導的疾病是癌症。
在一個特別優選的實施例中，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌或胰腺癌。
在一個優選實施例中，所述疾病與異常CCL1/CCR8軸相關。
在一個特別優選的實施例中，所述與異常CCL1/CCR8軸相關的
疾病是神經性疼痛。
在一個特別優選的實施例中，所述神經性疼痛是由糖尿病或脊髓損傷誘發的。
在一個特別優選的實施例中，所述疾病是IgG4相關疾病。
在一個特別優選的實施例中，所述IgG4相關疾病是硬化性膽管炎、自身免疫性胰腺炎、嗜酸性血管中心纖維化、纖維化縱隔炎、肥厚性硬腦膜炎、伴有廣泛腎小管間質沉積的特發性低補體血症性腎小管間質性腎炎、炎性主動脈瘤、炎性假瘤、Küttner腫瘤(慢性硬化性涎腺炎)、縱隔纖維化、米庫里茲症候群、多灶性纖維硬化、主動脈周炎和動脈周炎、腹膜後纖維化(奧蒙德病)、裡德爾氏甲狀腺炎、硬化性腸系膜炎或硬化性胰腺炎。
在第八態樣，提供了一種確定受試者的CCR8水準的方法，所述方法包括(a)從所述受試者獲得樣品；(b)使所述樣品與本發明的分離的單株抗體或其抗原結合片段接觸；以及(c)確定所述受試者的CCR8水準。
優選地，所述樣品是組織樣品或血液樣品，並且所述組織樣品可以是癌組織樣品。
在第九態樣，提供了活性成分用於(a)製備診斷試劑或套組；和/或(b)製備用以預防和/或治療與CCR8相關的疾病的藥物的用途，其中所述活性成分選自第一態樣中的抗體或其抗原結合片段、第二態樣中的重組蛋白、第三態樣中的分離的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四態樣中的載體、第五態樣中的抗體綴合物以及它們的組合。
在優選實施例中，所述診斷試劑是測試條或測試板。
在優選實施例中，所述與CCR8相關的疾病包括癌症。
在一個特別優選的實施例中，所述癌症是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌或胰腺癌。
在優選實施例中，所述診斷試劑或套組用於：
(i)檢測樣品中的CCR8蛋白；和/或
(ii)檢測脊髓神經元中的內源性CCR8蛋白；和/或
(iii)檢測表現CCR8蛋白的調節性T淋巴細胞。
在優選實施例中，所述抗體呈抗體-藥物綴合物(ADC)的形式。
在第十態樣，提供了一種用於體外檢測(包括診斷性或非診斷性檢測)樣品中的CCR8蛋白的方法，所述方法包括：
(i)使所述樣品在體外與本發明的第一態樣中的抗體接觸；以及
(ii)檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中所述複合物的形成表明所述樣品中存在CCR8蛋白。
在第十一態樣，提供了一種套組，所述套組包含：
(i)含有本發明的抗體作為一抗的第一容器；和
(ii)含有抗本發明的一抗的二抗的第二容器。
在第十三態樣，提供了一種用於製備重組多肽的方法，所述方法包括：
(i)在適合表現的條件下培養本發明的第五態樣中的工程化宿主細胞；以及
(ii)從所述培養物中分離重組多肽，其中所述重組多肽是第一態樣中的抗體或其抗原結合片段或第二態樣中的重組蛋白。
圖1A和1B描繪了在殖株103G4、118H1、101E4、84B4、170G6、172E7、2P15、3C11、3O20、4M13、2L15、4D24、1G17、3F11、3F6和4G19的FACS結合分析中，抗體對過表現CCR8的293F細胞(293F-CCR8)具有結合能力；圖1C和1D描繪了在一些殖株的FACS結合分析中，抗體不與親本293F細胞結合。
圖2A、2B、2C、2D和2E分別示出了抗CCR8抗體(即，抗體殖株84B4、101E4、170G6、3C11、2P15)在MDA-MB-231異種移植中的抗腫瘤功效的結果。
圖3示出了3F11hz4和3F11對小鼠CCR8 CHOK1的結合親和力的結果。
圖4A、4B、4C、4D和4E分別示出了在使用293T細胞株和CHOK1細胞株的FACS結合分析中，抗體3F11hz4對過表現人CCR8的293T細胞(人CCR8-293T)、過表現大鼠CCR8的293T細胞(大鼠CCR8-293T)、過表現狗CCR8的293T細胞(狗CCR8-293T)、過表現小鼠CCR8的CHOK1細胞(小鼠CCR8-CHOK1)和過表現獼猴CCR8的293T細胞(獼猴CCR8-293T)具有結合能力。
圖5A和5B示出了3F11hz4對突變體CCR8 293T的結合親和力。
圖6A和6B示出了3F11hz4對hCCR4 293T和hCX3CR1 293T的結合親和力的結果。
圖7示出了3F11hz4抗體對HCC827肺癌皮下腫瘤(CD34人類化模型)的抗腫瘤功效。
圖8示出了3F11hz4抗體對H22肝癌皮下腫瘤(同基因模型)的抗腫瘤功效。
圖9示出了3F11hz4抗體對LLC肺癌皮下腫瘤(同基因模型)的抗
腫瘤功效。
圖10示出了Treg細胞的遷移測試。
經過廣泛深入的研究，諸位發明人意外獲得了一組具有全新胺基酸序列的全人CCR8抗體。本發明的CCR8抗體與CCR8蛋白具有出色的高親和力，因此可用於治療CCR8相關疾病，諸如同種免疫疾病、自身免疫性疾病、過敏、炎性疾病、腫瘤、神經性疼痛或IgG4相關疾病。已經在此基礎上完成了本發明。
術語
除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。否則，本文所用的某些術語具有如說明書中闡述的含義。
必須注意，除非上下文另外明確規定，否則如本文和所附申請專利範圍中所用，單數形式“一個/一種(a)＂、“一個/一種(an)”和“所述＂包括複數指示物。
除非另外陳述，否則任何數值(諸如本文所述的濃度或濃度範圍)都應被理解為在所有情況下都被術語“約＂修飾。因此，數值通常包括列舉值的±10%。例如，1mg/mL的濃度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同樣，1%至10%(w/v)的濃度範圍包括0.9%(w/v)至11%(w/v)。除非上下文另外明確規定，否則如本文所用，數值範圍的使用明確地包括所有可能的子範圍、該範圍內的所有單個數值，包括此類範圍內的整數和所述值的分數。
除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語“至少＂應被理解
為是指所述系列中的每個要素。本領域技術人員僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明的具體實施例的許多等效方案。此類等效方案旨在被本發明所涵蓋。
組成(consisting of)＂指示包括任何列舉的整數或整數組，但是沒有另外的整數或整數組可以添加到指定方法、結構或組合物中。
如本文所用，如在整個說明書和申請專利範圍中所用的術語“基本上由......組成(consists essentially of)＂或變型諸如“基本上由......組成(consist essentially of)＂或“基本上由......組成(consisting essentially of)＂指示包括任何列舉的整數或整數組，並且任選地包括不會實質性改變指定方法、結構或組合物的基本或新穎特性的任何列舉的整數或整數組。參見M.P.E.P.§ 2111.03。
如本文所用，“受試者＂意指任何動物，優選哺乳動物，最優選人。如本文所用的術語“哺乳動物＂涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物的例子包括但不限於牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更優選人。
詞語“右＂、“左＂、“下＂和“上＂表示參考的附圖中的方向。
還應當理解，本文所用的術語“約＂、“大約＂、“大體上＂、“基本上＂和類似術語在指代優選發明的部件的尺寸或特徵時指示所描述的尺寸/特徵不是嚴格的邊界或參數，並且不排除功能相同或相似的微小變化，如本領域普通技術人員將理解的。至少，包括數位參數的此類指代將包括使用本領域接受的數學和工業原理(例如，舍入、測量或其他系統誤差、製造公差等)不會改變最低有效數字的變化。
在兩個或更多個核酸或多肽序列(例如，抗CCR8抗體和編碼它們的多核苷酸、CCR8多肽和編碼它們的CCR8多核苷酸)的上下文中，術語“相同＂或“同一性＂百分比是指在比較和比對以獲得最大對應時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸，如使用以下
始搜索的種子，以發現含有它們的較長HSP。然後沿每個序列在兩個方向上延長字碼命中，只要可以增加累積比對得分即可。
對於核苷酸序列，使用參數M(對於一對匹配殘基的獎賞得分；總是>0)和N(對於錯配殘基的罰分；總是<0)來計算累積得分。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積得分。在累積比對得分從其最大達成值下降數量X時；在累積得分由於一個或多個負評分殘基比對的積累而變為零或以下時；或在到達任一序列的末端時，停止每個方向上的字碼命中延伸。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式(用於核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4以及兩條鏈的比較作為默認設置。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長(W)為3、期望值(E)為10以及BLOSEIM62評分矩陣作為默認設置(參見Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.ETSA 89：10915(1989))。
除了計算序列同一性百分比外，BLAST演算法還進行兩個序列之間的相似性的統計分析(參見例如Karlin & Altschul,Proc.NatT.Acad.Sci.ETSA 90：5873-5787(1993))。BLAST演算法提供的一個相似性量度是最小總和概率(P(N))，它提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中的最小總和概率小於約0.1、更優選小於約0.01、最優選小於約0.001，則核酸被認為與參考序列相似。
兩個核酸序列或多肽基本上相同的進一步指示是由第一核酸編碼的多肽與由第二核酸編碼的多肽具有免疫交叉反應性，如下所述。因此，例如，在一個多肽和第二多肽的區別僅在於保守取代的情況下，這兩個肽通常基本上相同。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示是兩個分子在嚴格條件下彼此雜
交。
如本文所用的術語“多核苷酸＂被定義為核苷酸鏈。此外，核酸
或VL序列的一個、兩個、三個、四個、五個或所有六個CDR。本文所述的CCR8
特異性抗體的抗原結合片段能夠與CCR8結合。在其他實施例中，抗原結合片段的結合防止或抑制一種或多種CCR8配體與CCR8受體的結合，從而中斷原本將由配體與受體結合引起的生物學反應。在某些實施例中，抗原結合片段與CCR8特異性結合和/或抑制或調節CCR8的生物學活性。
