CN117568421A - κ-卡拉胶酶MtKC16A的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种κ‑卡拉胶酶MtKC16A的新应用，属于功能酶技术领域，所述κ‑卡拉胶酶MtKC16A能够降解κ‑卡拉胶获得κ‑新卡拉胶四糖，或降解β/κ‑卡拉胶获得β/κ‑新卡拉胶六糖和κ‑新卡拉胶二糖，或者同时降解κ‑卡拉胶和β/κ‑卡拉胶获得κ‑新卡拉胶四糖、β/κ‑新卡拉胶六糖和κ‑新卡拉胶二糖。本发明还同时提供所述包含所述κ‑卡拉胶酶MtKC16A基因的重组表达载体和重组工程菌在降解κ‑卡拉胶和β/κ‑卡拉胶中的应用。本发明所述κ‑卡拉胶酶降解底物获得的产物具有高度单一性，且所述酶具有很好的耐热性能，可以作为一种耐热卡拉胶酶制剂。
Description
技术领域
本发明属于功能酶技术领域，具体涉及κ-卡拉胶酶MtKC16A的新应用。
背景技术
卡拉胶多糖是来源于红藻细胞壁的一种天然线性硫酸多糖。由D-半乳糖（D-Gal,G）和3,6-脱水-D-半乳糖（D-AHG, DA/D）组成的重复二糖单元组成，分别通过β-1,4-和α-1,3-糖苷键交替连接。卡拉胶多糖根据硫酸盐基团的数量和种类，通常可被分为kappa（κ）-、iota（ι）-和lambda（λ）-卡拉胶。κ-、ι-和-λ卡拉胶的二糖单元分别含有1、2和3个硫酸基团，三者的二糖单体结构分别为G4S-DA、G4S-DA2S和G2S-D2,6-2S。除此之外，自然界中还存在混合结构的卡拉胶多糖。例如β/κ-卡拉胶的多糖链中含有两种不同结构的二糖单体G4S-DA和G-DA。
卡拉胶多糖由于其生物难溶性和大分子性导致了它无明显生理活性，甚至一些文献将其喂养后的小鼠进行炎症小鼠造模。而低分子的卡拉胶寡糖则具备良好的生物可溶性且易被机体吸收利用，表现出良好的生理活性。包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等活性在食品和医药行业具有广泛的应用前景。因此开发卡拉胶寡糖的高效特异性制备技术是实现卡拉胶高值化利用的关键。
目前制备卡拉胶寡糖的方法有物理法、化学法和生物法等，其中最常见的是基于酸解的化学法和基于酶解的生物法。酸解具有反应迅速、处理底物浓度较大等优点，但是经酸解之后产物较杂，分离较为困难。酶解法相比于酸解法具有反应温和、产物单一、易于分离等优点。因此酶法是一种绿色的具有可持续应用前景的方法，挖掘卡拉胶酶用以制备卡拉胶寡糖具有重要意义。
κ-卡拉胶酶能够特异性水解κ-卡拉胶，产物为κ-新卡拉胶寡糖，属于糖苷水解酶16家族。由于κ-卡拉胶的凝胶特性，反应温度及温度稳定性为考量一个κ-卡拉胶酶能否高效水解κ-卡拉胶制备寡糖的关键指标，较低的反应温度将导致κ-卡拉胶降解时的低利用率，同时影响了寡糖产出所需时间，这些问题严重限制了卡拉胶寡糖在食品、药品等领域的开发利用，急需进行改善。因此，挖掘耐热性κ-卡拉胶酶并开发其应用具有重大意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了κ-卡拉胶酶MtKC16A的新应用，所述酶可以同时降解κ-和β/κ-卡拉胶，且具有耐热性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
κ-卡拉胶酶MtKC16A在降解κ-卡拉胶生产κ-新卡拉胶四糖中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
κ-卡拉胶酶MtKC16A在降解β/κ-卡拉胶生产β/κ-新卡拉胶四糖和κ-新卡拉胶二糖中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
κ-卡拉胶酶MtKC16A在同时降解κ-卡拉胶和β/κ-卡拉胶中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，降解产物为κ-新卡拉胶四糖、β/κ-新卡拉胶四糖和κ-新卡拉胶二糖。
κ-卡拉胶酶MtKC16A在制备耐热卡拉胶酶制剂中的应用，所述耐热是指80℃为最佳酶活温度，在100 ℃的仍然具有50%以上卡拉胶酶活性。
κ-卡拉胶酶MtKC16A的氨基酸序列（SEQ ID NO:1）：
