CN117603332A - 重组人ny-eso-1蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人NY‑ESO‑1蛋白的制备方法及其应用。提供了一种重组人NY‑ESO‑1蛋白的制备方法。利用本方法制备NY‑ESO‑1蛋白简化了操作流程，提高了培养产物利用率和重组人NY‑ESO‑1蛋白产率，能够高效表达、生产重组人NY‑ESO‑1蛋白，获得的重组人NY‑ESO‑1蛋白的纯度高、免疫活性高。

Description

重组人NY-ESO-1蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物工程技术领域，具体地说，是关于一种重组人NY-ESO-1蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤已严重影响生命健康。大量研究表明，多数肿瘤组织具有区别于正常组织的肿瘤抗原,肿瘤抗原有望用作肿瘤疫苗的免疫原、免疫治疗的靶点、早期筛查或诊断及预后的生物标志物。这些抗原中，癌-睾丸抗原(Cancer-testis antigens，即CT抗原)，又称为肿瘤共享抗原，被证明具有广泛的免疫原性，是一类在多种肿瘤组织中表达而在正常组织中除睾丸外不表达的抗原。NY-ESO-1被认为是CT抗原中免疫原性最强的肿瘤抗原。
NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)基因位于人染色体Xq28上，编码180个氨基酸，组成的蛋白质分子量约18kDa，在多种肿瘤中表达，包括食管癌、乳腺癌、肺癌等，但在正常组织中，仅在睾丸中表达。NY-ESO-1蛋白可以激发细胞和体液的双重自体免疫反应，Jager等人利用NY-ESO-1蛋白对肿瘤晚期患者进行免疫治疗，结果表明NY-ESO-1抗原疫苗对部分转移灶有消退作用。研究显示晚期患者NY-ESO-1基因的表达及自身抗体均明显高于早期患者，近年来已有部分技术采用ELISA检测自身抗体来进行癌症的辅助诊断。Yoko Oshima等人研究显示NY-ESO-1自身抗体可以作为胃癌的特异性生物标志物。Chapman等人采用7个(p53，NY-ESO-1，CAGE，GBU4-5，MAGE-A4，SOX2，Hu-D)自身抗体联合辅助诊断肺癌患者。NY-ESO-1抗原疫苗、NY-ESO-1自身抗体检测均依赖于高纯度、高免疫活性的NY-ESO-1蛋白。
NY-ESO-1蛋白N端区富含甘氨酸、C端区极端疏水，蛋白极端疏水。NY-ESO-1蛋白中存在二硫键并形成聚合物结构，这对于NY-ESO-1抗原的免疫原性具有重要影响。并且，NY-ESO-1蛋白羧基端157-165抗原肽中的半胱氨酸残基易被氧化，在非还原和非分解条件下NY-ESO-1蛋白极易形成多聚体形式，进而产生沉淀。因此，本领域在NY-ESO-1蛋白的良好或高效表达方面存在需要克服的技术瓶颈。
本领域目前在生产上应用的大肠杆菌基因工程菌几乎都是诱导型表达系统，通过温度诱导、化学诱导剂等诱导外源蛋白的表达，存在一些不利之处，例如：添加价格昂贵的诱导剂加大了生产成本，诱导后短时间内产生大量的外源蛋白，容易形成包涵体。一般形成的外源蛋白中50％以上为没有生物学活性的包涵体蛋白，有的甚至超过80％。形成包涵体蛋白后，需要后续烦琐的复性步骤，部分蛋白才能恢复生物学活性，但是复性步骤工作量很大，进一步提高了外源蛋白的生产成本。
尽管组成型大肠杆菌基因工程菌可以克服上述种种缺点，可降低成本且防止外源蛋白形成包涵体，但是组成型大肠杆菌基因工程菌中含有质粒的细胞与失去质粒的细胞相比，过重的代谢负担使得二者的比生长速率相差很大，极易导致培养过程中丢失质粒的细胞成为优势群体，质粒稳定性下降，产量降低。由于组成型大肠杆菌基因工程菌发酵过程优化比较困难，本领域人员一般认为组成型表达系统不适合用于工业规模生产。
此前，在Sacha Gnjatic、汤蕾、张文敏、江华等人的工作中，均采用LB培养基培养大肠杆菌、IPTG诱导表达、8M尿素溶解包涵体并亲和纯化的方式制备NY-ESO-1蛋白。然而，此类培养时需多次测定菌体丰度以确保在适宜时间加入诱导剂，而诱导剂具有毒性导致菌体生长速度减缓、培养产物细菌丰度上限偏低。NY-ESO-1蛋白在非还原和非分解条件下具有形成多聚体形式的强烈倾向，天然形态NY-ESO-1蛋白末端亲和标签未充分暴露，菌体裂解上清中NY-ESO-1蛋白难以亲和纯化，纯化所得蛋白浓度较低，难以满足需求。包涵体中NY-ESO-1蛋白的纯化则往往经过高浓度变性剂处理完全失去天然形态，难以获得较高的复性蛋白产率。
因此，本领域需要进一步优化NY-ESO-1蛋白的重组表达策略，以期实现高效、低损失的生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人NY-ESO-1蛋白的制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种重组表达人NY-ESO-1蛋白的方法，包括：
