CN1175900C

CN1175900C - Ctla-4眼用制剂

Info

Publication number: CN1175900C
Application number: CNB02135359XA
Authority: CN
Inventors: 史伟云; 谢立信; 王身国; 李绍伟
Original assignee: SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Current assignee: SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2002-08-13
Publication date: 2004-11-17
Anticipated expiration: 2022-08-13
Also published as: CN1446582A

Abstract

基因工程构建的CTLA4及与其有关的融合蛋白是一种有效的免疫抑制剂，但目前没有任何在眼科应用的制剂。本发明将涉及CTLA4有关的融合蛋白的滴眼剂、眼膏、供眼移植物浸泡液、注射液及眼内植入的缓慢释放系统的制作工艺及配方，为眼科的角膜移植术后免疫排斥反应的防治和慢性葡萄膜炎等自身免疫性眼病的治疗提供有效的免疫制剂。

Description

CTLA-4眼用制剂

技术领域

本发明涉及CTLA4眼用制剂，特别涉及到一种以生物降解高分子材料作为药物载体的长效CTLA4眼内缓释系统。

背景技术

免疫排斥反应是目前导致同种异体器官和组织移植失败的主要原因。在眼科，造成角膜移植术后失败的最主要原因同样为免疫排斥反应。尤其是在新生血管化植床、二次移植等高危移植的患者，术后虽然均常规应用免疫抑制剂，其免疫排斥发生率仍高达60％-90％。因此，降低角膜移植术后的免疫排斥反应已成为影响角膜移植手术能否成功的关键。

目前，临床上常用的免疫抑制剂包括糖皮质激素和环孢素A等。这些药物都存在着其不可克服的缺点。它们的共同特点是不加区别的作用于所有的T细胞，因此长期用药的患者有很高的继发感染和恶性肿瘤发病率。而且它们都不能诱导免疫耐受，需要长期的应用。糖皮质激素的长期应用不仅可导致皮质类固醇性白内障和青光眼，而且可以引起高血压、糖尿病等全身疾病。长期全身应用环孢素A不仅价格昂贵，而且可产生严重的肝肾毒性；眼局部的应用则由于其脂溶性的特点造成对角膜的穿透性差，不能在眼内形成有效的免疫抑制浓度。再则，尽管应用糖皮质激素和环孢素A可提高移植物的短期存活率，但对移植术后的慢性排斥治疗效果并不理想，最终仍可造成移植失败。

理想的免疫抑制剂应该兼有良好的免疫抑制和诱导免疫耐受的双重功能，并且其毒副作用应被减至最小。角膜移植术后的免疫排斥反应是以局部的T淋巴细胞的介导为主。T细胞的活化需要两个信号的同时刺激，第一个信号是通过T细胞表面的TCR-CD3复合体与抗原递呈细胞(APC)上的MHC-抗原肽复合物相结合来传递的，赋予免疫应答的特异性；第二个信号，也就是共刺激(constimulatory)信号，主要由B7/CD28途径传递，并非特异性。当T细胞只接受第一个信号时，并不产生活化，而是进入无反应状态，甚至导致程序性细胞死亡。CTLA4是B7/CD28共刺激途径的一个重要组成部分，其通过与CD28竞争性地结合APCs上的B7分子以阻断共刺激信号的传递，从而抑制T细胞的活化和增殖。

人CTLA4-Ig是由人CTLA4分子的胞外区和人IgG恒定区CH2与CH3区融合而成的可溶性嵌合蛋白，可与人、大鼠、小鼠的B7分子结合。在血浆中的半衰期约为30小时。CTLA4-Ig由于包含了CTLA4分子的胞外结合区，因此保留了与B7的高度亲和力，可竞争性抑制CD28与B7结合，从而阻止了共刺激信号的传递，使接受了第一信号的异体抗原反应性T细胞处于无反应状态，甚至程序性死亡，使来源于T细胞的细胞因子分泌减少，并可抑制T细胞依赖的抗体反应。且无任何细胞毒性。1992年，《Science》杂志首次报道了在异体大鼠胰腺移植中成功应用CTLA4-Ig抑制免疫排斥反应的研究。此后10年间，许多学者应用CTLA4-Ig在心脏、肝脏、肾脏和小肠等器官移植和银屑病等自身免疫性疾病方面进行大量的研究，证实CTLA4-Ig是目前为止最有应用前景的新型免疫抑制剂之一。同时在抑制角膜移植术后免疫排斥反应方面，CTLA4-Ig也显示出了极佳的效果。