術語“抗原＂是指如下分子或分子的一部分，其能夠被選擇性結合劑(諸如抗體)結合並且另外能夠用於動物中以產生能夠與該抗原的表位結合的抗體。抗原可以具有一個或多個表位。
術語“表位＂包括能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合的任何決定簇，優選多肽決定簇。表位是被抗體結合的抗原區域。在某些實施例中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，並且在某些實施例中可以具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。在某些實施例中，當抗體在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中優先識別其靶抗原時，說所述抗體特異性結合抗原。根據某些實施例，在抗體-抗原結合的平衡解離常數小於或等於10-6M或小於或等於10-7M或小於或等於10-8M時，可以說抗體特異性結合抗原。在一些實施例中，平衡解離常數可以小於或等於10-9M或小於或等於10-10M。
使用術語“載體＂來指代用於將編碼資訊轉移到宿主細胞中的任何分子(例如，核酸、質體或病毒)。術語“表現載體＂是指適合轉化宿主細胞並且含有指導和/或控制插入的異源核酸序列的表現的核酸序列的載體。表現包括但不限於諸如轉錄、轉譯和RNA剪接(如果存在內含子的話)等過程。
C-C基序趨化介素受體8(CCR8)
CCR8(以前也稱為Cy6、CKR-L1或TER1)是一種在胸腺、脾臟
等中表現的G蛋白偶聯的7次跨膜CC趨化介素受體蛋白。編碼該蛋白質的基因位於人類染色體3p21上。人CCR8由355個胺基酸組成。已知CCL1是CCR8的內源性配體。人CCR8 cDNA由GenBank ACC編號M_005201.3表示的核苷酸序列構成，並且小鼠CCR8 cDNA由GenBank ACC編號NM_007720.2表示的核苷酸序列構成。
本發明的CCR8包括來源於小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、狗、豬和靈長類哺乳動物(包括猴和人)的那些。人CCR8是優選的。
抗體
本發明總體上涉及分離的抗CCR8抗體、編碼所述抗體的核酸和表現載體、含有所述載體的重組細胞以及包含所述抗體的組合物。還提供了製備所述抗體的方法以及使用所述抗體治療包括癌症在內的疾病的方法。本發明的抗體具有一種或多種期望的功能特性，包括但不限於與CCR8的高親和力結合、對CCR8的高特異性以及當單獨施用或與其他抗癌療法組合施用時在有需要的受試者和動物模型中抑制腫瘤生長的能力。
在一個一般態樣，本發明涉及特異性結合CCR8的分離的單株抗體或其抗原結合片段。
如本文所用，術語“抗體＂在廣義上使用並且包括免疫球蛋白或抗體分子，包括單株或多株的人抗體、人類化抗體、複合抗體和嵌合抗體以及抗體片段。一般來講，抗體是對特定抗原表現出結合特異性的蛋白質或肽鏈。抗體結構是熟知的。根據重鏈恒定結構域胺基酸序列，免疫球蛋白可以被歸為五個主要類別(即，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG被進一步細分為同種型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本發明的抗體可以屬於五種主要類別或相應亞類中的任一種。優選地，本發明的抗體是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基於
恒定結構域的胺基酸序列，脊椎動物物種的抗體輕鏈可以被歸為兩種明顯不同的類型(即κ和λ)中的一種。因此，本發明的抗體可以含有κ或λ輕鏈恒定結構域。根據特定實施例，本發明的抗體包括來自大鼠或人抗體的重鏈和/或輕鏈恒定區。除了重鏈和輕鏈恒定結構域外，抗體還含有由輕鏈可變區和重鏈可變區組成的抗原結合區，所述輕鏈可變區和重鏈可變區各自含有三個結構域(即，互補決定區1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。輕鏈可變區結構域可替代地被稱為LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且重鏈可變區結構域可替代地被稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如本文所用，術語“分離的抗體＂是指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，與CCR8特異性結合的分離的抗體基本上不含不與CCR8結合的抗體)。另外，分離的抗體基本上不含其他細胞材料和/或化學物質。
如本文所用，術語“單株抗體＂是指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即構成所述群體的各個抗體是相同的，除了可能以少量存在的可能天然發生的突變外。本發明的單株抗體可以通過雜交瘤方法、噬菌體展示技術、單淋巴細胞基因選殖技術或重組DNA方法來製備。例如，單株抗體可以由雜交瘤產生，所述雜交瘤包括從具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組的轉基因非人動物(諸如轉基因小鼠或大鼠)獲得的B細胞。
如本文所用，術語“抗原結合片段＂是指抗體片段，例如像雙抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv1)、二硫鍵穩定的雙抗體(ds雙抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、單結構域抗體(sdab)、scFv二聚體(二價雙抗體)、由包含一個或多個CDR的
抗體部分形成的多特異性抗體、駝類化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體、二價結構域抗體或與抗原結合但不包含完整抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠與親本抗體或親本抗體片段所結合的相同抗原結合。根據實施例，抗原結合片段包含輕鏈可變區、輕鏈恒定區和重鏈的Fd區段。根據其他實施例，抗原結合片段包括Fab和F(ab')。
如本文所用，術語“單鏈抗體＂是指本領域的常規單鏈抗體，其包含由約15至約20個胺基酸的短肽連接的重鏈可變區和輕鏈可變區。如本文所用，術語“單結構域抗體＂是指本領域的常規單結構域抗體，其包含重鏈可變區和重鏈恒定區或僅包含重鏈可變區。
如本文所用，術語“人抗體＂是指由人產生的抗體或具有與使用本領域已知的任何技術製備的由人產生的抗體相對應的胺基酸序列的抗體。人抗體的該定義包括完整或全長抗體、其片段和/或包含至少一種人重鏈和/或輕鏈多肽的抗體。
如本文所用，術語“人類化抗體＂是指如下非人抗體，其經過修飾以增加與人抗體的序列同源性，使得保留抗體的抗原結合特性，但是其在人體內的抗原性降低。
如本文所用，術語“嵌合抗體＂是指其中免疫球蛋白分子的胺基酸序列來源於兩個或更多個物種的抗體。輕鏈和重鏈的可變區通常都對應於來源於一個哺乳動物物種(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特異性、親和力和能力的抗體的可變區，而恒定區對應於來源於另一個哺乳動物物種(例如，人)的抗體的序列，以避免在該物種中引發免疫反應。
如本文所用，術語“多特異性抗體＂是指包含多個免疫球蛋白可
變結構域序列的抗體，其中所述多個中的第一免疫球蛋白可變結構域序列對第一表位具有結合特異性，並且所述多個中的第二免疫球蛋白可變結構域序列對第二表位具有結合特異性。在一個實施例中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白質(或多聚蛋白的亞基))上。在一個實施例中，第一表位和第二表位重疊或基本上重疊。在一個實施例中，第一表位和第二表位不重疊或基本上不重疊。在一個實施例中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白質(或多聚蛋白的不同亞基))上。在一個實施例中，多特異性抗體包含第三、第四或第五免疫球蛋白可變結構域。在一個實施例中，多特異性抗體是雙特異性抗體分子、三特異性抗體分子或四特異性抗體分子。
如本文所用，術語“雙特異性抗體＂是指結合不超過兩個表位或兩種抗原的多特異性抗體。雙特異性抗體的特徵在於第一免疫球蛋白可變結構域序列對第一表位具有結合特異性並且第二免疫球蛋白可變結構域序列對第二表位具有結合特異性。在一個實施例中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白質(或多聚蛋白的亞基))上。在一個實施例中，第一表位和第二表位重疊或基本上重疊。在一個實施例中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白質(或多聚蛋白的不同亞基))上。在一個實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列以及對第二表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列。在一個實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性的半抗體或其片段以及對第二表位具有結合特異性的半抗體或其片段。在一個實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性的scFv或其片段以及對第二表位具有結合特異性的scFv或其片段。在一個實施例中，第一表位位於CCR8上，並且第
二表位位於PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD47、CD73、愛帕琳肽(apelin)、DLL3、密封蛋白18.2、TIP-1、CD3和/或其他腫瘤相關免疫抑制因子或表面抗原上。
如本文關於抗體所用的術語“特異性結合＂意指識別特定抗原但基本上不識別或結合樣品中的其他分子的抗體。例如，與來自一個物種的抗原特異性結合的抗體也可以與來自一個或多個物種的該抗原結合。但是，這種跨物種反應性本身並不會改變抗體的特異性分類。在另一個例子中，與抗原特異性結合的抗體也可以與抗原的不同等位基因形式結合。然而，這種交叉反應性本身並不會改變抗體的特異性分類。在一些情況下，術語“特異性結合(specific binding)＂或“特異性結合(specifically binding)＂可以用於指代抗體、蛋白質或肽與第二化學物質的相互作用，以意味著所述相互作用取決於化學物質上特定結構(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識別並結合至特定蛋白質結構，而不是一般的蛋白質。如果抗體對表位“A＂具有特異性，則在含有標記的“A＂和所述抗體的反應中，含有表位A(或游離的未標記的A)的分子的存在將減少與所述抗體結合的標記的A的量。