(1)提供重组大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞中包含重组表达盒，该重组表达盒含有人NY-ESO-1蛋白编码序列；
(2)培养(1)的重组大肠杆菌细胞，从而表达人NY-ESO-1蛋白；表达后进行细胞裂解，获得裂解产物；
(3)利用温和促溶剂处理(2)的裂解产物；以含有温和促溶剂的纯化缓冲液纯化，获得蛋白纯化产物；其中，所述温和促溶剂包括：0.5～3M(如0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8M)尿素，0.2～3％(如0.3％、0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％)丙醇，10～120mM(如15、20、30、50、60、80、100mM)甘氨酸；
(4)对蛋白纯化产物进行复性，获得活性人NY-ESO-1蛋白。
在一种或多种实施方式中，所述人NY-ESO-1蛋白编码序列通过人工合成的方法制备。
在一种或多种实施方式中，所述的重组表达盒位于表达载体中。
在一种或多种实施方式中，所述的表达载体是pET表达载体。
在一种或多种实施方式中，所述的大肠杆菌细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。
在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，利用自诱导培养基培养，所述自诱导培养基不含有化学诱导剂如IPTG；较佳地，所述自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，Na2HPO4，NH4Cl，KH2PO4，Na2SO4，MgSO4。
在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，首先在37±3℃、较佳地37±2℃、更佳地37±1℃的温度条件下培养；之后，更换为在17±3℃、较佳地17±2℃、更佳地17±1℃的温度条件下培养。
在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，首先在37±3℃、较佳地37±2℃、更佳地37±1℃的温度条件下培养；在培养5±2小时、较佳地5±1小时、更佳地5±0.5小时后，更换为在17±3℃、较佳地17±2℃、更佳地17±1℃的温度条件下培养20±5小时、较佳地20±4小时、更佳地20±3小时。
在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，所述培养为摇床培养，在220±100rpm，较佳地220±60rpm，更佳地220±30rpm条件下培养。
在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，进行表达后，富集(如通过离心收集)细胞，之后进行细胞裂解。
在一种或多种实施方式中，自诱导培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，乳糖2g/L，葡萄糖0.5g/L，Na2HPO4 25mmol/L，NH4Cl 50mmol/L，KH2PO4 25mmol/L，Na2SO4 5mmol/L，MgSO4 2mmol/L，其中各组分的用量可上下浮动60％以内、50％以内、40％以内、30％以内、20％以内、10％以内或5％以内。
在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，采用足以使得细胞裂解的裂解缓冲液处理菌体，使得细胞裂解(菌体裂解)；较佳地，所述裂解缓冲液包含有效量的：磷酸盐，氯化钠，甘油，TCEP，PMSF；较佳地，所述裂解缓冲液为pH7.5±0.5(较佳地pH7.5±0.3，更佳地pH7.5±0.2或pH7.5±0.1)。
在一种或多种实施方式中，裂解缓冲液处理后，进行细胞的物理破碎；更佳地，在冰浴条件下进行超声破碎。
在一种或多种实施方式中，裂解产物中加入核酸酶和MgCl2，25±3℃(较佳地，25±2℃或25±1℃)孵育。
在一种或多种实施方式中，所述裂解缓冲液包括：
磷酸盐：20±5mM(较佳地20±3mM，更佳地20±2mM)；
氯化钠：500±100mM(较佳地，500±70mM，更佳地500±30mM)；
甘油：5±2％(v/v)(较佳地，5±0.5％，更佳地5±1％后5±0.5％)；
TCEP：1±0.6mM(较佳地，1±0.5mM，更佳地1±0.3mM)；
PMSF：1±0.6mM(较佳地，1±0.5mM，更佳地1±0.3mM)。
在一种或多种实施方式中，所述超声破碎的功率200±50W，超声4±1s，停6±1s，共超声15±5min。
在一种或多种实施方式中，在25±3℃(较佳地，25±2℃或25±1℃)孵育的时间为10±5分钟(较佳地，10±3分钟，更佳地10±2分钟)。