MKTTHTLAVLLLASCTAVQAQDIRPLGAVEGEMRWKELGNRTDDFEGNSLNTAKWINAPSDLVIGAWTFDENNTYVRDGKLNIIATQETHTRPFRDSCQGGATVQRELYYKSGAVKSAADGVYGYYEARIKGVKIFPGLSPAFWLYSDGHPYPDRNVPGSVDYSEIDVVELQQADWYGPGPDDADPVNVMDHNLHARIVGEDGKTYWRRPKPYPEAQLLKFEAPFDPSKDFHTYAVENRKDVIRWYVDGELIGEKPNLFWHRPMHVIFSMGLRRQLIKYNDACNRADPNPDTVTAEGFPEDATMQVEYVKTWEVLPSIWVDNKNKYLTTDYETGGKLEVVVNYHGGSNHHVVGDKYNGITVNLVEKNTDGFVRIVASANDASVTSEEKRYGGQTTLRLDLSGVTPADQLPQGHYYALAPVFRSSNGSDIFQMGELQPIKVVDRQSPGPVAVTGVSVSADTTELQVGETTRLEATVFPANADNPDVSWHSNNMQVATVDQQGQVQGKSVGNVKITVTTEDGRHKASTKLSVVSSSGDGESCTGGWVPVSGVHVTPDSGELSVGQSIRITPTVTPACASNKRVVFSSSNPSVAIVNADGVVSAKRAGSAEITVKTKNKGKTATYSLTVTP。
编码上述κ-卡拉胶酶MtKC16A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
编码卡拉酶κ-卡拉胶酶MtKC16A的基因核苷酸序列（方向5’-3’）（SEQ ID NO:2）：
atgaaaacgacgcatacactggcggtcctgctgctcgccagctgcaccgccgtacaagcccaagacatacggccactgggtgccgttgaaggtgaaatgcgctggaaggagctcggtaaccgtaccgatgacttcgaaggcaatagccttaacaccgcaaaatggatcaatgccccaagtgacttggtgatcggcgcctggacattcgacgaaaacaacacctatgtgcgggatggaaaactcaatatcatcgcaacccaggaaacccatacccggccatttcgcgacagctgccagggcggcgcgacggtacaacgcgagctctactataaatctggggcagtaaagtcggcggccgacggtgtttacggctattacgaagcgcgaatcaaaggcgtaaaaatctttcccggcctgagccccgctttctggttatacagcgacggccacccctatcccgatcgcaatgttcccggcagcgtggattacagcgaaattgatgtggtcgagctgcagcaggccgactggtatggccccggcccagacgatgcggaccctgtcaatgttatggatcacaacctacacgcccgtattgtcggcgaggacggcaaaacctactggcggcgcccgaagccctacccggaagcccagctgctcaaattcgaggcaccttttgatccgtcgaaggacttccacacctacgcggtagaaaaccgcaaggatgtcattcgctggtatgtagacggcgaactcattggagaaaaacccaatctgttctggcaccgtcccatgcacgtcatcttttcgatgggccttcgccgccaactcatcaaatacaacgatgcgtgcaatcgcgcagaccccaatccggacacagtaactgcggagggcttcccagaagacgccaccatgcaggtggaatacgtgaagacctgggaagtattgccctctatctgggtcgataacaaaaacaaatacctgaccactgactatgaaaccggtggcaaactcgaagtcgtggtcaactaccacggcggcagtaatcaccatgtagttggcgataaatacaacggcatcaccgtgaatcttgtggaaaaaaatacagatggcttcgtaagaattgttgccagcgccaacgatgcatcggtaaccagtgaagaaaagcggtacggtggacaaacgacacttcgcctggatctcagtggcgttacccccgctgaccaattgccccaggggcattactacgcccttgcaccggtattccgctcttccaacggcagcgacatttttcaaatgggggaacttcagcccatcaaggtggttgaccgccaaagccccgggcccgtggcagtcaccggggtatcggtctcagccgataccactgagctgcaagttggtgaaacaacccgcctggaagccacggttttcccggcaaatgcggacaaccccgatgtcagctggcactcgaataacatgcaggttgccactgttgaccagcagggacaggtgcagggcaaatctgtcggcaatgtaaaaatcacggttacaacagaagatggtagacacaaagcctcgaccaaactatcagtggtatcctccagcggcgatggggaaagctgcacagggggctgggtgcccgtcagcggtgtgcatgtcacaccggacagcggcgagctttctgtggggcaaagcataaggatcacacccacagtcacaccggcatgcgccagtaacaagcgcgtcgtgtttagcagcagcaatccatccgtggctatcgtgaatgccgacggcgttgtcagcgcaaaacgcgcaggatcggcagagattaccgtgaagacaaaaaataaaggaaaaacagcgacttattcacttaccgtaaccccgtaa。