在某些實施例中，如本文所述的抗體及其抗原結合片段包括分別插入在重鏈與輕鏈架構區(FR)組之間的重鏈和輕鏈CDR組，所述架構區為CDR提供支援並限定CDR相對於彼此的空間關係。如本文所用，術語“CDR組＂是指重鏈或輕鏈V區的三個高變區。從重鏈或輕鏈的N末端開始，這些區域分別表示為“CDR1＂、“CDR2＂和“CDR3＂。因此，抗原結合位點包括六個CDR，包括來自重鏈和輕鏈V區各自的CDR集。包含單個CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被稱為“分子識別單元＂。對許多抗原-抗體複合物的晶
體學分析已經證明，CDR的胺基酸殘基與結合的抗原形成廣泛的接觸，其中最廣泛的抗原接觸是與重鏈CDR3。因此，分子識別單元主要負責抗原結合位點的特異性。
如本文所用，術語“FR組＂是指作為重鏈或輕鏈V區的CDR組的CDR的框架的四個側翼胺基酸序列。一些FR殘基可以接觸結合的抗原；然而，FR主要負責將V區折疊成抗原結合位點，特別是直接與CDR相鄰的FR殘基。在FR內，某些胺基殘基和某些結構特徵是非常高度保守的。在這方面，所有V區序列都含有約90個胺基酸殘基的內部二硫化物環。在V區折疊成結合位點時，CDR顯示為形成抗原結合表面的突出環基序。通常公認的是，存在FR的保守結構區，其影響CDR環折疊形狀成某些“典範＂結構，而不管精確的CDR胺基酸序列如何。此外，已知某些FR殘基參與穩定抗體重鏈和輕鏈的相互作用的非共價結構域間接觸。
免疫球蛋白可變區的結構和位置可以通過參考以下來確定：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，US Department of Health and Human Services,1987及其更新版(現在可在互聯網(immuno.bme.nwu.edu)上獲得)，Chothia、AbM和IMGT(參見例如Johnson等人，Nucleic Acids Res.,29：205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature,342：877-883(1989)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,227：799-817(1992)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.,273：927-748(1997)ImMunoGenTics(IMGT)numbering(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人，Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT＂編號方案)。抗原結合位點的定義還描述於以下文獻中：Ruiz等人，Nucleic Acids
Res.,28：219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29：207-209(2001)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262：732-745(1996)；和Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：9268-9272(1989)；Martin等人，Methods Enzymol.,203：121-153(1991)；和Rees等人，Sternberg M.J.E.(編輯),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。例如，根據Kabat，重鏈可變結構域(VH)中的CDR胺基酸殘基被編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且輕鏈可變結構域(VL)中的CDR胺基酸殘基被編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根據IMGT，VH中的CDR胺基酸殘基被編號為大約26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，並且VL中的CDR胺基酸殘基被編號為大約27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根據Kabat編號)。根據IMGT，可以使用程式IMGT/DomainGap Align來確定抗體的CDR區。除非另外指定，否則根據IMGT編號方案確定本文公開的CDR和架構區的位置。
如本文所用的“抗體重鏈＂是指在所有抗體分子中以其天然存在的構象存在的兩種類型的多肽鏈中的較大者。來自任何脊椎動物物種的重鏈都可以被歸為五種不同類別(或同種型)中的一種：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類別也分別被指定為α、δ、ε、γ和μ。基於序列和功能的差異，IgG和IgA類別被進一步分為亞類。人表現以下亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
如本文所用的“抗體輕鏈＂是指在所有抗體分子中以其天然存在的構象存在的兩種類型的多肽鏈中的較小者。κ和λ輕鏈是指兩種主要的抗體輕鏈同種型。
如本文所用的術語“合成抗體＂意指使用重組DNA技術產生的
抗體，例如像由如本文所述的噬菌體表現的抗體。所述術語還應當被解釋為意指通過合成編碼抗體的DNA分子(並且所述DNA分子表現抗體蛋白)或指定抗體的胺基酸序列產生的抗體，其中所述DNA或胺基酸序列已經使用本領域可用且熟知的合成DNA或胺基酸序列技術獲得。
本發明的抗體可以在其N末端或C末端與另外的蛋白質融合(Clinical Cancer Research,2004,10,1274-1281)。待融合的蛋白質可以由本領域技術人員適當地選擇。
在優選實施例中，分離的單株抗體或其抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的多肽序列選自：
1. SEQ ID NO：2、3、4、6、7和8；或
2. SEQ ID NO：2、3、10、12、7和14；或
3. SEQ ID NO：2、16、17、19、7和14；或
4. SEQ ID NO：22、23、24、26、20和27；或
5. SEQ ID NO：22、23、24、30、20和27；或
6. SEQ ID NO：32、33、34、36、37和38；或
7. SEQ ID NO：40、41、42、44、37和45；或
8. SEQ ID NO：47、48、49、51、52和53；或
9. SEQ ID NO：40、3、55、6、7和8；或
10. SEQ ID NO：58、59、60、6、7和14；或
11. SEQ ID NO：58、3、63、65、7和14；或
12. SEQ ID NO：2、3、67、69、70和13；或
13. SEQ ID NO：72、73、74、76、37和77；或
14. SEQ ID NO：58、79、80、6、7和14；或
15. SEQ ID NO：58、83、84、86、7和14；或
16. SEQ ID NO：58、83、88、86、7和14，
其中所述抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR8、優選人CCR8，
其中根據IMGT編號方案確定CDR的位置。
根據另一個特定態樣，本發明涉及分離的單株抗體或其抗原結合片段，所述分離的單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO：1、9、15、21、28、31、39、46、54、57、62、66、71、78、82、87、90、92、94、96、100、102、104、106、108或110中的一個至少85%、優選90%、更優選95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)相同的多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO：5、11、18、25、29、35、43、50、56、61、64、68、75、81、85、89、91、93、95、97、98、99、101、103、105、107、109或111中的一個至少85%、優選90%、更優選95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)相同的多肽序列的輕鏈可變區。
在本發明中，本發明的抗體還包括其保守變體，保守變體意指與本發明的抗體的胺基酸序列相比，有最多10個、優選最多8個、更優選最多至5個、最優選最多3個胺基酸被具有相似或相似特性的胺基酸替換以形成多肽。優選地通過根據表A的胺基酸取代產生這些保守變體多肽。
表A
本發明涉及分離的核酸，所述分離的核酸編碼本發明的單株抗體或其抗原結合片段。本領域技術人員將理解，可以在不改變蛋白質的胺基酸序列的情況下改變(例如，替換、缺失、插入等)蛋白質的編碼序列。因此，本領域技術人員將理解，可以在不改變蛋白質的胺基酸序列的情況下改變編碼本發明的單株抗體或其抗原結合片段的核酸序列。
多核苷酸、載體、宿主細胞和製備方法
本發明還提供了多核苷酸，所述多核苷酸編碼本文公開的任何一種抗體。在一些實施例中，本文公開了編碼與CCR8結合的抗體或抗體片段的分離的多核苷酸，其中所述抗體或抗體片段包含具有SEQ ID NO：58、79和80中所示的胺基酸序列的三個輕鏈CDR；和/或具有SEQ ID NO：6、7和14中所示的胺基酸序列的三個重鏈CDR。在一些實施例中，本文公開了編碼與CCR8結合的抗體
或抗體片段的分離的多核苷酸，其中所述抗體或抗體片段包含具有SEQ ID NO：58、79和80中所示的胺基酸序列的三個輕鏈CDR；和具有SEQ ID NO：6、7和14中所示的胺基酸序列的三個重鏈CDR。在一些實施例中，本文公開了編碼與CCR8結合的抗體或抗體片段的分離的多核苷酸，其中所述抗體或抗體片段包含具有選自以下的多肽序列的重鏈可變區和輕鏈可變區：SEQ ID NO：96和97；SEQ ID NO：78和81；SEQ ID NO：90和91；SEQ ID NO：92和93；SEQ ID NO：94和95；SEQ ID NO：92和98；或SEQ ID NO：92和99。
本發明還提供了載體，所述載體包含編碼本發明的單株抗體或其抗原結合片段的分離的核酸分子。可以使用本領域技術人員鑒於本公開文本已知的任何載體，諸如質體、粘粒、噬菌體載體或病毒載體。在一些實施例中，載體是重組表現載體，諸如質體。載體可以包括建立表現載體的常規功能的任何元件，例如啟動子、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇標記和複製起點。啟動子可以是組成型、誘導型或阻抑型啟動子。能夠將核酸遞送至細胞的許多表現載體是本領域已知的並且可以在本文中用於在細胞中產生抗體或其抗原結合片段。常規選殖技術或人工基因合成可以用於產生根據本發明的實施例的重組表現載體。此類技術是本領域技術人員鑒於本公開文本熟知的。