在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，所述温和促溶剂包括：0.5～3M(如0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8M)尿素，0.2～3％(如0.3％、0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％)丙醇，10～120mM(如15、20、30、50、60、80、100mM)甘氨酸。
在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，利用温和促溶剂处理时，进行低温振荡；之后，离心分离沉淀和上清，获取上清。较佳地，低温振荡2±1h(较佳地，2±0.6h；更佳地2±0.3h)。
在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，所述纯化缓冲液包括：温和促溶剂、磷酸盐、氯化钠、甘油、咪唑；较佳地，所述纯化缓冲液为pH7.5±0.5(较佳地pH7.5±0.3，更佳地pH7.5±0.2或pH7.5±0.1)。
在一种或多种实施方式中，所述纯化缓冲液包括：20±6mM(较佳地20±4mM，更佳地20±2mM)磷酸盐，500±100mM(较佳地500±80mM，更佳地500±400mM)氯化钠，5±1％(较佳地5±0.8％，更佳地5±0.4％)甘油，10±5mM(较佳地10±3mM，更佳地10±2mM)咪唑。
在一种或多种实施方式中，所述纯化缓冲液包括：0.5～3M(如0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8M)尿素，0.2～3％(如0.3％、0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％)丙醇，10～120mM(如15、20、30、50、60、80、100mM)甘氨酸。
在一种或多种实施方式中，步骤(4)中，采用蛋白透析的方法进行复性；较佳地，所述复性在6±3℃(较佳地6±2℃或6±1℃)下进行；较佳地，透析时在蛋白溶液中加入1±0.5mM(优选1±0.3，1±0.2mM)PMSF。
在一种或多种实施方式中，依次采用下组的蛋白复性缓冲液进行复性：
透析缓冲液1：50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10％Glycerol,2M Urea,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5；
透析缓冲液2：50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10％Glycerol,1M Urea,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5；
透析缓冲液3：50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10％Glycerol,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5；
透析缓冲液4：10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,2.7mM KCl,150mM NaCl,10％Glycerol,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5；
上述透析缓冲液中，各个组分的用量可上下浮动50％以内、40％以内、30％以内、20％以内、10％以内、5％以内；
在一种或多种实施方式中，上述透析缓冲液中，pH值可±0.5，±0.3，±0.2，±0.1。
在一种或多种实施方式中，所述人NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；较佳地，所述人NY-ESO-1蛋白的编码序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于重组表达人NY-ESO-1蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种用于重组表达人NY-ESO-1蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)温和促溶剂，包括：0.5～3M尿素，0.2～3％丙醇，10～120mM甘氨酸；(b)重组大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞中包含重组表达盒，该重组表达盒含有人NY-ESO-1蛋白编码序列。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括：(c)自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，Na2HPO4，NH4Cl，KH2PO4，Na2SO4，MgSO4。