CN117599162A - 一种基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂及制备方法与应用。包含锰离子与多肽组合形成的水凝胶充当蛋白或多肽疫苗载体发挥佐剂的应用，其中多肽分子与锰离子混合的摩尔比为1：0.5~4。该水凝胶具有良好的生物相容性，与蛋白抗原简单混合后即可刺激机体产生较高水平的体液免疫及特异性细胞免疫反应。
Description
技术领域
发明涉及生物医药技术与疫苗技术领域，具体涉及一种多肽纳米材料的制备方法与应用，尤其涉及一种基于自组装多肽的新型锰离子水凝胶佐剂的制备方法与应用。
背景技术
疫苗是人为干预免疫系统的常规手段，可以提高机体的防御能力，从而预防感染的发生。但直至今日，大部分被批准的疫苗是根据经验进行开发的，经验主导的开发模式难以快速有效地建立相应疫苗体系。因此，开发科学有效的疫苗体系是目前的开发关键。疫苗体系主要由抗原及佐剂两部分构成，随着对蛋白结构解析分辨率的提高，目前已经基本实现疫苗开发中对抗原组分的精确选择与优化，但佐剂相关研究进展缓慢。目前应用于临床的佐剂种类较少，其中只有铝佐剂被广泛应用于疫苗中。铝佐剂主要诱导体液免疫，通常不能引起细胞免疫反应。近年来对于佐剂的需求逐渐增加，其中病毒和癌症疫苗迫切需要诱导细胞免疫反应的佐剂。
机体可以通过多种模式识别受体来感应以微生物为主的“非我”信号，从而启动固有免疫，继而产生特异性免疫。Mn2+通过激活胞内模式识别受体-STING,诱导了I型干扰素和细胞因子的产生，是一种有效的固有免疫刺激剂。但游离的Mn2+在体内的快速扩散，导致无法发挥持续的免疫效果。
由于多肽纳米材料具有易合成、易修饰、生物相容性良好等优点，近年来被广泛用于生物医药领域。基于多肽的纳米材料可通过亲疏水作用、氢键等非共价作用自组装形成纳米纤维，形成水凝胶，可作为良好的药物递送载体。
发明内容
基于以上研究背景，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂的制备方法与应用，特别是一种可与锰离子配位的自组装多肽分子的制备方法及应用，本发明提供的自组装多肽可与锰离子配位结合后形成纳米纤维水凝胶，与疫苗抗原混合后可大大提高其免疫原性，激活机体产生细胞免疫记忆，而且该分子合成步骤简单，储存运输方便，具有良好的生物相容性，适用于大规模生产及应用。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种用作免疫佐剂的免疫增强组合物，其特征在于它为锰离子与多肽形成的水凝胶；多肽分子与锰离子混合的摩尔比为1：（0.5~4）；
所述锰离子为二价锰离子选自磷酸锰盐、碳酸锰盐、醋酸锰盐或氯化锰；所述多肽为能够在水溶液或者其他溶液中发生自组装的短肽，其结构中具有组装能力的模块以芳香族氨基酸为核心并包含数量不等及序列不定的组氨酸、谷氨酸和/或天冬氨酸形成的自组装多肽，经典的结构式如下：
该多肽分子的N端连接2-萘乙酸（Nap）作为封端基团，以2个D构型的苯丙氨酸作为自组装模块，其余4个氨基酸作为锰离子配位模块。
优选一种疫苗组合物，其包含
A)疫苗免疫原：所述疫苗免疫原源自病毒、细菌、寄生虫或/和肿瘤细胞；
B)锰离子多肽水凝胶，组分A和B可以混合在同一容器或者分开置于不同容器中。所述病毒选自：DNA病毒和RNA病毒，优选的所述疫苗免疫原源自乳头瘤病毒科、疱疹病毒科和逆转录病毒科，更为优选地所属病毒选自：流感病毒，HPV，HBV和HIV；所述细菌选自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，优选地所述细菌选自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、沙门氏菌(Salmonella)、脑膜炎双球菌 (Meningococcus)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌 (Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)；所述肿瘤细胞选自脑胶质瘤，黑色素瘤，乳腺癌，肺肿瘤，宫颈癌，肝癌，胰腺癌，骨肉瘤，腹膜癌等恶性肿瘤,典型的为黑色素瘤，乳腺肿瘤。
本发明进一步公开了免疫增强组合物的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）采用固相合成方法，依次连接组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、2个D构型的苯丙氨酸及萘乙酸，合成上述自组装多肽分子；
2）将上述步骤中得到的多肽分子称取5mg溶于10μl DMSO中，加入1mL一定浓度的氯化锰水溶液中，混匀后静置得到纳米纤维水凝胶，多肽分子与锰离子混合的摩尔比为1：0.5~4；
3）将上述步骤中的纳米纤维水凝胶与抗原混合，纳米纤维水凝胶中多肽分子与抗原混合的摩尔比为1：0.1~0.7；所述抗原包括蛋白质抗原/或多肽抗原，包括流感病毒抗原，肿瘤相关抗原，肿瘤新生抗原中的一种或者多种。典型的是卵清蛋白，HPV-E6，HPV-E7蛋白。