2001年，又出现了一种由CTLA4和FasL融合而成的嵌合蛋白CTLA4-FasL。其中的FasL是诱导细胞凋亡的重要分子，可诱导T淋巴细胞的凋亡，因此可以弥补CTLA4-Ig中的Ig成分只能稳定CTLA4功能而本身无其它生物学特性的不足，而其中的CTLA4成分仍然可以发挥其正常的阻断共刺激信号传递的功能。研究也表明CTLA4-FasL抑制体外T细胞反应的能力比CTLA4-Ig要大的多(Huang JH，Inter Immuno，2001，13：529)。因此CTLA4-FasL也必将成为具有广泛应用价值的新型免疫制剂。

目前，美国FDA已批准用CTLA4-Ig在自身免疫性银屑病和骨髓移植中进行了I期临床实验，并且取得了令人满意的效果。但是眼球由于其独特的解剖和免疫学特点，不能把全身CTLA4蛋白的应用方法照搬至眼部，故需要开发其在眼科的应用制剂。

发明任务

本发明一方面提供一系列CTLA4融合蛋白眼用制剂，它含有CTLA4-Ig或CTLA4-FasL等CTLA4融合蛋白。不仅可用于防治角膜移植术后的免疫排斥反应，而且可用于治疗葡萄膜炎、白塞氏病及春季卡他性结膜炎等自身免疫性疾病和变态反应性眼病。

本发明的任务可通过如下技术方案来实现：

眼用制剂，其特征在于含有通过基因重组技术构建的与CTLA4有关所有的融合蛋白。

该眼用制剂可按滴眼剂配方配制，包括眼药水和眼药膏；也可以用药物载体对其进行包埋制成可植入眼内的长效CTLA4缓释系统。

本发明的任务还可通过如下技术方案来实现：

1、按权利要求1的眼用制剂，其特征在于可以是滴眼剂、眼膏、供眼移植应用的浸泡液及眼部的注射液形式，也可以是用药物载体对其进行包理制成可植入眼内的长效CTLA4缓释系统。

2、按权利要求2的眼用制剂，其特征在于滴眼剂、眼膏、及眼用浸泡液及注射液中CTLA4融合蛋白的浓度为0.05％-90％(w/v)。

3、按权利要求2的眼用制剂，其特征在于长效CTLA4缓释系统包括CTLA4融合蛋白和药物载体，二者的重量比为0.1∶0.9-0.9∶0.1。

4、按权利要求4的眼用制剂，其特征在于长效CTLA4缓释系统中的药物载体为合成生物降解型高分子材料、天然生物降解型高分子材料或合成生物降解型高分子材料同天然生物降解型高分子材料的共聚物。

5、按权利要求5的眼用制剂，其特征在于其中所述的合成生物降解高分子材料为脂肪族聚酯类高分子，所述的天然生物降解高分子材料为壳聚糖和/或明胶。

6、按权利要求6的眼用制剂，其特征在于其脂肪族聚酯类高分子是聚羟基酸(PHA)

7、按权利要求6的眼用制剂，其特征在于其脂肪族聚酯类高分子是聚L-乳酸、聚DL-乳酸、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)、聚乙醇酸、共聚(乳酸/乙醇酸)、聚乙内酯、(乙醇酸/乳酸/己内脂)三元共聚物、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物、和/或聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物。