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括：(d)裂解缓冲液；较佳地，所述裂解缓冲液包含有效量的：磷酸盐，氯化钠，甘油，TCEP，PMSF。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括：(e)核酸酶和MgCl2。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括：(f)纯化缓冲液；较佳地其包括：温和促溶剂、磷酸盐、氯化钠、甘油、咪唑；较佳地，所述纯化缓冲液为pH7.5±0.5。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒在重组表达人NY-ESO-1蛋白中的应用。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、使用温和促溶剂(2M尿素，1％丙醇，50mM甘氨酸)促溶、纯化所得NY-ESO-1蛋白透析复性产物SDS-PAGE检测。
图2、使用8M尿素促溶、纯化所得NY-ESO-1蛋白透析复性产物SDS-PAGE检测。
图3、透析复性蛋白与未复性蛋白用于人血清中NY-ESO-1特异性IgG抗体检测对比。
图4、微孔板中测定复性蛋白免疫活性，以Anti-NY-ESO-1(多克隆抗体)稀释比例对数为横坐标、信号值为纵坐标拟合四参数曲线。
具体实施方式
为了克服本领域难以高效获得高活性重组人NY-ESO-1蛋白的问题，本发明人经过深入的研究，提供了一种重组人NY-ESO-1蛋白的制备方法。利用本方法制备NY-ESO-1蛋白简化了操作流程，提高了培养产物利用率和重组人NY-ESO-1蛋白产率，能够高效表达、生产重组人NY-ESO-1蛋白，获得的重组人NY-ESO-1蛋白的纯度高、免疫活性高。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用，所述的试剂盒是指一种便于商业规模化生产和使用的包装/包装盒，其中通常含有容器/小包装，本发明的培养基、溶液、单组分或者组分可被置于所述的容器/小包装中。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽/蛋白(本发明中为人NY-ESO-1蛋白)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下外源的元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的“操作性相连”或“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞来说是“外源的”。
本发明中，所述人NY-ESO-1蛋白可以是全长、活性片段，也可以是其类似物或衍生物。如本领域所知的，少数氨基酸或氨基酸序列的取代、缺失或插入，不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明涉及与上述功能多肽的同源序列，较佳地同源性为70％以上、80％以上、90％以上、93％以上、95％以上或97％以上，更佳的，例如91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，这些多肽变体也具有与前述多肽相似的功能。
在优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：1)合成人NY-ESO-1全基因；2)NY-ESO-1全基因片段克隆至表达载体；3)构建重组菌，自诱导培养基中培养重组菌进行NY-ESO-1蛋白表达；4)温和促溶剂处理菌体裂解产物；5)亲和层析法纯化NY-ESO-1蛋白；6)复性NY-ESO-1蛋白。本发明的一种重组人NY-ESO-1蛋白的制备方法，利用大肠杆菌和自诱导培养基大量表达重组人NY-ESO-1蛋白，并使用温和促溶剂纯化NY-ESO-1蛋白，提高了重组人NY-ESO-1蛋白产率，能够高效表达、生产重组人NY-ESO-1蛋白，获得的重组人NY-ESO-1蛋白的纯度高、免疫活性高。
在优选的实施方式中，所述的重组质粒构建步骤如下：1)优化在大肠杆菌中表达重组NY-ESO-1蛋白的密码子，合成优化的基因片段；2)基因片段连接至表达载体，编码的重组NY-ESO-1蛋白两端均带有His-tag；3)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，Sanger测序验证后扩大培养，提取重组质粒。
在优选的实施方式中，所述的重组菌制备步骤如下：1)重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞；2)挑取至少3个单菌落至小量LB培养基培养，再接种至小量自诱导培养基培养，筛选高效表达重组NY-ESO-1蛋白的菌株；3)重组NY-ESO-1蛋白高效表达菌株接种至LB培养基培养至对数生长期，加甘油后冻存作为种子菌。