本发明同时也公开了用作免疫佐剂的免疫增强组合物在用于改善固有免疫和/或适应性免疫方面的应用；其中所述免疫增强是增加Ⅰ型干扰素的表达。其中所述免疫增强是促进抗体的产生或促进特异性细胞免疫的产生或促进树突细胞成熟。特别是基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂在疫苗领域的应用；所述的疫苗领域的应用指的是激活机体产生细胞免疫记忆。实验结果显示：本发明基于锰离子的自组装多肽水凝胶是具有规律纳米结构的水凝胶，并在体内引起较强的细胞免疫反应。
本发明还公开了一种免疫接种方式，其包括：向有此需求的对象使用所述的疫苗组合物，其中组分A和组分B同时或不同时施用。其中所述施用选自肌肉注射、皮下注射、静脉注射、黏膜施用及其任意组合；所述免疫接种用于预防疾病，例如细菌感染，病毒感染、肿瘤和自身免疫性疾病。
本发明主要解决了传统疫苗佐剂只能单一激活体液免疫的缺点，重点考察了与锰离子配位结合后的多肽形成的纳米水凝胶的免疫激活作用，主要的难点在于既激活体液免疫又激活细胞免疫。
本发明更加详细的描述如下：
一类多肽分子，与锰离子配位后可自组装形成纳米纤维水凝胶，并且能发挥类似疫苗佐剂的效果，其结构式如下：
该多肽分子的N端连接2-萘乙酸（Nap）作为封端基团，以2个D构型的苯丙氨酸作为自组装模块，其余4个氨基酸作为锰离子配位模块，将该多肽描述为MnP，与锰离子配位后形成的水凝胶描述为MnPgel。
合成步骤为：
1）称取0.5 mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10 mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃5 min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
3)将0.5 mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-His(Trt)-OH)溶解在10 mL的无水DCM里，加入1 mmol的DIEA，然后转移到上述固相合成器中，在室温下反应2 h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10 mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIEA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20 mL，在室温下反应30 min；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10 mL、洗涤时间1 min，共洗5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1 min，共洗5次，加入10 mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应30 min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10 mL、洗涤时间1 min，共洗5次，进行下一步反应；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH) （市售常规化学试剂）1mmol、TBTU 1 mmol（市售常规化学试剂）、HOBT 1 mmol（市售常规化学试剂）、DIEA 2 mmol（市售常规化学试剂）和10 mL DMF（市售常规化学试剂），把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2 h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-ASP(OtBu)-OH（市售常规化学试剂）、Fmoc-His(Trt)-OH（市售常规化学试剂）、Fmoc-D-Phe-OH（市售常规化学试剂）、Fmoc-D-Phe-OH（市售常规化学试剂）和封端基团(2-萘乙酸)；然后用DMF洗涤5遍，DCM洗5遍，进行下步反应；
8)将按95％ TFA，2.5％ TIS，2.5％ H2O的体积百分比组成的溶液10 mL加入到上述固相合成器中，反应30 min，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，制得MnP，质谱数据见图1。
为阐述本发明的特殊佐剂效应，需引入其他佐剂，商用铝佐剂（从Thermo FisherScientific公司直接购买）。
本发明提供了一种基于自组装多肽的新型锰离子水凝胶佐剂，包括自组装多肽与锰离子配位后形成的水凝胶以及混合在所述水凝胶中的抗原。典型的可以在超纯水溶液中形成纳米纤维水凝胶，其核心包括两个D构型的苯丙氨酸、锰离子以及与其配位的组氨酸、天冬氨酸和组氨酸。所述抗原包括多肽抗原或者蛋白质抗原；典型的包括流感病毒抗原，新型冠状病毒抗原，肿瘤相关抗原，肿瘤新生抗原中的一种或者多种）。
所述纳米纤维水凝胶中多肽分子与抗原混合的摩尔比为1：（0.1~0.7）
所述纳米水凝胶中多肽分子的浓度为1-5mg/mL,多肽分子与锰离子混合的摩尔比为1：（0.5~4）。