进一步地，κ-卡拉胶酶MtKC16A的酶解条件为：底物浓度为5～10 g/L，加酶量为1～10 U/mL（1 U代表1分钟内释放1 μmol还原糖所需的酶量），优选为4 U/mL，酶解温度为50～100 ℃，优选80 ℃，pH值为3.0～10.0，优选7.0，酶解时间为10分钟以上，优选30分钟～1440分钟。尤其是，在100 ℃条件下可持续降解1小时。
一种重组表达载体在降解κ-卡拉胶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，所述重组表达载体携带有编码κ-卡拉胶酶MtKC16A的基因。
一种重组工程菌在降解κ-卡拉胶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，所述重组工程菌携带有编码κ-卡拉胶酶MtKC16A的基因，能表达κ-卡拉胶酶MtKC16A。
本发明与现有技术相比的有益效果：通过实验研究发现，耐热性κ-卡拉胶酶MtKC16A并不是只对κ-卡拉胶具有水解能力，而是对κ-和β/κ-卡拉胶都有高的降解活性，且产物具有高度单一性。这说明κ-卡拉胶酶MtKC16A的双功能水解活性，可以同时特异性制备两种结构不同的卡拉胶寡糖，为研究卡拉胶寡糖的构效关系提供了有力工具，有着广阔的应用前景。另外，该酶的最适温度达80 ℃，在100 ℃仍显示出70%的相对酶活，具有优异的耐热性，即可在高温条件下用于水解κ-卡拉胶和β/κ-卡拉胶或制备κ-新卡拉胶四糖、β/κ-新卡拉胶四糖和κ-新卡拉胶二糖，又可耐受高温存储。
附图说明
图1：本发明的κ-卡拉胶酶MtKC16A纯化的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker，CE道为粗酶，PE道为纯酶；
图2：温度变化对κ-卡拉胶酶水解酶活的影响图；
图3：pH变化对κ-卡拉胶酶水解酶活的影响图；
图4：100 ℃孵育κ-卡拉胶酶相对酶活的变化图；
图5：本发明的κ-卡拉胶酶水解κ-和β/κ-卡拉胶的相对酶活图；
图6：本发明的κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶0小时和1小时的OD540（还原糖）变化对比图；
图7：本发明的κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶产物的HPLC图；
图8：本发明的κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶产物的质谱图；
图9：本发明的κ-卡拉胶酶水解β/κ-卡拉胶产物的HPLC图；
图10：本发明的κ-卡拉胶酶水解β/κ-卡拉胶产物经D-AHG糖苷酶水解后的HPLC图；
图11：本发明的κ-卡拉胶酶水解β/κ-卡拉胶产物经D-AHG糖苷酶水解后的MS图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
下面通过具体实例对本发明的方法做进一步的说明。
实施例1 κ-卡拉胶酶基因MtKC16A的克隆
本申请的发明人从NCBI数据库中挖掘得到海洋细菌Microbulbiferthermotolerans来源的κ-卡拉胶酶片段（WP_067154085.1），根据进化树和多序列比较分析，发现该基因片段所表达的κ-卡拉胶酶属于糖苷水解酶16家族的17亚家族分支。目前无该κ-卡拉胶酶水解活性的相关验证和报道，需要进一步的实验探究证实。该基因包含有1887个碱基，序列见SEQ ID NO.2，编码的蛋白具有628个氨基酸，序列见SEQ ID NO.1。发明人根据宿主大肠杆菌的密码子偏好性对该基因片段的DNA序列进行了密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.3（不含N端60 bp的信号肽编码序列）所示。
人工合成的κ-卡拉胶酶MtKC16A编码基因的核苷酸序列如下所示（方向5’-3’）（如SEQ ID NO.3所示）：