8、按权利要求4的眼用制剂，其特征在于长效CTLA4缓释系统具有相互连通的孔结构，其孔径大小为10纳米-500微米。

9、按权利要求5的眼用制剂，其特征在于药物载体为膜状、片状、粒状、块状或条状。

10、按权利要求5的眼用制剂，其特征在于所述的药物载体为上述天然或合成生物降解高分子的无纺织物，或者是由上述天然或合成生物降解高分子材料制成的海绵体。

11、按权利要求1-4之任一项的眼用制剂，其特征在于其中的CTLA4融合蛋白为CTLA4-Ig或CTLA4-FasL。

12、用于制备权利要求1-4之任一项眼用制剂的CTLA4融合蛋白。

在CTLA4融合蛋白滴眼剂中，CTLA4融合蛋白的浓度为0.05％-90％。该滴眼剂中的其它成分可参照：

体内植入药物的缓释系统是一种新型的药物制剂，具有不受体液冲洗，稀释的影响用药量少，且能长时间在体内缓慢释放药物的特点；特别是对药物吸收困难的部位，能达到很高的用药效果。药物缓释系统的出现，正受到全世界的瞩目，然而由于药物载体的问题一直没有解决，因此迄今为止，具有长期释药功能的CTLA4体内植入制剂还不能问世。

体内植入药物缓释系统主要由药物及药物载体两种成分组成，药物载体对药物的释放起保护和控制速度的作用，从而达到在体内长期释放的效果(Jani P.J PharmPharmacol，1990，41：821)。药物载体必须对药物具有一定的通透性，同药物不发生相互作用。此外，由于药物制剂是长期植入体内进行药物释放的，因此药物载体必须具有对机体很好的生物相容性，不对机体产生炎症、刺激、致敏等作用。能满足这些条件的药物载体材料又可分为生物惰性高分子及生物降解型高分子材料两类。硅橡胶、聚氨酯等都是在医学领域得到广泛应用的生物惰性高分子材料，具有良好的生物相容性，已被应用于制备心脏瓣膜介入治疗插管等，同时也已被用于长效避孕药等缓释药物的药物载体。然而用这类生物惰性材料作为药物载体时，随着时日的增加，药剂中含药量的不断减少，药物释放速度和释放量也会不断下降，因此药物的释放剂量随时间在不断减少，无法保证恒定的药物剂量；此外由于这些材料的生物惰性，在体内不会发生变化，因此在药物释放完后，还必须再从体内取出，以免作为异物留在体内会产生不良的影响。

生物降解型高分子药物载体在药物释放的同时，由于体内的生理环境(体温、体液、酶)的作用。载体材料也被不断降解，分子量变小，结构变得疏松，以至最终降解为小分子或单体，被机体吸收或代谢。因此用这样的材料为药物载体，当药释放完后不需要再手术取出。此外，由于材料的降解结构变得疏松且使药物更易从中释放出来，因而有使药物释放量增加的趋势。当由于含药量的减少所引起的药物释放剂量的减少与由降解引起的药物释放量增加的量相一致时，就可以实现药物的恒速释放，这是用生物惰性高分子材料为药物载体时所不可能实现的药物行为(王身国，化学通报，1997，2：45)。

因此，本发明另一方面采用水不溶性的生物降解型高分子作为CTLA4融合蛋白的控制释放载体，对CTLA4融合蛋白进行包被而制成CTLA4融合蛋白缓释体系。此缓释体系在角膜移植术中同期植入前房，不仅可起到良好的抗排斥效果，而且一次性植入可长期有效，具有药物浓度稳定，生物利用度高的优点。