本發明還提供了宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼本發明的單株抗體或其抗原結合片段的分離的核酸分子。本領域技術人員鑒於本公開文本已知的任何宿主細胞都可以用於本發明的抗體或其抗原結合片段的重組表現。在一些實施例中，宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)TG1或BL21細胞(用於表現例如scFv或Fab抗體)、CHO-DG44細胞、293F細胞、CHO-K1細胞或HEK293細胞(用於表現例如全長IgG抗體)。根據實施例，通過常規方法(諸如化學轉染、熱激
或電穿孔)將重組表現載體轉化到宿主細胞中，在所述宿主細胞中，它被穩定整合到宿主細胞基因組中，使得有效表現重組核酸。
本發明還提供了產生本發明的單株抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在產生本發明的單株抗體或其抗原結合片段的條件下培養包含編碼所述單株抗體或其抗原結合片段的核酸的細胞，以及從所述細胞或細胞培養物(例如，從上淸液)中回收所述抗體或其抗原結合片段。可以從細胞中收穫表現的抗體或其抗原結合片段，並且根據本領域已知的常規技術且如本文所述進行純化。
如本領域技術人員將理解的，多核苷酸可以包括表現或可適於表現蛋白質、多肽、肽等的基因組序列、基因組外和質體編碼的序列以及較小工程化基因區段。此類區段可以是天然分離的或由技術人員合成修飾。
如技術人員也將認識到的，多核苷酸可以是單鏈的(編碼或反義)或雙鏈的，並且可以是DNA(基因組的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包括含有內含子並以一對一方式對應于DNA分子的HnRNA分子和不含有內含子的mRNA分子。另外的編碼或非編碼序列可以但不必存在於根據本公開文本的多核苷酸內，並且多核苷酸可以但不必與其他分子和/或支援材料連接。多核苷酸可以包含天然序列或可以包含編碼這樣的序列的變體或衍生物的序列。
通常，多核苷酸變體將含有一個或多個取代、添加、缺失和/或插入，優選地使得由變體多核苷酸編碼的抗體的結合親和力相對于由本文具體闡述的多核苷酸序列編碼的抗體基本上不減弱。
本文所述的多核苷酸或其片段(無論編碼序列本身的長度如何)可以與其他DNA序列(諸如啟動子、多腺苷酸化信號、另外的限制酶位點、多選
殖位點、其他編碼區段等)組合，使得它們的總長度可能相差很大。因此，預期可以採用幾乎任何長度的核酸片段，總長度優選地受到製備和在預期的重組DNA方案中使用的容易性的限制。例如，預期總長度為約10000、約5000、約3000、約2000、約1000、約500、約200、約100、約50個鹼基對等(包括所有中間長度)的說明性多核苷酸區段是有用的。
位點特異性誘變允許通過如下方式來產生突變體：使用編碼所需突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數量的相鄰核苷酸，以提供大小和序列複雜性足夠的引物序列，從而在被穿過的缺失連接的兩側形成穩定的雙鏈體。可以在所選擇的多核苷酸序列中採用突變以改善、改變、減少、修飾或以其他方式改動多核苷酸本身的特性，和/或改變編碼的多肽的特性、活性、組成、穩定性或一級序列。
抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)
抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)是指非特異性細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上的結合抗體隨後引起靶細胞裂解的細胞介導的反應。在優選實施例中，此類細胞是人細胞。雖然不希望限於任何特定的作用機制，但這些介導ADCC的細胞毒性細胞通常表現Fc受體(FcR)。用於介導ADCC的原代細胞NK細胞表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血細胞上的FcR表現總結於Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9：457-92(1991)中。為了評估分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，諸如美國專利號5,500,362或5,821,337中所述的測定。用於此類測定的有用效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和NK細胞。可替代地或另外地，可以在體內(例如，在動物模型中，諸如Clynes等
人，PNAS(USA),95：652-656(1998)中公開的動物模型)評估目標分子的ADCC活性。
“效應細胞＂是表現一種或多種FcR並執行效應子功能的白細胞。優選地，細胞至少表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV並執行ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括PBMC、NK細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；其中PBMC和NK細胞是優選的。在優選實施例中，效應細胞是人細胞。
使用術語“Fc受體＂或“FcR＂來描述與抗體的Fc區結合的受體。優選的FcR是天然序列人FcR。此外，優選的FcR是結合IgG抗體的FcR(γ受體)，並且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“啟動受體＂)和FcγRIIB(“抑制受體＂)，它們具有主要在其胞質結構域方面不同的相似胺基酸序列。啟動受體FcγRIIA在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸啟動基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)。(參見Daëron,Annu.Rev.Immunol.,15：203-234(1997))。FcR綜述於Ravetech和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods,4：25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.,126：330-41(1995)中。本文的術語“FcR＂涵蓋其他FcR，包括將來要鑒定的那些。所述術語還包括負責將母體IgG轉移至胎兒的新生兒受體FcRn(Guyer等人，Immunol.,117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.,24：249(1994))。
補體依賴性細胞毒性(CDC)
補體依賴性細胞毒性(CDC)是指分子在補體的存在下啟動補體
啟動和裂解靶標的能力。通過使補體系統的第一組分(C1q)與和同源抗原複合的分子(例如，抗體)結合來啟動補體啟動途徑。為了評估補體啟動，可以進行CDC測定，例如如Gazzano-Santaro等人，J.Immunol.Methods,202：163(1996)中所述。
抗體-藥物綴合物(ADC)
本發明還提供了基於根據本發明的抗體的抗體-藥物綴合物(ADC)。
通常，抗體-藥物綴合物包含抗體和效應分子，其中所述抗體與所述效應分子綴合，並且化學綴合是優選的。優選地，效應分子是治療活性藥物。另外，效應分子可以是毒性蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核素中的一種或多種。
根據本發明的抗體和效應分子可以通過偶聯劑偶聯。偶聯劑的例子可以是非選擇性偶聯劑、利用羧基的偶聯劑、肽鏈和利用二硫鍵的偶聯劑中的任何一種或多種。非選擇性偶聯劑是指使效應分子與抗體之間經由共價鍵連接的化合物，諸如戊二醛等。利用羧基的偶聯劑可以是順烏頭酸酐偶聯劑(諸如順烏頭酸酐)和醯腙偶聯劑(偶聯位點為醯腙)中的任何一種或多種。
使用抗體上的某些殘基(諸如Cys或Lys等)來連接多種官能團，包括顯像劑(諸如發色團和螢光團)、診斷劑(諸如MRI造影劑和放射性同位素)、穩定劑(諸如聚(乙二醇))和治療劑。抗體可以與功能劑綴合以形成抗體-功能劑的綴合物。功能劑(例如，藥物、檢測試劑、穩定劑)與抗體綴合(共價連接)。功能劑可以直接或經由連接子間接與抗體連接。
抗體可以與藥物綴合以形成抗體-藥物綴合物(ADC)。通常，
ADC包含藥物與抗體之間的連接子。連接子可以是可降解或不可降解連接子。通常，可降解連接子在細胞內環境中容易降解，例如，連接子在靶位點處降解，從而從抗體中釋放藥物。合適的可降解連接子包括例如酶可降解連接子，包括可以被細胞中的蛋白酶(例如，溶酶體蛋白酶或內體蛋白酶)降解的含肽基連接子；或糖連接子，例如可以被葡糖醛酸酶降解的含葡糖苷酸的連接子。肽基連接子可以包括例如二肽，諸如擷胺酸-瓜胺酸、苯丙胺酸-離胺酸或擷胺酸-丙胺酸。其他合適的可降解連接子包括例如pH敏感連接子(例如，在低於5.5的pH下水解的連接子，諸如腙連接子)和在還原條件下降解的連接子(例如，二硫鍵連接子)。不可降解連接子通常在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。
在連接到抗體之前，連接子具有能夠與某些胺基酸殘基反應的反應基團，並且通過反應基團實現連接。硫醇特異性反應基團是優選的，其包括例如馬來醯亞胺化合物、鹵化(例如，碘、溴或氯取代)醯胺、鹵化(例如，碘、溴或氯取代)酯、鹵化(例如，碘、溴或氯取代)甲基酮、苄基鹵化物(例如，碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基碸、吡啶基二硫化物、汞衍生物(諸如3,6-二-(汞甲基)二噁烷，其中抗衡離子為CH3COO-、Cl-或NO3 -)和聚亞甲基二甲基硫醚硫代磺酸鹽。連接子可以包括例如經由硫代琥珀醯亞胺與抗體連接的馬來醯亞胺。
藥物可以是任何細胞毒性、細胞抑制或免疫抑制藥物。在一個實施例中，抗體經由連接子與藥物連接，並且藥物具有可以與連接子形成鍵的官能團。例如，藥物可以具有可與連接子形成鍵的胺基、羧基、硫醇基、羥基或酮基。在藥物直接與連接子連接時，藥物在與抗體連接之前具有反應基團。
有用的藥物包括例如抗微管蛋白藥物、DNA小溝結合劑、DNA複
製抑制劑、烷化劑、抗生素、葉酸拮抗劑、抗代謝物、化療增敏劑、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼等。特別有用的細胞毒性藥物的例子包括例如DNA小溝結合劑、DNA烷化劑和微管蛋白抑制劑；典型的細胞毒性藥物包括例如澳瑞他汀(auristatin)、喜樹鹼、多卡黴素(docamycin/duocarmycin)、依託泊苷、美登素和美登素類化合物(例如，DM1和DM4)、紫杉烷、苯二氮呯或含有苯二氮呯的藥物(例如，吡咯並[1,4]苯二氮呯(PBD)、吲哚啉並苯二氮呯(indolinobenzodiazepine)和噁唑烷並苯二氮呯(oxazolidinobenzodiazepine))和長春花生物鹼。