在优选的实施方式中，所述的重组菌表达重组NY-ESO-1蛋白步骤如下：1)重组菌种子菌接种至LB液体培养基培养8～16h；2)培养物按1‰～1％接种量接种至自诱导培养基；3)于恒温水平振荡器中200～300rpm，先37℃培养2～6h，再17～30℃培养16～24h；4)过滤或离心收集菌体，去除液体培养基。
在优选的实施方式中，所述的温和促溶剂处理菌体裂解产物步骤包括：1)裂解缓冲液重悬重组菌培养物，裂解菌体；2)向菌体裂解液中加入温和促溶剂，孵育一段时间促进蛋白溶解；3)分离上清、沉淀，上清利用亲和层析柱进行纯化，纯化缓冲液含温和促溶剂。
进一步优选地，超声破碎裂解菌体，条件为功率100～500W，超声4s，停6s，超声15min后停5min，共超声15～60min。
进一步优选地，所述的温和促溶剂优选为0.5～2M尿素，0.2～2％丙醇，10～100mM甘氨酸。纯化缓冲液含10～50mM磷酸盐，50～500mM氯化钠，10～500mM咪唑，温和促溶剂(0.5～2M尿素，0.2～2％丙醇，10～100mM甘氨酸)，1～10％甘油，pH 7.5～8.5。
优选地，所述的NY-ESO-1蛋白复性采用透析复性，透析复性缓冲液含10～50mMTris-HCl，0.5～2mM EDTA，50～200mM KCl，10～50mM MgCl2，10～20％甘油，0.01～0.05％(质量/体积)Tween 80，0.5～3mM TCEP，0～2M尿素，pH 7.5～9.5。
本发明还提供了一种用于重组表达人NY-ESO-1蛋白的试剂盒，包括：(a)温和促溶剂，包括：0.5～3M尿素，0.2～3％丙醇，10～120mM甘氨酸；(b)重组大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞中包含重组表达盒，该重组表达盒含有人NY-ESO-1蛋白编码序列。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还可包括：(c)自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，Na2HPO4，NH4Cl，KH2PO4，Na2SO4，MgSO4；(d)裂解缓冲液；较佳地，所述裂解缓冲液包含有效量的：磷酸盐，氯化钠，甘油，TCEP，PMSF；(e)核酸酶和MgCl2；(f)纯化缓冲液；较佳地其包括：温和促溶剂、磷酸盐、氯化钠、甘油、咪唑；较佳地，所述纯化缓冲液为pH7.5±0.5。
本发明还提供了一种NY-ESO-1特异性IgG抗体的检测试剂盒，包括固相载体，所述固相载体包被有根据前面所述NY-ESO-1蛋白的制备方法所制得的抗原。
本发明还提供了一种NY-ESO-1特异性IgG抗体的检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)将固相载体和待检样本混匀并反应，反应后去除上清，洗涤去除其他非特异性结合组分，得到固相载体-抗原-IgG复合物；
2)向固相载体-抗原-IgG复合物加入酶标记的抗IgG二抗混匀并反应，反应后去除上清，得到固相载体-抗原-IgG-抗IgG二抗-酶复合物；
3)向所述固相载体-抗原-IgG-抗IgG二抗-酶复合物加入发光或显色底物并反应，检测信号强度；
4)利用已知浓度的校准品绘制信号强度标准曲线，根据步骤3)得到的信号强度对照所述标准曲线，计算得出待测血清样本中特异性IgG的含量。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明的方法制备NY-ESO-1蛋白简化了操作流程，提高了培养产物利用率和重组人NY-ESO-1蛋白产率，能够高效表达、生产重组人NY-ESO-1蛋白，获得的重组人NY-ESO-1蛋白的纯度高、免疫活性高。使得重组人NY-ESO-1蛋白进一步应用于特异性IgG抗体的检测灵敏度高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、构建人NY-ESO-1蛋白表达重组质粒pET28b-NY-ESO-1
重组表达的目的蛋白为人NY-ESO-1蛋白(Sequence ID:NP_001318.1)氨基酸序列，序列如SEQ ID NO:1所示。
NY-ESO-1氨基酸序列(SEQ ID NO:1；180aa；人源)：
对NY-ESO-1进行密码子优化，合成优化的基因片段，两端分别添加Hind III/XhoI酶切位点序列，大小约为552bp的人NY-ESO-1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
用于表达的NY-ESO-1核酸序列的序列(SEQ ID NO:2；552nt；两端含有酶切位点)：
将pET28b载体和合成的人NY-ESO-1基因片段经过Hind III/Xho I双酶切，凝胶电泳并回收和纯化，DNA连接酶连接上述两基因片段。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB平板，倒置培养过夜后挑取阳性转化子，测序确认准确性后提取质粒，即得重组质粒pET28b-NY-ESO-1。