本发明中的CTLA4融合蛋白缓释系统包括药物和药物载体，二者按重量比为0.1∶0.9-0.9∶0.1。所述的药物载体为具有良好的生物相容性、具有一定的强度、硬度和弹性的合成生物降解型高分子材料、天然生物降解型高分子材料或合成生物降解型高分子材料同天然生物降解型高分子材料的共聚物为药物载体。药物释放体系在药物释放完前可保持一定的强度、弹性和形状，而在体内的生理条件下可以自然降解，从而被吸收或通过代谢而排出体外，因此既不会成为异物对机体产生刺激，也不会使机体产生异物反应，因此不需要再行二次手术将其取出。上述的合成生物降解型高分子材料为可溶解性聚酯类高分子，它们可以是聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)(PLGA)、聚乙内酯(PCL)、(乙醇酸/乳酸/乙内酯)三元共聚物(PCEL)、聚乙内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚乙内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)，以及其它聚羟基酸(PHA)。上述的天然生物降解型高分子材料可为壳聚糖、明胶或它们的共混物。

所述的药物载体可以为膜状、片状、粒状、块状、条状：它由上述天然或合成的生物降解型高分子化合物，也可以是由上述的合成或天然生物降解型高分子材料的海绵体。上述的药物载体孔结构的大小和密度由控制溶液挥发速度的方法、或控制致孔剂量的方法、或通过控制化合物密度的方法进行控制。

所述的CTLA4融合蛋白缓释系统可以是无孔，或具有相互连通的孔结构，其孔径大小为10纳米-500微米。

本发明的CTLA4融合蛋白缓释系统是长效CTLA4融合蛋白缓释系统，释药周期为一周到一年；具有不受泪液冲洗、稀释的影响，用药量极少，且能长时间在眼内缓慢释放药物的特点；对于药物吸收困难的部位，能达到很高的用药效果。

具体实施方式

下面实施例是对本发明CTLA4融合蛋白眼用制剂的说明。

实施例1

CTLA4融合蛋白滴眼剂的配剂：

1、主药：CTLA4可溶蛋白

2、增调剂：纤维素衍生物(甲基纤维素MC、羧甲基纤维素CMC-Na)、合成高分子物(聚乙烯吡咯烷西酮PVP、聚乙烯醇PVA)、粘多糖(透明质酸钠)。

3、pH调节剂：氢氧化钠、盐酸、缓冲溶液(巴氏缓冲液、吉斐氏缓冲液、沙氏冲液、硼酸缓冲液)。

4、渗透压调节剂：氯化钠。

5、纯化水：药用级水。

例1：

①主药：CTLA4可溶蛋白 5mg-500mg.

②透明质酸钠： 2mg

③氢氧化钠： 0.5mg

④氯化钠： 0.45mg

⑤纯化水： 947mg

例2：

①主药：CTLA4可溶蛋白 5mg-500mg.

②聚乙烯醇： 1.4mg

③巴氏缓冲液：硼酸0.58mg

硼砂0.15mg

④氯化钠： 0.35mg

⑤纯化水： 947.52mg

例3：

①主药：CTLA4可溶蛋白 5mg-500mg.