在本發明中，藥物-連接子可以用於在簡單的步驟過程中形成ADC。在其他實施例中，雙功能連接子化合物可以用於在兩步或多步過程中形成ADC。例如，在第一步驟中使半胱胺酸殘基與連接子的反應部分反應，然後在隨後的步驟中使連接子上的官能團與藥物反應，從而形成ADC。
一般來講，這樣選擇連接子上的官能團使得其可以與藥物部分上的合適反應基團特異性反應。作為非限制性例子，基於迭氮化物的部分可以用於與藥物部分上的反應炔基特異性反應。藥物通過迭氮化物與炔基之間的1,3-偶極環加成與連接子共價結合。其他有用的官能團包括例如酮和醛(適合與醯肼和烷氧基胺反應)；膦類化合物(適合與迭氮化物反應)；異氰酸酯和異硫氰酸酯(適合與胺和醇反應)；和活化酯，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(適合與胺和醇反應)。這些和其他連接策略(例如，描述於Bioconjugation Technology(第2版(Elsevier))中的那些)是本領域技術人員熟知的。本領域技術人員可以理解，在選擇互補對的反應官能團用於藥物部分與連接子之間的選擇性反應時，互補對的每個成員都可以用於連接子，並且也可以用於藥物。
本發明進一步提供了用於製備ADC的方法，所述方法可以進一步包括：在足以形成抗體-藥物綴合物(ADC)的條件下，使抗體與藥物-連接子化合物結合。
在某些實施例中，根據本發明的方法包括：在足以形成抗體-連接子綴合物的條件下，使抗體與雙功能連接子化合物結合。在這些實施例中，根據本發明的方法進一步包括：在足以經由連接子將藥物部分與抗體共價連接的條件下，使抗體-連接子綴合物與藥物部分結合。
在一些實施例中，抗體-藥物綴合物(ADC)具有如下的式：
Ab-(LU-D)p
其中：
Ab是抗體；
LU是連接子；
D是藥物；
並且下標p是選自1至8的值。
醫藥組合物和其他用途
CCL1/CCR8信號傳導是包括癌症、炎性疾病和糖尿病性神經病等在內的幾種疾病的發病機制中的重要途徑。特別地，本文所述的抗體以出乎意料的高親和力與CCR8特異性結合並且在某些實施例中具有阻斷CCR8信號傳導的能力，從而抑制CCL1誘導的趨化性。已知CCR8+ Treg細胞對腫瘤逃逸機制有益。在一些態樣，本文提供了通過抑制由CCR8+ Treg細胞等介導的免疫抑制來降低受試者體內存在的腫瘤中腫瘤浸潤性調節性T細胞(TITR)的數量或活性的方法，並且提供了用於經由這種機制治療癌症的醫藥組合物。這樣的癌症包括但不限
於與預後不良相關的乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、胰腺癌和許多其他癌症類型。在一些態樣，本文提供了通過向受試者施用抗CCR8抗體來增加受試者腫瘤中T效應細胞的量的方法。細胞毒性可以是抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。藥劑可以是抗體(例如，肽)小分子、蛋白質藥物綴合物或干擾核酸。另外，本發明還可以調節CCL1/CCR8軸，從而可能治療諸如糖尿病性神經病、脊髓損傷和IgG4相關疾病(諸如硬化性膽管炎(ISC))等疾病。說明性抗體或其抗原結合片段或它們的互補決定區(CDR)的胺基酸序列。
本發明還提供了醫藥組合物，所述醫藥組合物包含本發明的分離的單株抗體或其抗原結合片段和醫藥上可接受的載劑。如本文所用的術語“醫藥組合物＂意指包含本發明的活性成分以及醫藥上可接受的載劑的產品，其中活性成分選自：第一態樣中的分離的單株抗體或其抗原結合片段、第二態樣中的重組蛋白、第三態樣中的分離的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四態樣中的載體、第六態樣中的抗體綴合物、第七態樣中的免疫細胞或它們的組合。本發明的活性成分和包含它們的組合物還可用于製造用於本文提及的治療應用的藥物。
如本文所用的術語“治療＂疾病是指降低受試者所經歷的疾病或障礙的至少一種體征或症狀的頻率或嚴重程度。
所施用的量將取決於諸如待治療的疾病或適應證的類型和程度、患者的整體健康狀況、抗體的體內效力、藥物配製品、抗體的血淸半衰期和施用途徑等變數。
施用頻率可以根據諸如施用途徑、劑量量、抗體或融合蛋白的血淸半衰期和所治療的疾病等因素而變化。
在一些實施例中，本發明的抗體用於非治療目的，諸如診斷測試和測定。例如，抗體可用於確定來自受試者的樣品中的CCR8水準。提供了通過使樣品與本發明的CCR8特異性抗體接觸並檢測樣品中抗體與CCR8之間的免疫反應性的方法。
檢測應用和套組
根據本發明的抗體或其ADC可以用於檢測應用中，例如用於在檢測樣品中使用以提供診斷資訊。
在本發明中，所使用的標本(樣品)包括細胞、組織樣品和活檢標本。在本發明中使用的術語“活檢＂應當包括本領域技術人員已知的所有種類的活檢。因此，在本發明中使用的活檢標本可以包括例如腫瘤的切除樣品以及通過內窺鏡方法或器官的穿刺或針穿刺活檢製備的組織樣品。
在本發明中使用的樣品包括固定或保存的細胞或組織樣品。
本發明進一步提供了套組，所述套組僅包含根據本發明的抗體(或其片段)；在本發明的一個優選例子中，所述套組進一步包括容器、說明書、緩衝液等。在優選例子中，根據本發明的抗體可以固定在測試板上。
根據本發明的另一態樣，通過檢測樣品中CCR8蛋白的存在或量來診斷受試者的CCR8介導的疾病。
本發明提供了用於預測或診斷癌症預後的套組，所述套組包含抗CCR8抗體。本發明的套組可以進一步包含本領域已知的用於ELISA的工具和/或試劑。如果需要，本發明的套組可以進一步包含用於混合各種組分的管、孔板、描述如何使用的說明手冊等。
通過參考以下實例來進一步描述本發明。應當理解，以下實例僅
用於描述本發明，而不是限制本發明的範圍。以下實例中的未指示具體條件的實驗方法通常根據常規條件來進行，所述常規條件例如Sambrook等人，Molecular Cloning：Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件或製造商推薦的條件。除非另外指定，否則百分比和份數是指重量百分比和重量份數。細胞株是市售的或從ATCC購買的常規產品，並且所有質體都是市售的產品。
細胞株：
293F細胞株從Thermo Fisher(R79007)獲得，並且在Expi293 TM表現培養基中培養。
實例1. 抗CCR8單株抗體的產生
通過用過表現CCR8的293F細胞免疫SJL小鼠來開發抗CCR8單株抗體。簡而言之，將293F細胞通過聚凝胺(8μg/mL)用編碼CCR8的慢病毒載體轉染，在含有嘌呤黴素(2μg/mL)的培養基中選擇，並且通過FACS測試CCR8的表現。選擇對CCR8具有最大MFI的單個殖株用於後續研究。
通過標準方法將來自這些小鼠的脾臟和淋巴結細胞與骨髓瘤細胞(SP20)融合以生成產生獨特抗體的雜交瘤。通過基於細胞的ELISA測試含有由這些細胞池產生的抗體的上淸液與過表現CCR8的細胞的反應性。基於細胞的ELISA總體上如下進行。在96孔板中每個孔接種大約3×104個293F-CCR8細胞，並且在過夜培養後，將細胞用1×PBS-T洗滌，之後添加100μL 4%多聚甲醛溶液以將細胞固定並交聯到微孔板上。將細胞用1×PBS-T洗滌兩次。然後將細胞與取自雜交瘤培養物(包括空白和陽性對照)的純上淸液在37℃下一起培育60分鐘。
隨後，將細胞用1×PBS-T洗滌四次。然後將細胞與山羊抗小鼠IgG二抗(在100μL PBS中的1：10000稀釋液)在37℃下一起培育60分鐘，之後用1×PBS-T洗滌四次。將100μL TMB添加到96孔板中。在培育10-12分鐘後，在450nm波長下掃描並檢測板。
然後通過螢光啟動細胞分選(FACS)確認這些陽性殖株的上淸液。FACS分析總體上如下進行。每個樣品製備大約5×105個293F-CCR8細胞，並且將其用小鼠BD Fc Block封閉。將細胞分配到96孔圓底聚苯乙烯板中，並且與取自雜交瘤培養物的純上淸液在冰上一起培育20-30分鐘。接下來，將細胞用PBS/0.5% BSA洗滌並離心。然後將沉澱的細胞樣品與用FITC標記的抗小鼠IgG的二抗(在100μL PBS/0.5% BSA中的1：300稀釋液)在冰上一起培育30分鐘，然後用PBS/0.5% BSA洗滌並離心。將細胞沉澱重新懸浮於PBS/0.5% BSA中，並且在CYTOFLEX(Beckman)上分析樣品。通常，對未轉染的親本細胞的相同上淸液進行測試，以確認反應抗體特異性識別CCR8。
鑒定陽性池並通過有限稀釋進行亞選殖。在三次融合後，獲得產生獨特抗體的九個殖株，所述抗體通過FACS測得特異性識別CCR8過表現細胞，它們是：101E4、172E7、103G4、118H1、170G6、84B4、2P15、3C11、3O20、4M13、2L15、4D24、1G17、3F11、3F6和4G19。雜交瘤以與從中產生的抗體相同的名稱提及(例如，雜交瘤84B4產生抗體84B4)。所有抗CCR8抗體殖株都具有高親和力抗體，它們的VH和VL的胺基酸序列示於表1中。
表1. 殖株C3、G3和G6的抗CCR8抗體的胺基酸序列(其中CDR(包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)加底線並且基於IMGT編號方案)。
表2. 抗體的VH、VL和CDR的序列ID。
實例2. 抗CCR8抗體對表現CCR8的細胞的結合親和力
通過FACS評價抗CCR8抗體的親和力。將293F-CCR8(其具有在細胞表面上表現的高水準CCR8)用於結合測試中。親和力分析總體上如下進行。每個樣品製備大約5×105個293F-CCR8細胞，並且將其用人BD Fc Block封閉。將測試抗體用PBS/0.5% BSA稀釋(從225μg/mL至0.00381μg/mL的1：3系列稀釋液)。將轉染的細胞與未轉染的親本細胞一起分配到96孔圓底聚苯乙烯板中，並且與稀釋的抗體在冰上一起培育20-30分鐘。接下來，將樣品用PBS/0.5% BSA洗滌，並且將細胞離心。將沉澱的細胞樣品與抗小鼠IgG-FITC的二抗(在100μL PBS/0.5% BSA中的1：300稀釋液)在冰上一起培育30分鐘，然後用PBS/0.5% BSA
洗滌，之後沉澱細胞。將細胞沉澱重新懸浮於PBS/0.5% BSA中用於讀數，並且使用CYTOFLEX(Beckman)分析樣品。
結果顯示，這些抗體與過表現人CCR8的293F細胞結合，但是不與沒有CCR8過表現的細胞結合，如圖1所示。圖1A和1B證明這些抗體對過表現CCR8的293F細胞(293F-CCR8)具有結合能力，但是對293F親本細胞沒有結合能力(圖1C和1D)。顯示出結合能力的殖株的EC50總結於表3中：
表3：顯示出結合能力的殖株的EC50
實例3. 抗CCR8抗體阻斷CCL1-CCR8信號