实施例2、构建重组菌BL21(DE3)/pET28b-NY-ESO-1
重组质粒pET28b-NY-ESO-1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取3个单菌落至小量LB培养基培养，再接种至小量自诱导培养基培养，筛选高效表达重组NY-ESO-1蛋白的菌株。
重组NY-ESO-1蛋白高效表达菌株接种至LB培养基培养至对数生长期，加甘油后冻存作为种子菌。
实施例3、NY-ESO-1蛋白的表达
甘油菌活化：取10μL重组菌BL21(DE3)/pET28b-NY-ESO-1甘油菌至2mL液体LB培养基中，加入终浓度100μg/mL的Kana抗生素，37℃，220rpm，过夜培养。
自诱导表达：按1‰接种量接菌至80mL自诱导培养基，37℃，220rpm，培养5h后转17℃，220rpm，培养20h。
其中，自诱导培养基的配方：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，乳糖2g/L，葡萄糖0.5g/L，Na2HPO4 25mmol/L，NH4Cl 50mmol/L，KH2PO4 25mmol/L，Na2SO4 5mmol/L，MgSO4 2mmol/L。
实施例4、菌体收集、裂解及NY-ESO-1蛋白促溶解
菌体收集与裂解：10000g离心10min收集菌体，用10mL PBS洗涤1次，重悬在4mL裂解缓冲液中(20mM磷酸盐，500mM氯化钠，5％(v/v)甘油，1mM TCEP，1mM PMSF，pH 7.5)。
冰浴中超声破碎，功率200W，超声4s，停6s，共超声15min。
裂解产物中加30U/mL核酸酶、3mM MgCl2，25℃水浴10min。
加入温和促溶剂(2M尿素，1％丙醇，50mM甘氨酸)低温(2-8℃)振荡2h，离心分离沉淀和上清。
实施例5、亲和层析纯化NY-ESO-1蛋白
使用0.22μm针头过滤器过滤上清，纯化缓冲液1(20mM磷酸盐，500mM氯化钠，5％甘油，温和促溶剂(2M尿素，1％丙醇，50mM甘氨酸)，10mM咪唑，pH 7.5)平衡镍柱，将过滤后上清上样，待上样完成后，用5倍柱体积纯化缓冲液1洗去非特异性结合蛋白。
然后，用5倍柱体积纯化缓冲液2(20mM磷酸盐，0.5M氯化钠，5％甘油，温和促溶剂(2M尿素，1％丙醇，50mM甘氨酸)，120mM咪唑，pH7.5)洗去非特异性结合蛋白；最后用5倍柱体积纯化缓冲液3(20mM磷酸盐，0.5M氯化钠，5％甘油，温和促溶剂(2M尿素，1％丙醇，50mM甘氨酸)，500mM咪唑，pH 7.5)洗脱NY-ESO-1蛋白。
分析获得的NY-ESO-1蛋白，尽管存在蛋白的部分变性，但较多的蛋白保留二级结构。
实施例6、NY-ESO-1蛋白透析复性
纯化组分加入预处理透析袋，6℃依次于如下溶液中透析：
透析缓冲液1：50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10％Glycerol,2M Urea,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5；
透析缓冲液2：50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10％Glycerol,1M Urea,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5；
透析缓冲液3：50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10％Glycerol,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5；
透析缓冲液4：10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,2.7mM KCl,150mM NaCl,10％Glycerol,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5。
透析时在蛋白溶液中加入1mM PMSF，磁力搅拌器缓慢搅拌。每次更换透析缓冲液时取30μL蛋白液进行SDS-PAGE检测，透析所得蛋白分装后冻存于-80℃备用。
由图1可见，使用2％丙醇、50mM甘氨酸、2M尿素促溶并纯化的NY-ESO-1蛋白在透析复性后目的蛋白浓度依然较高，与透析复性前无显著差异。计算透析复性产率以及蛋白纯度。
透析复性产率＝透析复性获得蛋白总量/加入透析袋中进行透析的蛋白总量；
蛋白纯度＝使用Imag J软件分析SDS-PAGE检测图，获得对应蛋白条带灰度占全泳道总蛋白条带灰度的比例；
结果显示，透析复性产率高于90％，蛋白纯度高于90％。
对比例1、不加促溶剂从裂解上清纯化NY-ESO-1蛋白