本发明公开的基于自组装多肽的新型锰离子水凝胶佐剂的制备方法与应用与现有疫苗佐剂相比，所具有的积极效果在于：
本发明针对现有疫苗佐剂难以诱导机体细胞免疫导致无法清除细胞内病毒，或者会引起过多的体液免疫，导致对机体的不良反应两个方面的劣势。本发明提供的自组装多肽分子形成的纳米纤维水凝胶极大提高了作为疫苗的抗原分子的免疫原性，有效诱导淋巴结位置生发中心B细胞的分化，产生高亲和力抗体，高效诱导辅助T细胞向Th1方向分化，使机体产生对病毒的细胞毒性免疫记忆。同时该分子具有良好的生物相容性，对正常细胞无损伤。
附图说明
图1 为多肽分子MnP的质谱数据；
图2为多肽分子MnP以及加入锰离子后形成的MnPgel的光学图及电镜结构；
图3为多肽分子MnP以及加入锰离子后形成的MnPgel的最小组装浓度；其中上图为MnP最小组装浓度，下图为MnPgel的最小组装浓度；
图4为多肽分子加入锰离子后形成的MnPgel在小鼠体内的锰离子释放速率检测结果；
图5为多肽分子加入锰离子后形成的MnPgel对骨髓来源的DC细胞（BMDCs）的体外刺激情况；其中A是不同处理后BMDC中CD80及CD86的表达情况，B是不同处理后BMDC中cGAS-STING 通路的激活情况；
图6为多肽分子加入锰离子后形成的MnPgel+OVA 免疫小鼠后抗体分泌检测结果与生物相容性；其中A是OVA特异性抗体IgG的滴度水平，B是免疫后小鼠的体重变化情况；
图7为多肽分子加入锰离子后形成的MnPgel+OVA 免疫小鼠后抗原特异性CD8+T细胞检测结果。
具体实施方式
为进一步了解本发明，下面结合实例对本发明的优选方案进行描述，本描述仅用来进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明专利要求的限制。
本发明所涉及原料，对其来源没有特别限制，在市场购买本领域技术人员熟知的常规试剂即可。所有原料对其纯度没有特别限制，优选采用生化及生物医药技术领域的常规纯度。
本发明提供一种多肽纳米材料包括多肽纳米材料及其负载的抗原多肽或者抗原蛋白，代表有卵清蛋白，HPV-E6，HPV-E7蛋白；
本发明对抗原的定义没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际病原体的抗原序列进行调整和选择
本发明对负载抗原的含量没有特别限制，本发明所述的多肽纳米材料与抗原多肽及蛋白的摩尔比优选为1:（0.1~0.7），本领域技术人员可根据实际应用情况进行调整。
以下实施例中所涉及制剂来源如下：
2-Cl-Trt树脂，购自天津南开和成科技有限公司，活性1.11mmol/g；
N ,N-二异丙基乙胺(以下用DIEA表示)，购自北京百灵威科技有限公司，纯度99％；
[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-苯并三唑鎓3-氧化物四氟硼酸盐(以下用TBTU表示)，购自毕得医药，纯度98％；
1-羟基苯并三唑(以下用HOBT表示),购自上海韶远试剂有限公司，纯度98％；
三氟乙酸(以下用TFA表示)，购自上海麦克林生化科技有限公司，纯度99％；
三异丙基硅烷(以下用TIS表示)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度98％；
无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，购自天津市康科德科技有限公司；
N ,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)，购自天津市康科德科技有限公司；
甲醇，购自天津市康科德科技有限公司；
哌啶，购自天津市大茂化学试剂厂；
含体积百分比为20％的哌啶的DMF(20％哌啶+80％DMF)；
所有氨基酸及各种保护的氨基酸均购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
2-萘乙酸（Nap），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度99％；
无水乙醚，购自天津渤化化学试剂有限公司；
实施例
自组装多肽MnP的结构如下：
该多肽分子的N端连接2-萘乙酸（Nap）作为封端基团，以2个D构型的苯丙氨酸作为自组装模块，其余4个氨基酸作为锰离子配位模块。
自组装多肽MnP的详细制备方法：
1)称取0.5 mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10 mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃5 min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