為了確定上述哪些抗體可以阻斷CCL1-CCR8信號，構建Tango-CCR8-Gal4-CHO-K1細胞。將細胞沉澱並且以1×104個細胞/70μL/孔重新懸浮，將細胞分配到96孔板中，在饑餓培養基(F12K、1% FBS、1%青黴素-鏈黴素)中在5% CO2中在37℃下培育6小時，添加測試抗體並且培育1小時，然後添加CCL1(R&D，目錄號：272-I)並且在5% CO2中在37℃下培育24小時。
在過夜培養後，將細胞與ONE-Glo工作試劑在室溫下避光培育10分鐘，然後使用微孔板發光讀數器在560nm下測量每個樣品的相對發光單位(RLU)並進行記錄。
來自殖株(諸如101E4、170G6、3O20、4M13、4D24、3F11、3F6)的抗體顯示出強烈的CCL1-CCR8信號傳導阻斷。來自每個殖株的抗體的信號阻斷能力示於表4中。
表4：抗體的Tango測定結果。
實例4. 抗CCR8抗體的抗腫瘤功效測試
在用人外周血單個核細胞(hu-PBMC，Milestone Biotechnologies)重構的人類化小鼠中評價體內抗腫瘤功效。為了促進研究，建立MDA-MB-231小鼠異種移植模型。將人乳腺癌MDA-MB-231細胞(5×106/小鼠)皮下接種到雌性NCG小鼠前方右側背部的皮膚中。在移植腫瘤的平均大小達到80-100mm3時，選擇腫瘤大小相近的荷瘤小鼠，並且隨機分組，並且經尾靜脈注射2×106個來源於健康供體的hu-PBMC。一小時後，每週一次將CCR8抗體腹膜內注射到小鼠體內。每週兩次用卡尺測量腫瘤大小，並且腫瘤大小按體積(mm3)表示，且公式為：V=0.5a×b2。(a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑)。如圖2(A-E)所示，來自殖株84B4、101E4、170G6、3C11和2P15的抗體具有顯著的抗腫瘤作用，其中P 
0.001。
結果示於圖2中。根據腫瘤生長曲線，與媒劑治療組相比，注射
抗CCR8抗體的小鼠組的腫瘤生長顯著受到抑制(P<0.001)。
實例5. 抗CCR8抗體與獼猴CCR8的結合能力
將293F細胞通過聚凝胺(8μg/mL)用編碼獼猴CCR8的慢病毒載體轉染，在含有嘌呤黴素(2μg/mL)的培養基中選擇，並且通過FACS測試獼猴CCR8的表現。
使用過表現獼猴CCR8的293F細胞株和親本293F細胞株通過流式細胞術研究抗體與獼猴CCR8的特異性結合。結果顯示，抗體84B4、170G6、172E7、3C11、3O20、1G17、3F11和4G19結合表現獼猴CCR8的293F細胞，但是不結合293F細胞。
實例6. 抗體3F11、3O20和1G17的人類化
通過將先導抗體的CDR移植到所選擇的人IgG種系框架中使抗體3F11、3O20和1G17人類化。基於兩個框架(FR)內的序列相似性選擇人種系IGHV3-73*01、IGKV2-28*01、IGHV1-46*01和IGKV2-30*02。為了維持典型的環結構和鏈介面，將人種系框架中的某些殘基回復突變為相應的小鼠殘基(表5)。
電腦預測暗示3F11的CDR中存在高風險序列易感性。例如，3F11的CDR-L1區中存在NG基序。評價輕鏈中N33位置處的一種易感性突變，以查看是否可以在不影響活性的情況下去除VL中的潛在脫醯胺位點。
3F11、3O20和1G17的人類化產生單株抗體3F11hz0、3F11hz1、3F11hz2、3F11hz3、3F11hz4、3F11hz5和3F11hz6；3O20hz0、3O20hz1、3O20hz2和3O20hz3；以及1G17hz0、1G17hz1、1G17hz2和1G17hz3。
表5：3F11、3O20和1G17的人類化
所有優化的抗體都被證實與表現人CCR8的293F結合。抗體3F11、3O20和1G17的人類化形式的親和力常數示於表6中。3F11hz4、3O20hz2、1G17hz3的親和力與嵌合抗體(諸如3F11hz0、3O20hz0、1G17hz0)相似或比它們更好。
表6. 抗CCR8人類化抗體親和力
然後像實例5一樣通過FACS測試3F11hz4、3O20hz2、1G17hz3是否與小鼠CCR8和獼猴CCR8具有交叉反應性。人類化抗體3F11hz4和3F11與小鼠CCR8結合的親和力示於圖3中。在人類化後，3F11hz4與小鼠CCR8結合的親和力從681.9nM增加到1.926nM。在人類化後，3O20hz2和1G17hz3與獼猴CCR8結合的親和力分別為6418nM和3142nM。3O20hz2和1G17hz3顯示出較弱的與獼猴CCR8的結合親和力。
實例7. 人類化抗體的鈣動員測定
鈣動員測定是一種基於細胞的第二信使測定，用於測量與G蛋白偶聯受體啟動或抑制相關的鈣通量。螢光強度的變化與響應於目標受體的配體啟動而釋放到細胞質中的細胞內鈣的量直接相關。使用所述測定來確定上述哪些人類化抗體可以阻斷CCL1-CCR8信號。
在鈣動員測定中使用在培養箱中(37℃，5% CO2)在完全培養基(DMEM培養基、10% FBS、1%青黴素-鏈黴素、0.75μg/mL嘌呤黴素、400μg/mL G418)中傳代的hCCR8-Gqi5-293T細胞(由Genomeditech構建)。
將螢光膜滲透性鈣結合染料(FLIPR Calcium 6測定套組)溶解於測定緩衝液(20mM含1* Hank平衡鹽溶液(HBSS)的HEPES緩衝液，pH 7.4)
中。用含有5mM丙磺舒的染料溶液製備上樣緩衝液。將丙磺舒製備成在1N NaOH中的500mM儲備溶液，然後在使用前在HBSS緩衝液中稀釋至250mM。
將大約1.5*104個hCCR8-Gqi5-293T細胞接種到384孔板中，並且在25μL饑餓培養基(DMEM、1% FBS、1%青黴素-鏈黴素)中在5% CO2中在37℃下培育16小時。然後，用25μL測定緩衝液完全更換饑餓培養基，並且將25μL上樣緩衝液添加到所需孔中。在添加染料後，將細胞板在37℃和5% CO2下培育2小時，然後在室溫下保存直至使用。將12.5μL測定緩衝液中所需濃度(5×)的化合物添加到每個孔中，並且在室溫下與細胞一起培育30分鐘。在培育後，將微孔板轉移到FLIPR儀器中，並且如儀器的使用者指南中所述開始鈣測定。在測定過程中添加12.5μL含有或不含CCL1的測定緩衝液。將MAX比率值對抗體濃度作圖，並且在GraphPad Prism中進行分析以生成濃度曲線。
所有人類化抗體都顯示出CCL1-CCR8信號傳導阻斷，並且3F11hz4顯示出最強的CCL1-CCR8信號傳導阻斷。本文公開的代表性抗體的信號傳導阻斷能力示於表7中。
表7：人類化抗CCR8抗體的鈣動員測定結果。
實例8. 人類化抗體穩定性驗證
單株抗體本質上是蛋白質，並且容易出現不穩定性問題。單株抗體的穩定性測試是它們作為治療性生物分子進行開發和商業化的關鍵監管要求。
在表8所示的應激條件下測試人類化抗體(諸如3F11hz4、3O20hz2、1G17hz3)的穩定性和活性。
表8. 穩定性測試項
以與實例2和7類似的方式，進行人類化抗體在不同時間點的結合親和力和鈣動員。結果示於表9中。3F11hz4顯示出比其他人類化抗體更好的穩定性。
表9：人類化抗體在應激條件下的親和力EC50和鈣動員IC50
實例9. 3F11hz4與293F/CHOK1大鼠、狗、小鼠和獼猴CCR8的交叉反應性
將293F細胞通過聚凝胺(8μg/mL)用編碼大鼠和狗CCR8的慢病毒載體轉染，在含有嘌呤黴素(2μg/mL)的培養基中選擇，並且通過FACS測試大鼠和狗CCR8的表現。將CHOK1細胞通過聚凝胺(8μg/mL)用編碼小鼠CCR8的慢病毒載體轉染，在含有嘌呤黴素(6μg/mL)的培養基中選擇，並且通過FACS測試小鼠CCR8的表現。
使用過表現人、大鼠、狗、小鼠和獼猴CCR8的293F細胞株或CHOK1細胞株和親本293F細胞株或CHOK1細胞株，通過流式細胞術研究人類化抗體與人、大鼠、狗、小鼠和獼猴CCR8的特異性結合。
結果示於圖4A-4E中。根據結合親和力，3F11hz4結合表現人(4A)、大鼠(4B)、狗(4C)、小鼠(4D)和獼猴(4E)CCR8的HEK293/CHOK1細胞，但是不結合親本細胞。
實例10. 人類化單株抗體的表位分析
分析人、大鼠、狗、小鼠和獼猴CCR8序列。結果顯示，人、大鼠、狗、小鼠和獼猴CCR8的ECD2區相似(表10)。假設3F11hz4人類化抗體與ECD2結合，通過在293F細胞中暫態表現ECD2的每個突變體並使突變體與人類化3F11hz4抗體的抗體溶液反應來進行結合評價，所述抗體溶液通過從25μg/mL開始進行14次系列稀釋3倍製備而來。在4℃下反應1小時後，使其與Alexa Fluor 488親和純山羊抗人Ig(H+L)(Jackson，109-545-003)反應，並且進行流式細胞術分析。假設連續稀釋液的最高MFI為100%，根據以下公式計算抑制百分比。
抑制%=(最高MFI-MFI)/最高MFI * 100%
結果示於圖5A-B和表11中。與人CCR8相比，CCR8中97個胺基酸的突變體可以將EC50從0.2335nM提高到23.96nM。
表10：CCR8基因同源性
表11. 3F11hz4在突變體CCR8中的結合活性
實例11. 3F11hz4人類化抗體與人CCR4和人CX3CR1結合的研究
通過流式細胞術測試3F11hz4人類化抗體與過表現CCR4和CX3CR1的細胞的結合。簡而言之，將293F細胞通過聚凝胺(8μg/mL)用編碼人CCR4和CX3CR1的慢病毒載體轉染，在含有嘌呤黴素(2μg/mL)的培養基中選擇，並且使用CCR4(Biolegend，359408)和CX3CR1(Biolegend，341610)抗體通過FACS測試人CCR4和CX3CR1的表現。通過在293F細胞中表現人CCR4和
CXCR1並使細胞與人類化3F11hz4抗體的抗體溶液反應來進行結合評價，所述抗體溶液通過從25μg/mL開始進行14次系列稀釋3倍製備而來。在4℃下反應1小時後，使其與Alexa Fluor 488親和純山羊抗人Ig(H+L)(Jackson，109-545-003)反應，並且進行流式細胞術分析。
如圖6A-6B所示，人類化3F11hz4抗體結合表現人CCR8的293F細胞(4A)，但是不結合表現人CCR4(6A)、人CX3CR1(6B)的293F細胞或293F細胞(4A)。
實例12. 3F11hz4人類化抗體與其他CCR8抗體比較
研究本文公開的抗體3F11hz4人類化抗體和其他現有技術CCR8抗體的結合親和力、物種交叉反應性和信號傳導阻斷。根據相關參考文獻產生和表徵現有技術CCR8抗體。具體地，通過CHO細胞表現Gilead(WO 2021163064)、Shionogi(EP3903817A1)、Surface(SRF-114)和Bayer(TPP-23411，WO 2021152186)的CCR8抗體序列。通過親和力(EC50)、物種交叉反應性和鈣動員(IC50)比較各種抗體。結果示於表12中。
表12：3F11hz4當前競爭物比較結果
如表12所示，3F11hz4在結合親和力、物種交叉反應性和信號阻斷Ca2+方面顯示出優勢。
實例13. 3F11hz4抗體在CD34人類化小鼠中的抗腫瘤功效