基因合成、表达载体构建、重组菌构建、蛋白表达条件均同实施例1-3，仅菌体裂解后不加入促溶剂。
裂解缓冲液含20mM磷酸盐，500mM氯化钠，5％(v/v)甘油，1mM TCEP，1mM PMSF，pH7.5。
结果显示，裂解后NY-ESO-1蛋白部分存在于裂解沉淀中，部分存在于裂解上清中，裂解上清中NY-ESO-1蛋白浓度约0.3mg/mL，裂解上清上样至亲和镍柱，收集的流穿液中NY-ESO-1蛋白浓度仍约0.3mg/mL，SDS-PAGE检测纯化组分时无目的蛋白条带，表明裂解上清中活性NY-ESO-1蛋白几乎不与镍柱结合，难以利用亲和镍柱纯化。
对比例2、使用8M尿素纯化NY-ESO-1蛋白并透析复性
基因合成、表达载体构建、重组菌构建、蛋白表达条件均同实施例1-3，获得蛋白包涵体。
使用8M尿素促溶解从对比例1中裂解沉淀纯化NY-ESO-1蛋白(即包涵体纯化)，包涵体溶解缓冲液含20mM磷酸盐，500mM氯化钠，8M尿素，5％甘油，2mM TCEP，1mM PMSF，pH7.5。纯化缓冲液含20mM磷酸盐，500mM氯化钠，5％甘油，8M尿素，10/120/500mM咪唑，pH7.5。复性方法参考实施例6，所用透析缓冲液如下：
透析缓冲液1：含50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10％Glycerol,4M Urea,2mM TCEP,0.02％ Tween 80,pH 9.5。
透析缓冲液2-4依次对应实施例6中透析缓冲液1-3。
由图2可见，使用8M尿素促溶、纯化的NY-ESO-1蛋白在透析复性时目的蛋白浓度显著降低，透析复性产率仅约50％，蛋白纯度约90％。
实施例7、人血清中NY-ESO-1特异性IgG抗体的检测试剂盒：化学发光法
本试剂盒主要包括磁分离试剂、样本稀释液、清洗液、酶标抗人IgG抗体试剂、化学发光底物、校准品、质控品。
1、制备磁分离试剂的步骤
1)取适量甲苯磺酰基磁微粒置于磁场分离磁微粒去除上清，加入硼酸钠溶液重悬；
2)加入相应量的NY-ESO-1蛋白，涡旋混匀。加入相应量的硫酸铵溶液，涡旋混匀后置于水平振荡器上37℃500rpm孵育18h；
3)磁场分离磁微粒去上清，加入封闭液进行封闭，置于水平振荡器上37℃500rpm孵育6h；
4)磁场分离磁微粒去除上清，洗涤4次。加入磁微粒保存液重悬即得磁分离试剂。
2、人血清中NY-ESO-1特异性IgG抗体的检测方法
1)将20μL磁分离试剂和80μL待检样本稀释液混匀，37℃振荡孵育30min，去除上清，洗涤5次去除其他非特异性结合组分，得到磁微粒-抗原-IgG复合物；
2)向磁微粒-抗原-IgG复合物加入100μL HRP标记的抗人IgG抗体工作液，37℃振荡孵育30min，去除上清，洗涤5次去除未结合的酶标二抗，得到磁微粒-抗原-IgG-抗人IgG抗体-HRP复合物；
3)向所述磁微粒-抗原-IgG-抗人IgG抗体-HRP复合物加入100μL发光底物，孵育4min内检测发光强度；
4)利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤3)得到的发光强度对照所述标准曲线，计算得出待测血清样本中特异性IgG的含量。
实施例8、人血清中NY-ESO-1特异性IgG抗体的检测试剂盒：酶联免疫吸附法
本试剂盒主要包括包被微孔板、样本稀释液、清洗液、酶标抗人IgG抗体试剂、显色底物、终止液、校准品、质控品。
1、制备包被微孔板
1)将NY-ESO-1蛋白用包被缓冲液稀释至2μg/mL，以每孔100μL加入相应96孔酶标孔板中，4℃孵育过夜；
2)弃去孔中液体，每孔加入200μL洗涤液，置于水平振荡器上500rpm洗涤1min，将孔内液体甩出，并在吸水纸上面拍板使孔内尽量无残留液体，重复洗涤5次；
3)每孔加入200μL封闭液，置于微孔板振荡器上37℃，500rpm，孵育1h，同步骤2洗涤5次，贴封板膜，标记包被日期及相应抗原后于4℃保存。
2、人血清中NY-ESO-1特异性IgG抗体的检测
1)将100μL待检样本稀释液加入已包被NY-ESO-1的微孔，置于微孔板振荡器上37℃，500rpm，孵育1h，去除上清，洗涤去除其他非特异性结合组分，得到抗原-IgG复合物；
2)向微孔加入100μL HRP标记的抗人IgG抗体，置于微孔板振荡器上37℃，500rpm，孵育1h，去除上清，得到抗原-IgG-抗人IgG抗体-HRP复合物；
3)向微孔加入显色底物并反应10min，加入终止液，检测信号强度；
4)利用已知浓度的校准品绘制信号强度标准曲线，根据步骤3)得到的信号强度对照所述标准曲线，计算得出待测血清样本中特异性IgG的含量。
利用实施例5纯化所得NY-ESO-1蛋白(未复性蛋白)和实施例6透析复性所得NY-ESO-1蛋白(复性蛋白)分别制备磁分离试剂，利用此磁分离试剂检测Anti-His、Anti-NY-ESO-1(单克隆抗体)及人血清样本。