②甲基纤维素： 5mg

③沙氏缓冲液：磷酸二氢钠 0.93mg

磷酸氢二钠 0.24mg

④氢氧化钠： 0.27mg

⑤纯化水： 943.56mg

注明：

①巴氏缓冲液：含硼酸、硼砂。

②沙氏缓冲液：含磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。

③吉斐氏缓冲液：含硼酸、氯化钾、碳酸钠。

实施例2

CTLA4融合蛋白眼膏的配制：

1、主药：CTLA4可溶蛋白5mg-500mg

2、凝胶剂：卡波姆、泊洛沙姆、gellan树胶、邻苯二甲酸醋酸纤维素乳胶(CAP)、纤维素类、PAV类。

3、pH调节剂：氢氧化钠、盐酸、缓冲溶液。

4、纯化水：药用级水。

例1：

1、主药：CTLA4可溶蛋白 5mg-500mg

2、凝胶剂：卡波姆(Cb-940) 3mg

甲基纤维素(CM-20) 150mg

3、pH调节剂：18％w/v氢氧化钠适量

磷酸二氢钠 4.63mg

磷酸氢二钠 4.7mg

4、纯化水： 837.67mg

实施例3

共聚(乳酸/乙醇酸)(PLGA)(分子量11万)5份，用二氯甲烷20份溶解后加入CTLA4-Ig或CTLA4-FasL粉末5份，搅拌均匀后注入聚四氟乙烯模具，控制气流速度，使二氯甲烷挥发。待完全干燥后，将此含有CTLA4-Ig或CTLA4-FasL的共聚乳酸/乙醇酸药物释放系统从聚四氟乙烯模具上取下，在室温真空烘箱内保持8小时以完全除尽溶剂，得到厚度为2毫米、呈10纳米小孔结构的片状药剂，再用孔径为2毫米的冲模冲成厚为2毫米、直径为2这米的CTLA4-Ig或CTLA4-FasL制剂，将此制剂用环氧乙烷熏蒸24小时灭菌消毒、再放置一周后植入兔眼的前房。

实施例4

按实施例3的方法与步骤，但采用(按中国发明专利申请号99105984.0方法制备的)(乙醇酸/乳酸/乙内酯)三元共聚物(PGLC)(分子量8万)3份、二氯甲烷18份和CTLA4-Ig或CTLA4-Fasl9份、制孔剂24份制得各边长为10毫米的块状物，在清除制孔剂后得到直径为2毫米、孔结构为100微米的药棒，在室温真空烘箱内保持48小时以完全除尽溶剂后再裁成2毫米见方的CTLA4-Ig或CTLA4-Fasl制剂。将此制剂用环氧乙烷熏蒸24小时灭菌消毒、再放置一周后植入兔眼的前房。

实施例5

按实施例3的方法与步骤，但采用(按中国发明专利申请号ZL92113100.3方法制备的)聚乙内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)(分子量8万)制备，得到孔结构大小为10纳米的CTLA4-Ig或CTLA4-Fasl制剂。将此制剂用环氧乙烷熏蒸24小时灭菌消毒、再放置一周后植入兔眼的前房。

实施例6

按实施例3的方法与步骤，但采用(按中国发明专利申请号98102212X方法制备的)聚乙内酯/聚醚/取乳酸三元共聚物(PCEL)(分子量9万)制备，得到孔结构大小为50纳米的CTLA4-Ig或CTLA4-FasL制剂。将此制剂用环氧乙烷熏蒸24小时灭菌消毒、再放置一周后植入兔眼的前房。

实施例7

按实施例4的方法与步骤，但采用聚L-乳酸(PLLA)(分子量6万)(95％重量)与甲壳质(5％重量)的混合物制备，得到孔结构大小为15微米的CTLA4-Ig或CTLA4-FasL制剂。将此制剂用环氧乙烷熏蒸24小时灭菌消毒、再放置一周后植入兔眼的前房。

实施例8

按实施例8的方法与步骤，但采用聚LD-乳酸(PDLLA)(分子量6万)(95％重量)与胶原(5％重量)的混合物制备，得到孔结构大小为10微米的CTLA4-Ig或CTLA4-FasL制剂。将此制剂用环氧乙烷熏蒸24小时灭菌消毒、再放置一周后植入兔眼的前房。

实施例9

同实施例3的方法与步骤，CTLA4-Ig或CTLA4-FasL药片裁成厚为2毫米、宽为5毫米、长为30毫米的CTLA4-Ig或CTLA4-FasL制剂。将此制剂用环氧乙烷熏蒸24小时灭菌消毒、再放置一周后植入兔眼的肾后部。

通过对各实施例术后的肉眼观察和局部组织病理学检查表明：在应用了CTLA4融合蛋白眼用制剂后，结膜无充血；未发现角膜水肿；前房无炎症反应；虹膜、晶状体正常；眼压未升高。这说明CTLA4融合蛋白眼用制剂有良好的耐受性。此外，从局部组织病理学检查结果所表明的CTLA4融合蛋白缓释系统所在部位的虹膜、角膜无明显炎症细胞浸润、无组织变性及坏死表现，房角结构正常，证明CTLA4融合蛋白缓释系统的眼内生物相容性良好。