hu-HSC-NPG人免疫系統小鼠模型的製備和檢測：將4週齡的雌性NPG小鼠用X射線生物輻照器輻照4-24h，並且通過尾靜脈注射來源於臍帶血的CD34+造血幹細胞。在移植後十六週，通過眼眶收集血液樣品，並且用EDTA-Na2抗凝管收集血液樣品。使用流式細胞術來分析動物外周血中人CD45、CD3、CD4和CD8陽性細胞的含量，以確定所植入的人T細胞的比例。選擇具有高T細胞植入率的hu-HSC-NPG來建立荷瘤模型。
腫瘤接種：將肺癌(HCC827)培養並擴增至足夠數量，懸浮於PBS溶液中，並且以5×106個細胞/0.2ml的劑量注射到背側皮下區域中。每輪實驗共接種45只小鼠，並且在皮下腫瘤淸晰可見時觀察體積。在7-14天后，皮下腫瘤長到50-100mm3。移出一些皮下腫瘤過大或過小的小鼠，並且隨機分為4組，每組10只小鼠。如下分類：第1組：IgG1 10 mpk，iv，biw；第2組：CCR8-Ab-IgG1 1 mpk，iv，biw；第3組：CCR8-Ab-IgG1 3 mpk，iv，biw；第4組：CCR8-Ab-IgG1 10 mpk，iv，biw。用CCR8抗體靜脈內(I.V.)注射動物。根據皮下腫瘤的生長速度，每週兩次施用抗體，共施用5-6次。每週兩次測量皮下腫瘤的體積和小鼠的體重。腫瘤體積計算公式：體積=長徑×短徑×短徑/2。
統計方法：使用資料分析GraphPad Prism 8.0統計分析軟體來分析在CCR8抗體治療組與同種型對照組之間皮下腫瘤體積是否存在統計差異。首先，對資料進行正態分佈和方差齊性檢定。符合正態分佈(P>0.20)和方差齊性(P>0.10)：通過單因素方差分析方法檢定多組之間的比較，並且P<0.05被認為統計上顯著；如果不符合正態分佈或方差，則使用非參數檢定的kruskal-Wallis H方
法進行分析。如下計算腫瘤體積抑制率(TGI)：TGI=100%×[1-RTV(實驗組)/RTV(對照組)]。
結論：3F11hz4抗體對皮下肺癌(HCC827細胞株)的劑量依賴性抗腫瘤作用已經在CD34人類化動物模型中得到證實(圖7)。
實例14. 3F11hz4抗體在同基因模型中的抗腫瘤功效
在實體瘤模型(諸如肺癌和肝癌)中，研究3F11hz4的劑量-效應關係，以探索最低有效劑量和最大有效劑量。
肺癌和肝癌的同基因移植腫瘤模型在小鼠中的體內功效驗證：每輪實驗準備50只8週齡的雌性小鼠。將1 x 106個小鼠肺癌(LLC)和肝癌(H22)細胞在200μL PBS中皮下接種於小鼠腹部右側，並且將接種日期記錄為第0天。在4-7天后，皮下腫瘤長到50-100mm3。根據皮下腫瘤的體積，移出一些皮下腫瘤過大或過小的小鼠，並且隨機分為4組，每組10只小鼠。如下分類：第1組：mIgG2a 10 mpk，ip，biw；第2組：CCR8-Ab-mIgG2a 1 mpk，ip，biw；第3組：CCR8-Ab-mIgG2a 3 mpk，ip，biw；第4組：CCR8-Ab-mIgG2a 10 mpk，ip，biw。用CCR8抗體腹膜內(I.P.)注射動物。根據皮下腫瘤的生長速度，每週兩次施用抗體，共施用3-6次。每週兩次測量皮下腫瘤的體積和小鼠的體重。腫瘤體積計算公式：體積=長徑×短徑×短徑/2。使用GraphPad軟體來分析在CCR8抗體治療組與同型對照組之間皮下腫瘤體積是否存在統計差異。
結論：3F11hz4抗體對皮下肺癌(HCC827細胞株)的劑量依賴性抗腫瘤作用已經在CD34人類化動物模型中(圖7)以及在小鼠肝癌(H22細胞株)和同基因小鼠肺癌(LLC細胞株)中(圖8和9)得到證實。
實例15. Treg細胞遷移測試
Treg細胞遷移測試：通過磁珠分選方法富集小鼠H22皮下腫瘤中的CD4+CD25+Treg細胞，並且使用CCR8抗體流式細胞術來檢測富集的Treg細胞的CCR8表現率，並且在CCR8表現率大於80%時進行遷移測試。將CD4+CD25+Treg細胞用饑餓培養基1640+1% FBS(Ce)+1% P/S處理3h。收集細胞，離心計數，並且在1640+0.5% BSA培養基中懸浮至2.66 x 106/mL。用遷移培養基1640+0.5% BSA+1% P/S稀釋CCR8抗體：首先，將2μL 10mg/mL CCR8抗體添加到998μL 1640+0.5% BSA+1% P/S培養基中，並且稀釋至50μg/mL；根據5倍6個點的梯度稀釋設置無CCR8抗體的陽性對照組。將75μL稀釋的CCR8抗體與75μL細胞懸浮液混合，置於37℃培養箱中，並且培育30min。將CCL1用遷移培養基1640+0.5% BSA+1% P/S稀釋(每8個孔1mL)。將100μL 10ng/mL CCL1稀釋液預先添加到Transwell板的下層中。將75μL與CCR8抗體共培育的細胞添加到Transwell板的上層中。在37℃培養箱中培養3小時。通過流式細胞術對下層細胞的數量進行計數，並且將高速設置為60ul/min和1min。GraphPad Prism處理資料以分析CCR8抗體對Treg細胞遷移的抑制程度。
結論：使用選自H22肝癌皮下腫瘤組織的Treg細胞來驗證CCR8抗體可以抑制Treg細胞的遷移(圖10)。
將在本發明中提及的所有檔都通過引用併入本申請，其程度如同每個單獨檔被具體且單獨地指示通過引用併入一樣。另外，應當理解，在閱讀本發明所教導的內容後，本領域技術人員可以對本發明進行各種修改和改變，並且這些等效方案也落入申請專利範圍所限定的範圍內。
Claims (36)
- 一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含至少一個重鏈可變區，所述重鏈可變區包含選自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：a)SEQ ID NO：58、79和80；或b)SEQ ID NO：2、3和4；或c)SEQ ID NO：2、3和10；或d)SEQ ID NO：2、16和17；或e)SEQ ID NO：22、23和24；或f)SEQ ID NO：32、33和34；或g)SEQ ID NO：40、41和42；或h)SEQ ID NO：47、48和49；或i)SEQ ID NO：40、3和55；或j)SEQ ID NO：58、59和60；或k)SEQ ID NO：58、3和63；或l)SEQ ID NO：2、3和67；或m)SEQ ID NO：72、73和74；或n)SEQ ID NO：58、83和84；或o)SEQ ID NO：58、83和88；或並且包含至少一個輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含選自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：a)SEQ ID NO：6、7和14；或b)SEQ ID NO：6、7和8；或c)SEQ ID NO：12、7和14；或d)SEQ ID NO：19、7和14；或e)SEQ ID NO：26、20和27；或f)SEQ ID NO：30、20和27；或g)SEQ ID NO：36、37和38；或h)SEQ ID NO：44、37和45；或i)SEQ ID NO：51、52和53；或j)SEQ ID NO：6、7和8；或k)SEQ ID NO：65、7和14；或l)SEQ ID NO：69、70和13；或m)SEQ ID NO：76、37和77；或n)SEQ ID NO：86、7和14，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR8；並且以上胺基酸序列中的任一個進一步包括通過任選地添加、缺失、修飾和/或取代1-5(或1、2、3)個胺基酸而形成並且能夠保留CCR8結合能力的衍生序列。
- 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含選自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：a)SEQ ID NO：58、79、80、6、7和14；或b)SEQ ID NO：2、3、4、6、7和8；或c)SEQ ID NO：2、3、10、12、7和14；或d)SEQ ID NO：2、16、17、19、7和14；或e)SEQ ID NO：22、23、24、26、20和27；或f)SEQ ID NO：22、23、24、30、20和27；或g)SEQ ID NO：32、33、34、36、37和38；或h)SEQ ID NO：40、41、42、44、37和45；或i)SEQ ID NO：47、48、49、51、52和53；或j)SEQ ID NO：40、3、55、6、7和8；或k)SEQ ID NO：58、59、60、6、7和14；或l)SEQ ID NO：58、3、63、65、7和14；或m)SEQ ID NO：2、3、67、69、70和13；或n)SEQ ID NO：72、73、74、76、37和77；或o)SEQ ID NO：58、83、84、86、7和14；或p)SEQ ID NO：58、83、88、86、7和14。
- 如請求項1或2所述的抗體，其中所述重鏈進一步包括重鏈恒定區和/或所述輕鏈進一步包括輕鏈恒定區。
- 如請求項1或2所述的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區進一步包含人或人類化架構區，和/或所述抗體的輕鏈可變區進一步包含人或人類化架構區。
- 如請求項1或2所述的抗體，其中所述多肽序列選自：a)具有SEQ ID NO：96的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：97的多肽序列的輕鏈可變區；或b)具有SEQ ID NO：78的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：81的多 肽序列的輕鏈可變區；或c)具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的輕鏈可變區；或d)具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：11的多肽序列的輕鏈可變區；或e)具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：18的多肽序列的輕鏈可變區；或f)具有SEQ ID NO：21的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：25的多肽序列的輕鏈可變區；或g)具有SEQ ID NO：28的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：29的多肽序列的輕鏈可變區；或h)具有SEQ ID NO：31的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：35的多肽序列的輕鏈可變區；或i)具有SEQ ID NO：39的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：43的多肽序列的輕鏈可變區；或j)具有SEQ ID