3)将0.5 mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-His(Trt)-OH)溶解在10 mL的无水DCM里，加入1 mmol的DIEA，然后转移到上述固相合成器中，在室温下反应2 h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10 mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIEA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20 mL，在室温下反应30 min；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10 mL、洗涤时间1 min，共洗5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1 min，共洗5次，加入10 mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应30 min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10 mL、洗涤时间1 min，共洗5次，进行下一步反应；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)1 mmol、TBTU 1 mmol、HOBT 1 mmol、DIEA 2 mmol和10 mL DMF，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-ASP(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-D-Phe-OH和封端基团(2-萘乙酸)；然后用DMF洗涤5遍，DCM洗5遍，进行下步反应；
8)将按95％ TFA，2.5％ TIS，2.5％ H2O的体积百分比组成的溶液10 mL加入到上述固相合成器中，反应30 min，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，制得MnP，质谱数据见图1。
实施例2
基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂MnPgel
取5mg MnP分子溶于10μl DMSO中，加入1mL一定浓度的氯化锰水溶液中，混合均匀后静置得到纳米纤维水凝胶MnPgel。
实施例3
自组装多肽MnP与基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂MnPgel及其形成的纳米纤维
首先使用固相多肽合成法合成多肽分子，使用质谱进行分子量鉴定，鉴定结果见图1，表明得到正确的MnP分子。取5mg MnP分子加入到1mL ddH2O溶液中，涡旋、超声使其溶解，静置一段时间后即可获得单独多肽溶液；取5mg MnP分子溶于10μl DMSO中，加入1mL一定浓度的氯化锰水溶液中，混匀后静置得到纳米纤维水凝胶。使用透射电镜下观察MnP和MnPgel的微观结构，并鉴定其最小组装浓度，参见图2和图3，本发明实例2中基于自组装多肽的锰离子水凝胶佐剂MnPgel形成的纳米水凝胶电镜照片（图2）及最小成胶浓度（图3），可以看出与实例1中多肽分子MnP相比，两者有完全不同的微观形貌以及组装性能。
实施例4
将水凝胶佐剂MnPgel注入小鼠大腿肌肉内，在不同时间点取100mg肌肉进行消解，通过ICP-MS测量锰元素的量，从而检测锰元素的释放速率。图4为本发明实例2中水凝胶佐剂MnPgel体内锰元素释放结果；由图4可知，本发明实施例2得到的MnPgel具有较慢的锰离子释放速率。
实施例5
基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂MnPgel对骨髓来源的DC细胞（BMDCs）的体外刺激作用
收集C57小鼠的骨髓来源的DC细胞，设置PBS,MnCl2,MnP,本发明MnPgel共4组。参见图5，图5 A为不同材料处理后BMDCs的成熟情况，如图所示，本发明实例2中水凝胶佐剂MnPgel可以明显促进DC成熟。对不同材料处理后BMDCs的蛋白和细胞上清进行检测，参见图5B，图5 B为不同材料处理BMDCs后cGAS-STING通路相关蛋白的检测情况,图5 为不同材料处理BMDCs后上清的检测情况。如图5 B左图所示，MnPgel处理后TBK1、IRF3、STING三种蛋白的磷酸化水平均明显提升。如图5 B右图所示,MnPgel处理后下游的Ⅰ型干扰素分泌也显著增多。由图5可知，MnPgel具有一定的免疫激活能力。
实施例6
基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂MnPgel疫苗对小鼠体液免疫反应的影响作用
将本发明材料MnPgel与抗原分子OVA蛋白混合，以雌性C57小鼠为对象，设置，PBS,OVA,铝佐剂，MnP以及MnPgel共5组，每组5只，通过肌内注射对小鼠进行免疫，分别在第0天，第14天进行免疫，对免疫后的小鼠体重进行监测，并于第21天处死小鼠，取小鼠外周血，使用酶联免疫吸附实验检测血清中各种抗体表达水平。
参见图6，图6 A为水凝胶MnPgel对小鼠体液免疫反应检测结果。如图6 A所示，与其他免疫组相比，基于自组装多肽的锰离子水凝胶佐剂MnPgel显著促进小鼠体内IgG的分泌。图6 B为免疫后的小鼠体重监测结果，如图6 B所示，MnPgel组的体重与对照组相比并无明显变化，说明MnPgel具有较好的生物安全性。
实施例7