caagatataaggcccctaggagctgtagaaggcgagatgcgttggaaagaactcggtaaccgtactgatgacttcgagggcaacagcttgaacaccgcgaaatggattaacgcgccaagcgacctggtgatcggtgcttggacctttgatgaaaacaatacgtacgtccgcgatggcaagctgaatattattgcgacgcaggagacccacaccagaccgttcagagatagctgccagggaggggccaccgtgcaacgtgagctgtactacaaaagcggcgcggtgaagagcgcggcagacggggtctatggttattacgaggctcgtataaagggtgtgaaaattttcccgggtctgagcccggcgttttggctgtattccgacggtcacccgtacccggaccgcaacgtgccgggtagtgttgattattctgagatcgatgtggttgagttacaacaggcagactggtatggcccaggtccggacgatgcggacccggtcaacgttatggatcacaatctgcatgcacgcatcgttggcgaggacggtaagacctactggcgtcgtccgaaaccgtacccggaggcgcagctgctgaaattcgaagctccgttcgatccgtctaaagacttccatacctacgccgttgagaaccgtaaagacgtaatccgttggtatgtggacggcgaattgattggtgaaaagccgaatttgttttggcaccgtcccatgcacgtgatcttcagcatgggcctgcgtcgtcagctgattaagtacaacgacgcctgcaatcgcgcagacccgaatccggatactgtcaccgctgagggttttccggaggatgcgaccatgcaggtagagtatgtgaagacctgggaggtgctgccgtcgatctgggtggacaataagaacaagtacctgaccaccgactatgaaaccggtggcaagcttgaagttgttgtgaattaccacggtggatctaaccatcatgtcgtgggcgataagtacaatggtatcacggtcaacttggttgagaagaacaccgacggcttcgtgcgtattgtggcctccgcgaacgatgcgtcggtcaccagcgaagaaaaacgctatggcggtcaaaccaccctgcgcctggacctctccggtgttactccagccgatcagctgccgcagggccactattacgcactcgcaccggtgtttcgtagctcgaacggcagcgacatcttccagatgggcgaactgcaacctattaaagttgtggatcgtcagtcgccgggtccggtggccgttacaggtgtcagcgttagcgctgacacgaccgaattgcaagttggcgaaaccacgcgcttggaagcgactgtttttccggctaatgctgataacccggacgtgtcatggcacagcaataacatgcaggttgccaccgtagatcaacaaggacaagtgcagggcaagagtgtgggtaatgttaagatcacggttaccaccgaagatggccgtcataaagcaagtactaaattgtccgttgtctctagctccggcgacggcgagtcatgtaccggtggttgggttccggttagcggtgttcatgttaccccggacagcggtgagttatctgtgggtcaaagcatccgtattaccccgaccgtgaccccagcgtgcgcaagcaacaaacgcgttgtttttagctcgtccaacccgagcgtcgcgatcgtgaacgctgatggcgtggtctccgcgaaacgcgcgggttccgcggaaatcacggtcaaaaccaagaacaagggcaagacagcgacgtacagcctgaccgtcacgccataa。
人工合成SEQ ID NO.3所示的基因片段。以人工合成的基因片段为模板，进行PCR扩增。PCR所用的特异性引物如下所示：
正向引物：5’- CAAGATATAAGGCCCCTAG -3’，如SEQ ID NO.4所示，
反向引物：5’- TGGCGTGACGGTCAGGC -3’，如SEQ ID NO.5所示。
实施例2 携带κ-卡拉胶酶基因MtKC16A表达载体的构建
将实施例1扩增得到目的片段，与线性化的pET24a（+）载体采用无缝拼接试剂盒在50 ℃反应5分钟后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体抗性平板上。37 ℃培养箱过夜培养后挑取单克隆进行阳性克隆验证，将条带大小正确的单克隆送至测序公司测序待测序比对完全正确，得到重组质粒，命名为pET-MtKC16A，保存在-20 ℃冰箱备用。