NO：46的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：50的多肽序列的輕鏈可變區；或k)具有SEQ ID NO：54的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：56的多肽序列的輕鏈可變區；或l)具有SEQ ID NO：57的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：61的多肽序列的輕鏈可變區；或m)具有SEQ ID NO：62的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：64的多 肽序列的輕鏈可變區；或n)具有SEQ ID NO：66的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：68的多肽序列的輕鏈可變區；或o)具有SEQ ID NO：71的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：75的多肽序列的輕鏈可變區；或p)具有SEQ ID NO：82的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：85的多肽序列的輕鏈可變區；或q)具有SEQ ID NO：87的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：89的多肽序列的輕鏈可變區；或r)具有SEQ ID NO：90的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：91的多肽序列的輕鏈可變區；或s)具有SEQ ID NO：92的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：93的多肽序列的輕鏈可變區；或t)具有SEQ ID NO：94的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：95的多肽序列的輕鏈可變區；或u)具有SEQ ID NO：92的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：98的多肽序列的輕鏈可變區；或v)具有SEQ ID NO：92的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：99的多肽序列的輕鏈可變區；或w)具有SEQ ID NO：100的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：101的多肽序列的輕鏈可變區；或x)具有SEQ ID NO：102的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：103的 多肽序列的輕鏈可變區；或y)具有SEQ ID NO：104的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：105的多肽序列的輕鏈可變區；或z)具有SEQ ID NO：106的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：107的多肽序列的輕鏈可變區；或aa)具有SEQ ID NO：108的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：109的多肽序列的輕鏈可變區；或bb)具有SEQ ID NO：110的多肽序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：111的多肽序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1-5中任一項所述的抗體，其中所述抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO：1、9、15、21、28、31、39、46、54、57、62、66、71、78、82、87、90、92、94、96、100、102、104、106、108或110至少()85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO：5、11、18、25、29、35、43、50、56、61、64、68、75、81、85、89、91、93、95、97、98、99、101、103、105、107、109或111至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的多肽序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1-6中任一項所述的抗體，其中所述抗體是單株抗體、重組抗體、人抗體、人類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或其抗體片段。
- 如請求項7中任一項所述的抗體，其中所述抗體選自：(i)單鏈抗體、單鏈可變片段(scFv)、缺乏鉸鏈區的單價抗體或微抗體；(ii)Fab、Fab' 或F(ab')2片段；(iii)全抗體；和(iv)包含人IgG Fc結構域的抗體。
- 如請求項7所述的抗體，其中所述抗體是人的或人類化的。
- 如請求項1或2所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是能夠結合人CCR8的CCR8特異性抗體。
- 如請求項10所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是能夠結合人CCR8並阻斷CCL1-CCR8信號傳導的CCR8特異性抗體。
- 一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段在包含選自人CCR8的Y94至K107的一個或多個胺基酸殘基的表位處與CCR8特異性結合。
- 如請求項12所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段在包含選自人CCR8的Y94、L95、L96、D97、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一個或多個胺基酸殘基的表位處與人CCR8特異性結合。
- 如請求項13所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段在包含選自人CCR8的Y94、L95、L96、Q98、V100、T103、V104、M105和K107的一個胺基酸殘基的表位處與人CCR8特異性結合。
- 一種重組蛋白，所述重組蛋白包含：(i)如請求項1-14中任一項所述的抗體或其抗原結合片段；和(ii)有助於表現和/或純化的任選標籤序列。
- 一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼如請求項1-14中任一項所述的抗體或抗原結合片段或如請求項15所述的重組蛋白。
- 一種載體，所述載體包含如請求項16所述的分離的核酸分子。
- 如請求項17所述的載體，所述載體包括細菌質體，噬菌體，酵母質體，植物細胞病毒，哺乳動物細胞病毒諸如腺病毒、慢病毒或反轉錄病毒。
- 一種工程化宿主細胞，所述工程化宿主細胞在其基因組中包含如請求項16所述的核酸，或包含如請求項17所述的載體。
- 一種足以用作雜交探針、PCR引物或測序引物的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸是如請求項16所述的核酸分子或其互補序列的片段。
- 一種抗體綴合物，所述抗體綴合物包含：(i)選自如請求項1-14中任一項所述的抗體或抗原結合片段或如請求項15所述的重組蛋白或其組合的抗體部分；和(ii)與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，其中所述偶聯部分選自可檢測標籤、藥物、毒素、細胞介素、放射性核素、酶或其組合。
- 一種醫藥組合物，所述醫藥組合物包含(i)如請求項1-14中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如請求項15所述的重組蛋白、如請求項16所述的分離的核酸分子、如請求項17所述的載體、如請求項21所述的抗體綴合物或它們的組合，和(ii)醫藥上可接受的載劑。
- 如請求項22所述的醫藥組合物，其中所述抗CCR8的抗體具有去除腫瘤浸潤性Treg細胞的作用。
- 一種用於治療由CCR8和/或CCL1介導的疾病的方法，所述方法包括將有效量的如請求項1-14中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如請求項15所述的重組蛋白、如請求項16所述的分離的核酸分子、如請求項17所述的載體、如請求項21所述的抗體綴合物或如請求項22所述的醫藥組合物施用給有需要的受試者。
- 如請求項24所述的方法，其中所述疾病是癌症。
- 如請求項25所述的方法，其中所述疾病是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌或胰腺癌。
- 如請求項24所述的方法，其中所述疾病是神經性疼痛。
- 如請求項27所述的方法，其中所述神經性疼痛是由糖尿病或脊髓損傷誘發的。
- 如請求項24所述的方法，其中所述疾病是IgG4相關疾病。
- 如請求項26所述的方法，其中所述IgG4相關疾病是IgG4相關硬化性膽管炎。
- 一種確定受試者的CCR8水準的方法，所述方法包括(a)從所述受試者獲得樣品；(b)使所述樣品與如請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段接觸；以及(c)確定所述受試者的CCR8水準。
- 活性成分用於(a)製備診斷試劑或套組；和/或(b)製備用以預防和/或治療與CCR8相關的疾病的藥物的用途，其中所述活性成分選自如請求項1-14中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如請求項15所述的重組蛋白、如請求項16所述的分離的核酸分子、如請求項17所述的載體、如請求項20所述的抗體綴合物以及它們的組合。
- 如請求項32所述的用途，其中所述疾病是癌症。
- 如請求項33所述的用途，其中所述疾病是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌或胰腺癌。
- 一種檢測套組，所述檢測套組包含：(i)含有如請求項1-14中任一項所述的抗體作為一抗的第一容器；和(ii)含有抗所述一抗的二抗的第二容器。
- 一種用於製備如請求項1-10中任一項所述的重組多肽的方法，所述方法包括：(i)在適合表現的條件下培養工程化宿主細胞；以及(ii)從所述培養物中分離重組多肽，其中所述重組多肽是抗體、其抗原結合片段或重組蛋白。
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