基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂MnPgel疫苗对小鼠细胞免疫反应的影响作用
将本发明材料MnPgel与抗原分子OVA蛋白混合，以雌性C57小鼠为对象，设置，PBS,OVA,铝佐剂，MnP以及MnPgel共5组，每组5只，通过肌内注射对小鼠进行免疫，分别在第0天，第14天进行免疫，对免疫后的小鼠体重进行监测，并于第21天处死小鼠，分离小鼠脾脏，对脾脏单细胞进行OVA特异的T细胞流式细胞术检测。
参见图7，如图7所示，与其他免疫处理组相比，基于自组装多肽的锰离子水凝胶佐剂MnPgel显著提高了OVA特异的CD8+ T细胞在脾脏细胞中的比例，说明该佐剂可以很好的诱导细胞免疫反应。
以上对本发明提供的一种基于锰离子的自组装多肽水凝胶佐剂的制备方法以及应用进行了详细的介绍，本文应用具体事例对本发明的原理及实施方式进行阐述，以上实施例的说明旨在帮助理解本发明的方法及核心思想，及应用方式，使得本领域其他人员能够实践本发明。在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进与修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有与本发明权利要求无实质差异的等同文字表述，那么这些其他实施例应包含在权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种用作免疫佐剂的免疫增强组合物，其特征在于它为锰离子与多肽形成的水凝胶；多肽分子与锰离子混合的摩尔比为1：0.5-4；
所述锰离子为二价锰离子选自磷酸锰盐、碳酸锰盐、醋酸锰盐或氯化锰；所述多肽为能够在水溶液或者其他溶液中发生自组装的短肽，其结构中具有组装能力的模块以芳香族氨基酸为核心并包含数量不等及序列不定的组氨酸、谷氨酸和/或天冬氨酸形成的自组装多肽，经典的结构式如下：
。
2.一种疫苗组合物，其包含
A)疫苗免疫原：所述疫苗免疫原源自病毒、细菌、寄生虫或/和肿瘤细胞；
B)锰离子多肽水凝胶，组分A和B可以混合在同一容器或者分开置于不同容器中。
3.权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述病毒选自：DNA病毒和RNA病毒，优选的所述疫苗免疫原源自：冠状病毒科，乳头瘤病毒科、疱疹病毒科和逆转录病毒科，更为优选地所属病毒选自：流感病毒，HPV，HBV和HIV；
所述细菌选自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，优选地所述细菌选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、沙门氏菌(Salmonella)、脑膜炎双球菌 (Meningococcus)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌 (Citrobacterfreundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacterbaumanni)；所述肿瘤细胞选自黑色素瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤，宫颈癌，肝癌，胰腺癌，骨肉瘤，腹膜癌等恶性肿瘤。
4.权利要求1-3任一项所述免疫增强组合物的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）采用固相合成方法，依次连接组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、2个D构型的苯丙氨酸及萘乙酸，合成上述自组装多肽分子；
2）将上述步骤中得到的多肽分子称取5mg溶于10μl DMSO中，加入1mL一定浓度的氯化锰水溶液中，混匀后静置得到纳米纤维水凝胶，多肽分子与锰离子混合的摩尔比为1：0.5~4；
3）将上述步骤中的纳米纤维水凝胶与抗原混合，纳米纤维水凝胶中多肽分子与抗原混合的摩尔比为1：0.1~0.7；所述抗原包括蛋白质抗原/或多肽抗原，包括流感病毒抗原，新型冠状病毒抗原，肿瘤相关抗原，肿瘤新生抗原中的一种或者多种；典型的是卵清蛋白，HPV-E6，HPV-E7蛋白。
5.权利要求1所述用作免疫佐剂的免疫增强组合物在用于改善固有免疫和/或适应性免疫方面的应用；其中所述免疫增强是增加Ⅰ型干扰素的表达。
6.权利要求5所述的应用，其中所述免疫增强是促进抗体的产生。
7.权利要求5所述的应用，其中所述免疫增强是促进特异性细胞免疫的产生。
8.权利要求5所述的应用，其中所述免疫增强是促进树突细胞成熟。
9.一种免疫接种方式，其包括：向有此需求的对象使用根据权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物，其中组分A和组分B同时或不同时施用。
10.权利要求9的免疫接种方式，其中所述施用选自肌肉注射、皮下注射、静脉注射、黏膜施用及其任意组合；所述免疫接种用于预防疾病，例如细菌感染，病毒感染、肿瘤和自身免疫性疾病。
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