实施例3 含κ-卡拉胶酶基因的工程菌构建
将实施例2中得到的携带卡拉胶酶基因的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，采用42 ℃热激转化法进行转化，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体抗性平板上。37 ℃培养箱过夜培养后挑取单克隆进行阳性克隆验证，将条带大小正确的单克隆于液体LB培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）中培养过夜。保藏菌液于10%甘油中，于-80 ℃长期保存备用。
实施例4 κ-卡拉胶酶MtKC16A的制备和纯化
将实施例3中保存的菌液于LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中37 ℃过夜培养活化后转接至100 mL LB三角瓶（含50 μg/mL卡那霉素）中37 ℃，200 rpm培养至OD600约为0.6左右加入终浓度为0.1 mM的IPTG，转至18 ℃培养16小时，表达κ-卡拉胶酶。
待发酵结束后，8000 rpm离心5分钟收集菌体，加入一定量的无菌水洗涤菌体，再次8000 rpm离心5分钟收集菌体。pH 8.0的Tris-HCl缓冲液复溶菌体后于冰浴条件下超声破碎（320 W，开3秒，停3秒持续破碎30分钟），破碎完全后8000 rpm，4 ℃条件下离心15分钟收集上清即为粗酶。所表达的目的基因含有His纯化标签，因此我们采用Ni-NTA亲和层析进行纯化。采用不同浓度梯度（10、20、50、80、120、200和500 mM）咪唑进行目的蛋白的洗脱，连接Akta纯化仪进行纯化，SDS-PAGE结果显示80 mM咪唑可以得到较为单一的目的蛋白条带（图1），结果显示所得蛋白分子量大小约为71 kDa，符合预测结果。纯化后酶液蛋白浓度经R250考马斯亮蓝法测定为0.31 g/L。用50 kDa超滤管置换浓缩，采用超纯水为置换溶剂，将酶液浓缩至蛋白浓度为1 g/L，得到纯酶，用于酶学特性的测定。
实施例5 测定κ-卡拉胶酶MtKC16A的最适反应条件
将实施例4中得到的MtKC16A纯酶在不同温度（30、40、50、60、65、70、80、90和100℃）条件下测定温度对其水解酶活的影响，反应底物为3 g/L κ-卡拉胶，pH值为7.0反应20分钟后于4 ℃终止反应。反应释放的还原糖采用DNS法进行测定，即反应液200 μL终止反应后加入300 μL DNS后煮沸5分钟显色，冷却至室温后取200 μL于540 nm处测定吸光值，根据标准曲线（此处以D-半乳糖为标准物质绘制标准曲线）计算还原糖的产生量。根据测定结果，可知MtKC16A在80 ℃温度条件下显示出最大的水解活力（图2）。进一步在pH 3～10条件下测定MtKC16A的最适pH，如图3所示其最适反应pH为7.0。
实施例6 测定κ-卡拉胶酶MtKC16A的比酶活
酶活测定方法为：反应体系为200 μL，包含pH 7.0, 50 mM Tris-HCl缓冲液、3 g/L κ-卡拉胶、1.5 mg纯酶（实施例4制备），在80 ℃条件下反应10分钟后于4 ℃终止反应，反应释放的还原糖采用DNS法（见实施例5）进行测定。
酶活定义为：在最适反应条件下，1分钟转化生成1 μmol还原糖所需酶量。
经测定，MtKC16A水解κ-卡拉胶的比酶活为3.15 U/mg。
实施例7 κ-卡拉胶酶MtKC16A水解κ-和β/κ-卡拉胶相对酶活的比较
以κ-和β/κ-卡拉胶为底物测定MtKC16A的相对酶活，反应体系为200 μL，包含pH7.0，50 mM Tris-HCl缓冲液、3 g/L κ-或β/κ-卡拉胶、1.5 mg纯酶（实施例4制备），在80 ℃条件下反应20分钟后于4 ℃终止反应，反应释放的还原糖采用DNS法（见实施例5）进行测定。绘制相对酶活柱状图，如图5所示，其对κ-卡拉胶酶和β/κ-卡拉胶的水解酶活相当，说明了其同时应用两种卡拉胶生物加工的潜力。
实施例8 κ-卡拉胶酶MtKC16A在100 ℃的热稳定性测试
将实施例4中得到的MtKC16A纯酶在100 ℃条件下分别孵育10、20、30、40和60分钟后测定其剩余酶活。如图4所示，结果表明孵育60分钟后仍保持由50%左右的相对酶活，具有显著的耐热性。
一般的蛋白酶在煮沸10分钟后就会失活，因此常用煮沸10分钟来终止酶反应。来源于Colwellia echini的κ-卡拉胶酶CeCgkA在35 ℃孵育30分钟后会失去70%左右的酶活。来源于Zobellia sp. ZL-4的κ-卡拉胶酶κ-ZL-4在50 ℃孵育1小时后即会几乎完全失活。