可通过常规试验测定由滴眼剂进入角膜中的CTLA4融合蛋白。

在实施例3-10中，CTLA4融合蛋白缓释制剂分别在植入后8周、14周、10周、1年、40周、1年、20周及10周完全消失，可以不用再手术取出。而且除实施例7、8和10外，其余实施例在制剂消失前都可在房水中维持一定的CTLA4融合蛋白浓度，实施例7、8维持的时间分别为30周和50周。实施例10中的肾组织无炎症反应、水肿、新生血管、萎缩或坏死的现象，且血压正常，证明CTLA4融合蛋白缓释制剂的体内相容性良好。在所有实施例的动物血液中均未检测到CTLA4融合蛋白的存在。

对照例1：

以聚氨酯为载体、完全按实施例5的制法、用量及步骤制备CTLA4融合蛋白释放体系。术后肉眼观察和局部组织病理学检查表明CTLA4融合蛋白释放体系有良好的生物相容性，植入后的15周内可维持CTLA4融合蛋白在房水为一定浓度，且在血液中检测不到CTLA4融合蛋白存在；到六个月时房水中也检测不到有CTLA4融合蛋白存在。但术后一年制剂仍存在于前房之中，并且外型、大小和强度无变化，因此必须再次手术取出。

对照例2：

大鼠高危角膜血管化模型的建立，在行角膜移植术同时前房分别植入CTLA4融合蛋白缓释系统和不含药的空白载体。术后100天，CTLA4融合蛋白缓释系统植入组无一发生排斥，而空白对照组100％发生排斥，平均排斥时间为10.6±1.90天。

对照例3：

大鼠高危角膜新生血管模型的建立，术前供体角膜片取下后分别在含有CTLA4融合蛋白和不含药的中期保存液中浸泡24小时，然后行角膜移植。CTLA4融合蛋白浸泡组在术后8周内角膜植片全部保持透明，而空白对照组在术后14天内角膜植片全部发生排斥。

对照例4：

大鼠角膜新生血管化模型的建立，在行角膜移植术后，分别用5％CTLA4融合蛋白的滴眼液滴眼，与不治疗组进行对照，5％CTLA4融合蛋白滴眼组术后10周，角膜植片保持透明，对照组术后14天全部发生免疫排斥反应。

Claims

1、一种用CTLA₄融合蛋白制备的眼用制剂，其特征在于：该眼用制剂是以缓释药物载体对CTLA₄融合蛋白进行包埋制成的、可植入眼内的长效CTLA₄眼用缓释药物制剂。

2、根据权利要求1所述用CTLA₄融合蛋白制备的眼用制剂，其特征在于：所述的长效CTLA₄眼用缓释药物制剂，其中的CTLA₄融合蛋白和药物载体，二者的重量比为1∶0.3-1。

3、根据权利要求1或2所述用CTLA₄融合蛋白制备的眼用制剂，其特征在于：所述的长效CTLA₄眼用缓释药物制剂中的缓释药物载体为合成生物降解型高分子材料，天然生物降解型高分子材料或合成生物降解型高分子材料同天然生物降解型高分子材料的共聚物。

4、根据权利要求3所述用CTLA₄融合蛋白制备的眼用制剂，其特征在于：所述的合成生物降解型高分子材料，其是聚羟基酸(PHA)。

5、根据权利要求3所述用CTLA₄融合蛋白制备的眼用制剂，其特征在于：所述的天然生物降解型高分子材料或合成生物降解型高分子材料同天然生物降解型高分子材料的共聚物，其是聚L-乳酸，聚DL-乳酸为L-乳酸/DL-乳酸的共聚物，聚乙醇酸为乳酸/乙醇酸的共聚物，聚乙内酯为乙醇酸/乳酸/己内脂的三元共聚物，聚己内酯/聚醚嵌段共聚物，或聚己内酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物。

6、根据权利要求1或2所述用CTLA₄融合蛋白制备的眼用制剂，其特征在于：所述的CTLA₄融合蛋白为：CTLA₄-Ig或CTLA₄-FasL。