由图3可见，复性蛋白与未复性蛋白用于Anti-His、Anti-NY-ESO-1(单克隆抗体)检测时信号值无大的差别，未复性蛋白检测信号值略微高，而复性蛋白与未复性蛋白用于人血清样本中NY-ESO-1特异性IgG检测时信号值、信噪比均有较大差别，复性蛋白检测信号值、信噪比均显著性地更高。
该结果提示：①未复性蛋白未充分折叠，更多线性表位得以暴露，检测Anti-His、Anti-NY-ESO-1(单克隆抗体)可以获得更高信号值；②透析复性使蛋白折叠更加充分，更多构象表位得以形成，检测人血清样本中NY-ESO-1特异性IgG灵敏度更高。
利用实施例6和对比例2透析复性所得NY-ESO-1蛋白分别包被微孔板，利用3倍梯度稀释的Anti-NY-ESO-1(多克隆抗体)测定两组蛋白免疫活性，以抗体稀释比例对数为横坐标、信号值为纵坐标拟合四参数曲线(图4)。
结果显示实施例中NY-ESO-1蛋白免疫活性更高，EC50值为0.039，对比例中NY-ESO-1蛋白EC50值为0.070。
小结
综合上述，本发明NY-ESO-1蛋白制备方法与常规方法比较列于表1。
表1
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.一种重组表达人NY-ESO-1蛋白的方法，包括：
(1)提供重组大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞中包含重组表达盒，该重组表达盒含有人NY-ESO-1蛋白编码序列；
(2)培养(1)的重组大肠杆菌细胞，从而表达人NY-ESO-1蛋白；表达后进行细胞裂解，获得裂解产物；
(3)利用温和促溶剂处理(2)的裂解产物；以含有温和促溶剂的纯化缓冲液纯化，获得蛋白纯化产物；其中，所述温和促溶剂包括：0.5～3M尿素，0.2～3％丙醇，10～120mM甘氨酸；
(4)对蛋白纯化产物进行复性，获得活性人NY-ESO-1蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用自诱导培养基培养，所述自诱导培养基不含有化学诱导剂如IPTG；较佳地，所述自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，Na2HPO4，NH4Cl，KH2PO4，Na2SO4，MgSO4；和/或
步骤(1)中，首先在37±3℃、较佳地37±2℃、更佳地37±1℃的温度条件下培养；之后，更换为在17±3℃、较佳地17±2℃、更佳地17±1℃的温度条件下培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用足以使得细胞裂解的裂解缓冲液处理菌体，使得细胞裂解；较佳地，所述裂解缓冲液包含有效量的：磷酸盐，氯化钠，甘油，TCEP，PMSF；较佳地，所述裂解缓冲液为pH7.5±0.5；
较佳地，裂解缓冲液处理后，进行细胞的物理破碎；更佳地，在冰浴条件下进行超声破碎；
较佳地，裂解产物中加入核酸酶和MgCl2，25±3℃孵育。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述温和促溶剂包括：0.5～3M尿素，0.2～3％丙醇，10～120mM甘氨酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纯化缓冲液包括：温和促溶剂、磷酸盐、氯化钠、甘油、咪唑；较佳地，所述纯化缓冲液为pH7.5±0.5。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，采用蛋白透析的方法进行复性；较佳地，所述复性在6±3℃下进行；较佳地，透析时在蛋白溶液中加入1±0.5mMPMSF。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；较佳地，所述人NY-ESO-1蛋白的编码序列如SEQ ID NO:2所示。
8.权利要求1～7任一所述的方法的应用，用于重组表达人NY-ESO-1蛋白。
9.一种用于重组表达人NY-ESO-1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)温和促溶剂，包括：0.5～3M尿素，0.2～3％丙醇，10～120mM甘氨酸；
(b)重组大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞中包含重组表达盒，该重组表达盒含有人NY-ESO-1蛋白编码序列；
任选地还包括：
(c)自诱导培养基包括：蛋白胨，酵母提取物，甘油，乳糖，葡萄糖，Na2HPO4，NH4Cl，KH2PO4，Na2SO4，MgSO4；
(d)裂解缓冲液；较佳地，所述裂解缓冲液包含有效量的：磷酸盐，氯化钠，甘油，TCEP，PMSF；
(e)核酸酶和MgCl2；
(f)纯化缓冲液；较佳地其包括：温和促溶剂、磷酸盐、氯化钠、甘油、咪唑；较佳地，所述纯化缓冲液为pH7.5±0.5。
10.权利要求9所述的试剂盒在重组表达人NY-ESO-1蛋白中的应用。
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