实施例9 测定MtKC16A水解κ-卡拉胶的水解产物
将实施例4中得到的MtKC16A纯酶与3 g/L的κ-卡拉胶在80 ℃，pH 7.0条件下反应1小时、2小时、4小时、12小时后采用HPLC测定其水解产物。如图6所示，反应1小时后其还原糖浓度相比于0小时明显上升，指示多糖开始水解，寡糖开始生成。如图7所示，其主要水解产物为κ-新卡拉胶四糖，并对反应12小时后的水解产物进行MS检测，结果见图8，由于少量蛋白及反应缓冲液的存在造成其它杂峰较为明显，但主产物仍为κ-新卡拉胶四糖。
实施例10 测定MtKC16A水解β/κ-卡拉胶的水解产物
将实施例4中得到的MtKC16A纯酶与3 g/L的β/κ-卡拉胶在80 ℃，pH 7.0条件下反应12小时后采用HPLC测定其水解产物。如图9所示，与标准品对照，可知其主要产物为脱硫κ-新卡拉胶四糖和κ-新卡拉胶二糖。为了进一步判断脱硫κ-新卡拉胶四糖的具体结构，借助一个D-AHG糖苷酶ZuGH129A（GenBank: WP_076457038.1、氨基酸序列见SEQ ID NO.6）去水解MtKC16A的β/κ-卡拉胶降解产物，在35 ℃，pH 8.0条件下反应1小时后采用HPLC测定产物组成。如图10所示，与原始底物相比，产物出峰时间后移，那说明ZuGH129A能够作用该底物切下其非还原端的D-AHG单元，并生成κ-卡拉胶三糖，由此说明该脱硫κ-新卡拉胶四糖的非还原端不含硫酸基团，为新β-卡拉胶二糖单元。又结合MS检测结果（图11），可知该κ-卡拉胶三糖为脱去一个硫酸基团的β/κ-卡拉胶三糖，结构组成为G-DA-G4S。由此可确定MtKC16A水解β/κ-卡拉胶生成的脱硫κ-新卡拉胶四糖为β/κ-新卡拉胶四糖，结构组成为DA-G-DA-G4S。
D-AHG糖苷酶ZuGH129A，其氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO:6所示。
D-AHG糖苷酶ZuGH129A的氨基酸序列（SEQ ID NO:6）：
MKNNSTLAKNTLVLLVITCLTAFKGLAFDSVSPDPIVLENEKLNISVDSKTGCFSVTEKISGHLWKSDPWDHAAGLLTLSDPKGKKQTVNISKSKKIEVSKTGKNTVSLKFIDPVFADGSVAKGVSIATELRLDPNNTQLDVEVMEHRSGNFTLFDLRYPARAFSLKTDEDKGAAVIPQKQGVICPSYIFPMNGGRFCKWDDATYNNKSQGSLELFNNGTGLTMPWWGTYNEKSAVIGIVDVSARPHMQYNINNNGQYLFNAKGVMSPYQRIVFLDPIWKLDQEKGKMRMSYHFIPGGDYVDMAKVYQKEAKARGHFVSLQEKLKRNPNVNKLPGAIYFGIYGGYPHYVNMPGMAFTFDELKNIIKTIHDDLKVDKAFVHAWGTFSNFVPHNYPISEALGGPEKLKAAVDLAKSYGYLYSSYHAYSPMLENDPNFTTDLMQRDAEGKLMNTGSRWARVDPKFQKGLAQKNIEKEISYLGLEADITDITFAAYRENGKEGRIELAKYIDSFNLVNGTEHGQEQWIPYFDMFEGMTYLEDRPLSVISHPAPLFNLVYHEAIANFGKIQDPDNEVTANGDFRIKALRSMLFGRGTTIFFSPYEFEGMRPMIEMARDLVAPVHKETFFSELQSHEYLSADYKVQRSRFSSGTEVIANLGPVAQKIEGGITIPGYGYRIKMKDGSLKTGHFQVSLHMDE。
实施例11 重组MtKC16A酶同时降解κ-和β/κ-卡拉胶
将实施例4中得到的重组MtKC16A纯酶与κ-和β/κ-卡拉胶（浓度均为1.5 g/L）在80℃，pH 7.0条件下反应12小时后，煮沸离心后透析除盐，冻干成粉末即为含有κ-新卡拉胶四糖、β/κ-新卡拉胶四糖和κ-新卡拉胶二糖的粗寡糖。
Claims (8)
1.κ-卡拉胶酶MtKC16A在降解κ-卡拉胶生产κ-新卡拉胶四糖中的应用，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶MtKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.κ-卡拉胶酶MtKC16A在降解β/κ-卡拉胶生产β/κ-新卡拉胶四糖和κ-新卡拉胶二糖中的应用，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶MtKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.κ-卡拉胶酶MtKC16A在同时降解κ-卡拉胶和β/κ-卡拉胶中的应用，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶MtKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，降解产物为κ-新卡拉胶四糖、β/κ-新卡拉胶四糖和κ-新卡拉胶二糖。
4.权利要求1-3任何一项所述的应用，其特征在于，κ-卡拉胶酶MtKC16A的酶解条件为：底物浓度为5～10 g/L，加酶量为1～10 U/mL，酶解温度为50～100 ℃，pH值为3.0～10.0，酶解时间为10分钟以上。
5.权利要求1-3任何一项所述的应用，其特征在于，κ-卡拉胶酶MtKC16A的酶解条件为：底物浓度为5～10 g/L，加酶量为4 U/mL，酶解温度为80 ℃，pH值为7.0，酶解时间为30分钟～1440分钟。
6.一种重组表达载体在降解κ-卡拉胶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，其特征在于，重组表达载体携带有编码权利要求1所述的κ-卡拉胶酶MtKC16A的基因。
7.一种重组工程菌在降解κ-卡拉胶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，其特征在于，重组工程菌携带有编码权利要求1所述的κ-卡拉胶酶MtKC16A的基因，重组工程菌能表达κ-卡拉胶酶MtKC16A。
8.κ-卡拉胶酶MtKC16A在制备耐热卡拉胶酶制剂中的应用，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶MtKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述耐热是指80℃为最佳酶活温度，在100℃的仍然具有50%以上卡拉胶酶活性。
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| CN202410063331.3A Active CN117568421B (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | κ-卡拉胶酶MtKC16A的应用 |
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| US20190010475A1 (en) * | 2015-12-23 | 2019-01-10 | Korea University Research And Business Foundation | Enzyme complex comprising beta-agarase, kappa-carrageenase and anhydro-galactosidase, and use thereof |
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-
2024
- 2024-01-17 CN CN202410063331.3A patent/CN117568421B/zh active Active
Patent Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| US20190010475A1 (en) * | 2015-12-23 | 2019-01-10 | Korea University Research And Business Foundation | Enzyme complex comprising beta-agarase, kappa-carrageenase and anhydro-galactosidase, and use thereof |
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| Title |
|---|
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| KELLY, G 等: ""WP_067154085.1 Ig-like domain-containing protein [Microbulbifer thermotolerans]"", 《GENPEPT》, 9 January 2024 (2024-01-09), pages 1 - 2 * |
| 郭子龙 等: ""卡拉胶酶的来源、性质、结构与应用研究进展"", 《生物加工过程》, vol. 20, no. 5, 30 September 2022 (2022-09-30), pages 476 - 489 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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